探究復(fù)配藍(lán)莓提取物葉黃素制劑的急性及長期毒性

王玉瑩，甘 露，王榮昌

（江蘇天美健大自然生物工程有限公司，江蘇 南京 210046）

藍(lán)莓又名篤斯越橘（Vaccnium uliginosum），屬杜鵑花科（Ericaceae）、越橘屬（Vaccinium）植物，其果實中含有花青素及黃酮等多種活性成分[1]?；ㄇ嗨赜址Q花色素，多以糖苷的形式存在，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物[2]。研究表明，藍(lán)莓花青素具有多種保健功能，在動物體內(nèi)、體外實驗顯示具有抗腫瘤作用，它的抗氧化作用高于等濃度的抗壞血酸，在治療和預(yù)防眼病如緩解視疲勞、白內(nèi)障、青光眼和視網(wǎng)膜病變等方面顯示了很好的應(yīng)用前景[3-7]。通常使用傳統(tǒng)的溶劑萃取法提取花青素，這是因為花青素主要以花青素糖苷的形式存在于大自然中，且具有較強的極性[8-9]。提取時，通常使用親水性有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇等，以及親脂性有機(jī)溶劑，如石油醚、乙酸乙酯等。不同的提取方法會造成一定的溶劑殘留，以致會影響到產(chǎn)品的安全性，它們作為保健食品的生產(chǎn)原料，需對產(chǎn)品進(jìn)行安全性評價。本文以從藍(lán)莓鮮果提取物的花青素為原料，配伍葉黃素制備成藍(lán)莓提取物葉黃素制劑，通過急性毒性試驗和30 d 喂養(yǎng)試驗來評價復(fù)配藍(lán)莓提取物葉黃素制劑的安全性，旨在為藍(lán)莓提取物類保健食品的開發(fā)利用提供安全性實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

試樣由某生物工程有限公司提供，規(guī)格0.5 g/粒，服用量2 粒/日，花青素及葉黃素含量分別為3%、1.2%。該產(chǎn)品的人體推薦量為16.67 mg·（kg bw·d）-1（人以60 kg 計）。

1.2 主要儀器設(shè)備

TD12001 型電子天平：余姚市金諾天平儀器有限公司。

1.3 試驗方法

本實驗采用《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003 版）中小鼠急性經(jīng)口毒性實驗中的最大劑量耐受法，設(shè)試樣20 g·（kg bw）-1一個劑量組。共20 只動物，雌性10 只、雄性10 只，經(jīng)口灌胃給樣，取濃度為0.5 g·mL-1的試樣液兩次給予試樣，兩次給樣間隔5 h，給樣劑量相當(dāng)于20 g·（kg bw）-1。給試樣14 d 之后，觀察動物的基本狀況、體重變化、死亡情況和中毒癥狀。

參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）進(jìn)行大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗。實驗選取80 只SD 大鼠，按性別、體重隨機(jī)分4 組（每組20 只，雌、雄各半），即低劑量組0.42 g·（kg bw）-1、中劑量組 0.83 g·（kg bw）-1和高劑量組1.67 g·（kg bw）-1和一個空白對照組（大豆油）。低、中、高3 個劑量組的劑量分別相當(dāng)于人體推薦量16.67 mg·（kg bw·d）-1（人以60 kg 計）的25 倍、50 倍和100 倍。采用灌胃給予受試物，按5 mL·（kg bw）-1經(jīng)口灌胃給予低、中、高劑量組各濃度試樣和大豆油，連續(xù)灌胃30 d。實驗過程中，大鼠均單籠飼養(yǎng)，飲水、進(jìn)食自由。每周記錄進(jìn)食量、體重，計算食物利用率，末次給試樣后禁食16 h 后稱空腹體重，對每只大鼠腹主動脈取血并進(jìn)行血液學(xué)和血液生化指標(biāo)檢查，之后對每只大鼠進(jìn)行臟器解剖觀察，同時取肝臟、腎臟、脾臟和卵巢（睪丸）稱重并計算臟體比；取肝臟、腎臟、脾臟和卵巢（睪丸）等組織，經(jīng)固定、石蠟切片、H-E 染色和光鏡觀察等進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

試驗數(shù)據(jù)以平均值（x）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，即x±s。方差分析與統(tǒng)計學(xué)檢驗采用孫瑞元等編輯的DAS 統(tǒng)計軟件中的多組均數(shù)分析方法，即先對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，如果方差齊，就采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異后再用Dunnett法進(jìn)行多個劑量組與一個對照組均數(shù)進(jìn)行兩兩比較；如果方差不齊，則改用秩和檢驗統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠、小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗

給予試樣后，14 d 內(nèi)未見試驗大鼠、小鼠出現(xiàn)死亡情況和中毒癥狀，體重均增加，該試樣雌、雄性大鼠、小鼠經(jīng)口毒性最大耐受量均大于 20 g·（kg bw）-1（表1）。表明藍(lán)莓提取物葉黃素制劑試樣為無毒。

表1 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠、小鼠急性經(jīng)口毒性的試驗結(jié)果（x±s）

2.2 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠體重的影響

由圖1 可知，試驗期間，隨時間的增加，雌、雄大鼠的體重逐漸增加，試樣的低、中、高劑量組中大鼠體重和對照組相比，p＞0.05，即差異均無顯著性意義。試驗結(jié)果表明，藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠體重?zé)o明顯影響。

圖1 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠體重的影響 （x±s，n=10）

2.3 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠進(jìn)食量、食物利用率的影響

由圖2 可知，給予雌性、雄性大鼠30 d 不同劑量受試物，雌性、雄性大鼠的體重和攝食量呈正相關(guān)，和食物利用率呈負(fù)相關(guān)。試驗動物高、中、低劑量組的不同性別大鼠體重、體重增加、進(jìn)食量和食物利用率與對照組相比，p＞0.05，均無統(tǒng)計學(xué)差異。各時間點的高、中、低劑量組大鼠周進(jìn)食量、體重增加和總進(jìn)食量及總食物利用率、周食物利用率和對照組比，p＞0.05，差異均無顯著性意義。試驗結(jié)果表明，藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠周進(jìn)食量、總食物利用率、周食物利用率均無顯著影響。

圖2 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠周進(jìn)食量、體重增加和總進(jìn)食量及食物利用率的影響（x±s，n=10）

2.4 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠血常規(guī)各項指標(biāo)的影響

大鼠喂養(yǎng)試驗30 d 后的血液指標(biāo)結(jié)果顯示，高、中、低劑量組雌、雄大鼠的血常規(guī)各項指標(biāo)，即白細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，與對照組相比，p＞0.05，差異均無顯著性意義（圖3）。試驗結(jié)果說明，藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠血常規(guī)各項指標(biāo)無明顯影響。

圖3 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠血常規(guī)各項指標(biāo)的影響圖（x±s）

2.5 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

藍(lán)莓提取物葉黃素制劑高、中、低3 個劑量組的雌性、雄性大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、血糖、總蛋白、白蛋白、球蛋白和白/球等11 項指標(biāo)與對照組比較，p＞0.05，差異均無顯著性意義（圖4）。試驗結(jié)果表明，藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠血液生化指標(biāo)無明顯影響。

圖4 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠血生化的影響

2.6 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠臟器重量和臟體比的影響

藍(lán)莓提取物葉黃素制劑高、中、低3 個劑量組大鼠肝臟、脾臟、腎臟、性腺（睪丸/卵巢）的臟器重量和臟體比，與對照組相比，p＞0.05，差異均無顯著性意義。雌性大鼠中劑量組卵巢重較對照組低（p＜0.05），但未超出實驗室歷史對照范圍，也無劑量依賴性，故無生物學(xué)意義（圖5）。試驗結(jié)果表明，藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠臟器重量和臟體比也不產(chǎn)生明顯影響。

圖5 藍(lán)莓提取物葉黃素制劑對大鼠臟器重量和臟體比的影響（x±s）

2.7 大鼠病理組織學(xué)檢查

通過鏡下病理組織檢查發(fā)現(xiàn)，高劑量組和對照組大鼠肝臟、腎臟、脾臟和胃腸組織學(xué)結(jié)構(gòu)均正常，均未出現(xiàn)增生、脫落、肥大、壞死、萎縮、出血或水腫等現(xiàn)象。高劑量組和對照組大鼠的卵巢、睪丸組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常，可見正常發(fā)育的卵泡、生精細(xì)胞，間質(zhì)未見異常。在中、低劑量組的以上幾種組織的組織病理學(xué)鏡下觀察中也均未見異常 現(xiàn)象。

3 結(jié)論

藍(lán)莓提取物葉黃素制劑的急性毒性試驗中，雌雄兩性大、小鼠經(jīng)口最大耐受量均大于 20 g·（kg bw）-1，根據(jù)急性毒性（LD50）劑量分級標(biāo) 準(zhǔn)，藍(lán)莓提取物葉黃素制劑屬無毒級；在大鼠30 d喂養(yǎng)試驗中，藍(lán)莓提取物葉黃素制劑的低、中、高3 個劑量組中的大鼠體重、進(jìn)食量和食物利用率、大鼠血細(xì)胞和血液生化指標(biāo)、大鼠臟器重和臟體比及組織病理學(xué)檢查的各項參數(shù)與對照組的這些參數(shù)相比無異常，未見有毒性反應(yīng)。藍(lán)莓提取物葉黃素制劑的急性毒性試驗及30 d 喂養(yǎng)試驗結(jié)果表明，藍(lán)莓提取物葉黃素制劑作為保健食品，其食用性是無毒和安全的。