加速溶劑提取-同位素稀釋-高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定生物樣品中82種多氯聯(lián)苯

吳銀菊, 瞿白露, 侯玉蘭, 于海斌, 許人驥, 鄭曉燕*

(1. 中國環(huán)境監(jiān)測總站, 北京 100012; 2. 湖南省長沙生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心, 湖南 長沙 410000)

多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是聯(lián)苯苯環(huán)上氫原子被氯原子取代的化合物的總稱,其分子式為C12H(10-n)Cln。根據(jù)氯原子取代數(shù)和取代位置的不同,PCBs共有209種同類物,國際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)已對PCBs及其衍生物進行了系統(tǒng)的命名和編號。通常情況下,PCBs是一種無色或淺黃色的油狀物質(zhì),有非常穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì),屬半揮發(fā)或不揮發(fā)物質(zhì),蒸氣壓低,難溶于水,其作為優(yōu)質(zhì)工業(yè)添加劑,在石油產(chǎn)品、塑料、農(nóng)藥加工等行業(yè)大量使用。但PCBs在環(huán)境中難降解,殘留時間長,易溶于脂肪,可在食物鏈中積累,且具有致畸性、致癌性、致突變性,是首批列入《關(guān)于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》的12種優(yōu)先控制污染物之一[1]。

膳食攝入是普通人群暴露PCBs的主要途徑,占人體總暴露量的90%以上[2]。在各類膳食中,魚類、貝類及其他水產(chǎn)品含有較高的PCBs[3,4]。我國水產(chǎn)品資源豐富,魚、蝦、貝類等水產(chǎn)品是餐桌常見食品,其受污染程度直接影響人體健康。同時,生物體內(nèi)PCBs含量的高低往往能反映其所處環(huán)境的污染水平。實際銷售的工業(yè)品中僅測定出130余種PCBs同類物[2]。全球環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)/食品規(guī)劃部分(GEMS/FOOD)認為,將食品中PCBs濃度用相應(yīng)的工業(yè)品PCBs進行量化,可能會導(dǎo)致嚴重的定性和定量錯誤;分析特定的PCBs同類物能提供與暴露評估相關(guān)的更有意義的信息[5]。

目前,GEMS/FOOD要求分析的PCBs同類物包括12種二噁英類PCBs(PCB77、PCB81、PCB105、PCB114、PCB118、PCB123、PCB126、PCB156、PCB157、PCB167、PCB169和PCB189)、6種“指示性PCBs”(PCB28、PCB52、PCB101、PCB138、PCB153和PCB180)以及另外41種非二噁英類PCBs[3]。有關(guān)PCBs在生物體中的測定國內(nèi)外均有報道[6-11],主要以指示性PCBs和二噁英類PCBs為主。目前,國內(nèi)頒布的動物源性食品中PCBs的標準分析方法,主要關(guān)注的是指示性PCBs、1種二噁英類PCB和另外16種非二噁英類PCBs,分析方法為氣相色譜-電子捕獲檢測(GC-ECD)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS),定量方法為內(nèi)標法和同位素稀釋法(ID)[12]。ECD雖然對PCBs有很高的靈敏度,但其是通過化合物的電負性產(chǎn)生的響應(yīng)及標準物質(zhì)的保留時間進行定性,在同樣的保留時間有可能有其他物質(zhì)共流出,在定性方面存在明顯不足。GC-MS和GC-MS/MS雖然通過化合物的特征離子碎片增加了定性的準確性,但要準確區(qū)分具有相同整數(shù)質(zhì)荷比離子的干擾物仍存在難度,而且靈敏度較低。而HRGC-HRMS可對選擇離子的質(zhì)量數(shù)精確到小數(shù)點后4位,可準確區(qū)分具有相同整數(shù)質(zhì)荷比離子的干擾物,提高了定性定量的準確性及抗干擾能力。同位素稀釋法被認為最高計量標準的化學(xué)測量方法,對痕量物質(zhì)的檢測靈敏度高,選擇性強,準確度好。同位素稀釋法和HRGC-HRMS結(jié)合對生物樣品中痕量PCBs進行測定,在定量和定性方面有其獨有的優(yōu)勢。

結(jié)合環(huán)境監(jiān)測實際情況,本文以魚和貝類為水產(chǎn)品代表,通過探討研究樣品提取方式、提取溶劑、樣品凈化及儀器條件等一些關(guān)鍵技術(shù)問題,建立了加速溶劑提取儀(ASE)提取樣品,酸性硅膠柱凈化,同位素稀釋-高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜測定生物中82種PCBs的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

氣相色譜儀(Agilent 7890A, Agilent公司,美國);高分辨質(zhì)譜儀(AutoSpec Premier, Waters公司,美國),配有Masslynx 4.1軟件,可根據(jù)譜圖直接計算每個樣品的方法檢出限;加速溶劑提取儀(ASE350, Thermo公司,美國);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1200B, Eyela公司,日本);氮吹儀(N-EVAPTM112, Organomation Associates公司,美國);高速組織勻漿機(上海標本模型廠,DS-1);實驗所用玻璃器皿使用前均用丙酮和正己烷各洗3次,使用后用有機溶劑涮洗,再用堿性洗滌液超聲清洗或洗瓶機清洗,空白檢測無殘留。

二氯甲烷、正己烷和丙酮均為農(nóng)殘級(J. T. Baker公司,美國);壬烷(色譜純,百靈威公司,德國);超純水為二次去離子水;濃硫酸(優(yōu)級純,北京化工廠);無水硫酸鈉(優(yōu)級純,天津市津科精細化工研究所), 450 ℃下烘4 h;硅膠(層析柱用,Merck公司,德國),粒徑為0.063～0.100 mm, 550 ℃下烘12 h, 180 ℃下平衡1 h,冷卻后裝入密封的玻璃瓶中,并存放于干燥器中。44%酸性硅膠,為44 g濃硫酸與56 g活化硅膠充分混勻[13]。

PCBs標準系列(Wellington公司,加拿大):包括PCBs校準溶液系列(PCB-CVS-H,天然化合物質(zhì)量濃度依次為0.1、0.5、2.0、10.0、40.0和200 ng/mL,相應(yīng)的13C同位素提取內(nèi)標和進樣內(nèi)標濃度均為50 ng/mL;壬烷),以及配套的82種天然化合物(PCB-PAR-H, 500 ng/mL;壬烷)、13C同位素提取內(nèi)標(PCB-LCS-H, 1 000 ng/mL;壬烷)和13C同位素進樣內(nèi)標(PCB-ISS-H, 1 000 ng/mL;壬烷)均為直接購買的標準溶液。具體化合物信息見附表1(詳見https://www.chrom-China.com)。

1.2 樣品前處理

1.2.1提取

取市售魚和赤貝食用部分用高速組織勻漿機搗碎,均質(zhì)后密封于具塞玻璃瓶中,-18 ℃保存于冰箱。提取前解凍至室溫。

準確稱取5.00 g樣品于小燒杯中,并加入20 g無水硫酸鈉攪拌均勻后,轉(zhuǎn)入底部鋪有濾膜的34 mL提取池中,然后用約5 g無水硫酸鈉分3次清洗小燒杯,一并轉(zhuǎn)入提取池中。加入10 μL 100 ng/mL提取內(nèi)標PCB-LCS-H(絕對含量為1 ng),用正己烷-二氯甲烷(1∶1, v/v)加速溶劑提取。提取條件為:靜提取時間8 min,壓力10.3 MPa,提取溫度100 ℃,加熱時間5 min,循環(huán)3次,吹掃時間120 s,淋洗體積60%。

1.2.2凈化

將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL左右,過酸性硅膠層析柱。層析柱內(nèi)徑為15 mm,自下而上填充1 cm無水硫酸鈉、8 g 44%酸性硅膠、1 cm無水硫酸鈉,邊填充邊輕輕敲打,使填料填充均勻密實。使用前用70 mL正己烷預(yù)淋洗,活化。將樣品完全轉(zhuǎn)移至活化后的層析柱上凈化,用90 mL正己烷洗脫。洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 mL后,氮吹濃縮,溶劑轉(zhuǎn)換成壬烷,定容20 μL,加入1 ng進樣內(nèi)標PCB-ISS-H,待上機分析。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

毛細管色譜柱:DB-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度:270 ℃;傳輸線溫度為280 ℃;柱流速:1.0 mL/min,恒流模式;進樣方式:不分流進樣;升溫程序:初始溫度120 ℃,保持1 min,以30 ℃/min的升溫速率升至180 ℃,以2 ℃/min升至210 ℃,保持1 min,再以2.5 ℃/min升至310 ℃,保持1 min;載氣:氦氣,純度≥99.999 9%;進樣體積:1.0 μL。

雙聚焦磁質(zhì)譜,靜態(tài)分辨率為10 000,動態(tài)分辨率>8 000(分辨率采用單峰5%峰谷定義),并至少可穩(wěn)定12 h以上。離子源溫度:280 ℃;電子能量:35 eV;捕集電流:650 μA;加速電壓:7 950 V;光電倍增管電壓:350 V[13,14];選擇離子監(jiān)測(SIM)模式。各PCBs在HRGC-HRMS上的窗口劃分、特征離子、定量特征離子理論豐度比、保留時間、保留時間參考和定量參考見表1。

1.4 定性定量方法

在給定色譜-質(zhì)譜條件下,獲得樣品色譜圖和質(zhì)譜圖,根據(jù)保留時間和特征離子豐度比進行定性,以平均相對響應(yīng)因子法(RRF)進行定量。由校準溶液測定化合物的RRF,并計算平均值。其中,35種PCBs使用各自13C標記的提取內(nèi)標定量,其余采用保留時間接近的13C標記的提取內(nèi)標定量;除了一氯聯(lián)苯、七氯聯(lián)苯和十氯聯(lián)苯提取內(nèi)標分別采用二氯聯(lián)苯(13C-PCB9)、六氯聯(lián)苯(13C-PCB162)和九氯聯(lián)苯(13C-PCB206)進樣內(nèi)標定量,其余提取內(nèi)標均用相同氯代水平的進樣內(nèi)標定量。化合物信息及其氯代水平詳細見表1和附表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離和質(zhì)譜條件的選擇

PCBs的同類物屬于非極性物質(zhì),因此本實驗選擇非極性固定液的石英毛細管柱DB-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm),考察了不同升溫程序?qū)?2種目標物分離情況的影響。發(fā)現(xiàn)采用1.3節(jié)所述的升溫程序時,色譜分離效果良好,如圖1所示的八氯聯(lián)苯PCB194和PCB205,兩者可實現(xiàn)基線分離。82種PCBs標準溶液(200 ng/mL)總離子流色譜圖見圖2。其中PCB4與PCB10、PCB28與PCB31、PCB153與PCB168、PCB180與PCB193在DB-5MS色譜柱的分配系數(shù)相同,且質(zhì)譜碎片離子一致,無法實現(xiàn)分離并定性,因此被視為共流出,定量結(jié)果為兩者的總和。

根據(jù)優(yōu)化好的升溫程序條件,參考文獻[14],對PCBs的特征碎片離子進行窗口劃分,總共劃分了7個監(jiān)測窗口(見表1)。第一個窗口監(jiān)測一氯聯(lián)苯,第二個窗口監(jiān)測二氯聯(lián)苯和三氯聯(lián)苯,第三個窗口監(jiān)測部分三氯聯(lián)苯、四氯聯(lián)苯和五氯聯(lián)苯,第四個窗口監(jiān)測四氯聯(lián)苯、五氯聯(lián)苯和六氯聯(lián)苯,第五個窗口監(jiān)測五氯聯(lián)苯、六氯聯(lián)苯和七氯聯(lián)苯,第六個窗口監(jiān)測六氯聯(lián)苯、七氯聯(lián)苯和八氯聯(lián)苯,第七個窗口監(jiān)測八氯聯(lián)苯、九氯聯(lián)苯和十氯聯(lián)苯。選擇的質(zhì)譜質(zhì)量軸參考物為全氟代煤油(PFK),每個窗口PFK鎖定離子接近或在該窗口分析物碎片離子范圍內(nèi),且峰響應(yīng)較強[13]。

表 1 多氯聯(lián)苯的掃描窗口、特征離子、理論豐度比、保留時間、保留時間參考和定量參考

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

圖 1 PCB194和PCB205的分離Fig. 1 Separation of PCB194 and PCB205 Temperature program 1: start at 120 ℃, hold for 1 min, up to 150 ℃ at 30 ℃/min, up to 300 ℃ at 2.5 ℃/min, hold for 1 min; temperature program 2: start at 120 ℃, hold for 1 min, up to 180 ℃ at 30 ℃/min, up to 210 ℃ at 2 ℃/min, hold for 1 min, up to 310 ℃ at 2.5 ℃/min, hold for 1 min.

圖 2 PCBs標準溶液(200 ng/mL)的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of the standard solution of PCBs (200 ng/mL)

2.2 實驗條件

2.2.1洗脫體積的確認

參照EPA 1688A方法,采用8 g酸性硅膠層析柱凈化樣品。由于同位素標記的化合物的物化性質(zhì)與其天然化合物相同,因此在確認洗脫體積時,直接使用相應(yīng)的13C標記化合物[14]。酸性硅膠層析柱填充時需緊實,可有效提高凈化效果。層析柱經(jīng)70 mL正己烷預(yù)淋洗后,加入1 ng提取內(nèi)標,然后依次用10、20、20、20、20 mL正己烷洗脫,并分別收集各流分,共5個流分。發(fā)現(xiàn)化合物大部分集中在流分1和2中,而流分5中化合物回收率為0～0.4%,因此選擇正己烷的洗脫體積為90 mL。

2.2.2樣品提取方式的確定

EPA 1688A方法推薦使用索式提取裝置提取樣品18～24 h[14]。索氏抽提法是傳統(tǒng)固體樣品中微量、痕量有機污染物的提取方法,至今仍被廣泛使用,在分析PCBs方面的報道也有很多,如沉積物、土壤和動植物組織等[15,16]。但是索氏抽提法溶劑消耗量大且耗時長,鑒于此,我們考慮采用水平振蕩法和加速溶劑提取法提取樣品。

各取3份貝類樣品,加入1 ng提取內(nèi)標后,分別用水平振蕩法和加速溶劑提取法進行提取。水平振蕩法提取條件:30 mL正己烷-二氯甲烷(1∶1, v/v)振蕩提取2次,每次40 min,頻次200次/min。加速溶劑提取法條件為1.2.1節(jié)所述。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn),振蕩提取的回收率雖然在可接受范圍內(nèi),但由于振蕩加速溶劑揮發(fā)使瓶內(nèi)壓力增加,瓶塞易松動或沖開濺出溶劑,操作難度較大,導(dǎo)致回收率不易控制,且超過一半提取內(nèi)標回收率的RSD≥30%,重復(fù)性差。加速溶劑提取法實現(xiàn)了樣品全自動加壓加熱溶劑提取,不僅解放人力,節(jié)約試劑,而且易于操作,回收率易于控制且重復(fù)性好,提取內(nèi)標回收率為44.5%～135%, RSD為1.3%～19%(見附表2),達到EPA 1688A方法回收率(13C-PCB1、13C-PCB3回收率為15%～150%,其余物質(zhì)為25%～150%)和RSD≤50%的要求。因此,最終選擇加速溶劑提取法進行樣品提取。

2.2.3提取溶劑的選擇

實驗在文獻[9,17,18]基礎(chǔ)上,確定ASE的提取條件為:靜提取時間8 min,壓力10.3 MPa,提取溫度100 ℃,加熱時間5 min,循環(huán)3次,吹掃時間120 s,淋洗體積60%。在此條件下,對提取溶劑進行了選擇。

多氯聯(lián)苯為弱極性物質(zhì),根據(jù)相似相溶原理,多采用二氯甲烷、正己烷、丙酮或其混合溶劑為提取溶劑。按1.2.1 ASE提取條件和1.2.2凈化條件,研究了正己烷-丙酮(1∶1, v/v)和正己烷-二氯甲烷(1∶1, v/v)對PCBs的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者對PCBs的提取效率分別為35.9%～136%和33.1%～128%,均滿足EPA 1688A的要求?？紤]到水產(chǎn)品中含有大量油脂,干擾組分復(fù)雜,丙酮是強極性溶劑,提取目標物的同時也會提取更多雜質(zhì),加重樣品的凈化負擔。因此,選擇正己烷-二氯甲烷(1∶1, v/v)為提取溶劑。

2.3 平均相對響應(yīng)因子、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限

將PCBs系列標準溶液(0.1、0.5、2.0、10.0、40.0和200 ng/mL)進樣,采用同位素稀釋法計算目標物和提取內(nèi)標的RRF及其RSD。結(jié)果表明，線性相關(guān)系數(shù)(r2)均>0.99(見附表3), RFF的RSD≤20%,表明各PCBs的RRF結(jié)果穩(wěn)定,可進行定量計算。按照HJ 168-2020要求,計算方法檢出限(MDL),按照樣品分析的全流程,以魚/貝類的實際樣品為基質(zhì)空白,重復(fù)測定7次,按公式MDL=t(n-1, 0.99)×S計算方法檢出限(n=7時,t(n-1, 0.99)=3.143;S為標準偏差),分別得到魚類和貝類的MDL。未檢出的物質(zhì)采用儀器軟件以3倍信噪比計算檢出限。最終確定生物樣品的方法檢出限為0.02～3 pg/g,結(jié)果見附表3。

2.4 方法回收率和精密度

在優(yōu)化后的實驗條件下,分別取魚肉和赤貝作加標回收試驗,加入低(0.4 ng)、高(3.6 ng)水平的天然化合物PCB-PAR-H,每個水平重復(fù)測定7次,驗證方法的回收率和精密度。從附表4可見,低水平加標時,魚和貝類平均回收率分別為71.3%～139%和76.9%～143%, RSD分別為2.1%～14%和4.5%～14%;高水平加標時,魚和貝類平均回收率分別為77.6%～141%和82.2%～131%, RSD分別為1.4%～9.4%和1.7%～11%。表明方法的準確度和精密度均能達到滿意結(jié)果。

2.5 實際樣品測定

采用本文方法對北京市某農(nóng)貿(mào)市場市售新鮮魚、新鮮赤貝各1種進行了分析測定。新鮮魚中PCBs單體含量范圍為未檢出～13.8 pg/g, 12種類二噁英類PCBs含量為12.6～17.5 pg/g, 6種指示性PCBs含量為30.9～46.7 pg/g, 82種PCBs總含量為174～251 pg/g,回收率為42.1%～121%;新鮮赤貝中PCBs單體含量范圍為未檢出～54.1 pg/g, 12種類二噁英類PCBs含量為30.4～74.5 pg/g, 6種指示性PCBs含量為51.8～62.1 pg/g, 82種PCBs總含量為282～672 pg/g,提取回收率為38.2%～113%。

3 結(jié)論

本文利用加速溶劑提取結(jié)合酸性硅膠柱凈化的樣品前處理技術(shù)和同位素稀釋法定量方式,采用HRGC-HRMS進行測定,建立了生物樣品中82種多氯聯(lián)苯的檢測方法。該方法使用ASE進行樣品提取,操作簡單;采用酸性硅膠柱凈化,去除生物樣品中脂肪的同時對樣品進行凈化,有效去除干擾物;利用同位素稀釋法定量,保證了方法的準確性。該方法前處理簡單,回收率好,靈敏度高,重復(fù)性佳,可為國內(nèi)外更加全面具體分析魚和貝類等水產(chǎn)品受PCBs污染情況和開展生物監(jiān)測提供有效的技術(shù)支持。同時,該方法也可以更好地服務(wù)于相關(guān)生態(tài)環(huán)境管理及履行《斯德哥爾摩公約》。