枇杷園中釀酒酵母的篩選、分離及鑒定

朱安妮，康 琳，白菊紅，謝印成，李麗娟

（成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川 成都 611130）

枇杷（Loquat）在我國已有2 000多年的種植歷史，我國作為枇杷最大生產(chǎn)國，種植面積約17 萬hm2，年產(chǎn)量約為100 萬t。枇杷作為藥食同源的水果，口感較好，具有潤肺、養(yǎng)肺、祛痰作用，以此為原料開發(fā)的枇杷酒具有高附加值。枇杷酒的生產(chǎn)菌種主要為釀酒酵母，但現(xiàn)有文獻表明，市售釀酒酵母對于枇杷酸度利用率低，存在發(fā)酵力不足等問題。因此，從枇杷中分離篩選出起酵快、發(fā)酵強、風味佳的專用釀酒酵母是非常有必要的。本研究利用微生物分離鑒定法，從枇杷原料及枇杷果園土壤中篩選功能性好、質(zhì)量高的釀酒酵母，進行菌種發(fā)酵力測定，最終篩選出1 ～2 株最佳釀酒酵母用于后續(xù)產(chǎn)品加工。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷、枇杷葉、土壤，均采集于成都簡陽武廟鎮(zhèn)團堡村枇杷種植基地。

YPD 培養(yǎng)基、TTC 培養(yǎng)基等生化試劑，杭州微生物試劑有限公司；瓊脂粉，青島海博；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SWCJ1F 潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；MVS-83 立式壓力蒸汽滅菌鍋，松下冷鏈（大連）有限公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；SPH-200D 超凡型小容量恒溫培養(yǎng)搖床，上海世平實驗設備有限公司；PHS-25 pH 計，上海雷磁有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 釀酒酵母的分離、純化

對章之柱等[1]的方法進行改良，稱取一定量的樣品（枇杷、枇杷葉、土壤）于無菌試劑瓶中，稀釋成不同質(zhì)量濃度的懸浮液，涂布在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose，YPD），28 ℃培養(yǎng)72 h，根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色進行初步篩選，對所得的酵母菌進行編號和保藏[2-3]。

1.3.2 釀酒酵母篩選

參考吳卓凡等[4]的方法，利用TTC 培養(yǎng)基培養(yǎng)釀酒酵母，典型的釀酒酵母表面有光澤、易挑取[5]，在TTC 平板上顯紅色[6]，根據(jù)上述特征篩選出有產(chǎn)酒精能力的釀酒酵母。將篩選出的釀酒酵母，按照5%量接入裝有YPD 的杜氏小管中，28 ℃培養(yǎng)8 h，期間隔2 h 觀察各菌株的產(chǎn)氣量，記錄初篩酵母菌株的起酵時間、產(chǎn)氣速度，篩選出起酵快、產(chǎn)氣良好的菌株。

1.3.3 釀酒酵母發(fā)酵特性研究

（1）釀酒酵母高糖耐受測定。以葡萄糖為原料調(diào)節(jié)16°Bé、18°Bé、20°Bé、22°Bé 的YPD 培養(yǎng)基，5%接種量接種待測釀酒酵母，在28 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)30 h，對比各菌株在不同葡萄糖濃度中的活菌數(shù)[7]。

（2）釀酒酵母酸度耐受性能測定。取菌懸液，按5%接種量接種于無菌YPD 中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值為1.6、1.8、2.0、2.2， 在28 ℃、150 r·min-1培養(yǎng) 30 h，對比各菌株在不同pH 溶液中的活菌數(shù)。

（3）乙醇耐受性能測定。取菌懸液，按5%接種量接種在無水乙醇體積分數(shù)分別為10%、12%、14%、16%的YPD 培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)30 h，對比各菌株在不同酒精濃度中的活菌數(shù)。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母分離與篩選

通過YPD 培養(yǎng)基分離篩選后，涂布濃度為10-4的平板，約有100 ～150 個單菌落，絕大部分單菌落在TTC 培養(yǎng)基上顯色良好，呈紅色，單菌落數(shù)約為85%，將初篩的菌株全部用甘油保菌，-20 ℃保存。

從枇杷及土壤中共篩選出83 株釀酒酵母，編號P1 ～83，接種YPD 杜氏小管后觀察產(chǎn)氣情況，單菌落產(chǎn)氣情況如表1。篩選的菌種中，約有3 株酵母菌株產(chǎn)氣快，產(chǎn)氣最快的8 h 開始，12 h 以內(nèi)產(chǎn)滿整個杜氏小管，約有23 株釀酒酵母培養(yǎng)18 h 以上未產(chǎn)氣，其他大部分的菌株在12 ～18 h 內(nèi)產(chǎn)氣，約為60 株，其中7 株釀酒酵母12 h 內(nèi)產(chǎn)氣量超過杜式小管90%。由此，篩選出7 株發(fā)酵良好、起酵快的酵母菌株，6 株來源于枇杷果實，1 株來源于枇杷果園，可見自然發(fā)酵后發(fā)酵能力強的菌株大致得到富集，將分離篩選的7 株釀酒酵母菌株進行發(fā)酵特性鑒定，7 株菌株分別命名為PP1 ～PP6、TR1。

表1 釀酒酵母杜氏小管發(fā)酵篩選結果

2.2 釀酒酵母發(fā)酵特性

2.2.1 釀酒酵母高糖耐受測定

果酒發(fā)酵需要調(diào)整發(fā)酵果汁的甜度，但糖類會增加環(huán)境的滲透壓，從而抑制酵母的生長，因此應篩選出耐高糖的釀酒酵母。本實驗中對比各菌株在糖度16°Bé、18°Bé、20°Bé、22°Bé 的活菌數(shù)， 圖1結果顯示，PP1、PP4、PP5、PP6、TR1 這5 株釀酒酵母的耐受能力相對較強，在4 個糖度梯度下的活菌數(shù)平均值差異小，糖耐受能力均較為優(yōu)異，PP2、PP3 兩株釀酒酵母在22°Bé 耐糖性能較弱。

圖1 釀酒酵母在不同葡萄糖濃度下的活菌數(shù)

2.2.2 釀酒酵母高酸耐受性能測定

高酸條件可以抑制雜菌的生長，但不影響釀酒酵母的生長，因此，需要篩選出耐酸且風味良好的釀酒酵母。從圖2 可以看出，7 株菌株對于pH 耐受性差異較大，PP2 耐pH 能力最差，僅在pH 大于2.0環(huán)境下生長；PP3 在pH 為1.6 環(huán)境中不生長，其他3 種pH 條件均能生長；PP1、TR1 在4 種pH 條件下均生長，但在pH 為1.6、1.8 的酒精濃度環(huán)境下菌株生長情況不佳；PP4、PP5、PP6 在4 種pH 環(huán)境下生長良好，但在pH 為1.6 環(huán)境活菌數(shù)略低于其他pH條件，具有一定的耐酸能力。

圖2 釀酒酵母對不同pH 下活菌數(shù)

2.2.3 乙醇耐受性能測定

發(fā)酵酒的生產(chǎn)主要利用釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酒精制得，但高濃度的酒精會抑制酵母活性，因此本試驗利用篩選出的7 株菌株在不同酒精濃度下培養(yǎng)，擬篩選出酒精耐受能力強的菌株。由圖3 可以看出，7 株菌株對于酒精耐受性差異較大，PP2 耐酒精能力最差，僅在酒精濃度低于12%的環(huán)境生長，在14%、16%條件下不生長，PP3、PP6 和TR1 在4種酒精濃度條件下均生長，但在14%、16%的酒精濃度環(huán)境下菌株生長情況較其他酒精濃度弱，PP1、PP4、PP5 在4 種酒精濃度條件下生長良好，耐酒精能力突出。

圖3 釀酒酵母不同酒精濃度下活菌數(shù)

3 結論

本實驗從枇杷生產(chǎn)基地的土壤及果實分離、篩選、鑒定，最終獲得1 ～2 株適用于枇杷果酒生產(chǎn)的專業(yè)酵母。通過培養(yǎng)基分離篩選出83 株釀酒酵母，通過產(chǎn)氣試驗淘汰產(chǎn)氣不佳的76 株釀酒酵母，篩選出7 株起酵快、產(chǎn)氣快的釀酒酵母，其中6 株來源于枇杷果實樣品，1 株來源于枇杷土壤樣品，分別編號PP1 ～PP6、TR1。7 株菌株經(jīng)過高糖耐受試驗、高酸耐受試驗、酒精耐受試驗發(fā)酵力試驗驗證，PP4、PP5 兩株釀酒酵母耐糖性、耐酸性、耐酒精能力較強。篩選枇杷果酒生產(chǎn)專用菌株有利于發(fā)展枇杷發(fā)酵產(chǎn)品市場，具有較好的市場前景。在本實驗基礎上，后續(xù)將篩選出的2 株釀酒酵母應用在枇杷果酒的生產(chǎn)過程中，探索和優(yōu)化枇杷酒的生產(chǎn)工藝，為枇杷果酒產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎。