超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜快速篩查確證化妝品中73種常見禁用物質(zhì)

李楊杰, 黃佳穎, 方繼輝, 黃志業(yè)

(廣東省藥品檢驗所, 國家藥品監(jiān)督管理局化妝品風險評估重點實驗室, 廣東 廣州 510000)

化妝品作為日常生活用品,其質(zhì)量安全影響千家萬戶。隨著生活水平和審美要求的提高,人們對化妝品的需求越來越大,而有些不法商家為達到效果好、見效快、成本低等目的,在化妝品中添加各種激素、抗生素等禁用物質(zhì)[1-5],嚴重威脅了消費者的身體健康。化妝品監(jiān)管部門通報的不合格化妝品問題顯示,添加禁用物質(zhì)和超量使用限用物質(zhì)是當前化妝品質(zhì)量安全存在的主要問題。

目前,化妝品中禁用物質(zhì)的檢測主要采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[6]和國標[7,8]等檢測標準。但標準中禁限用物質(zhì)定性定量采用的液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)只適用于已有標準物質(zhì)的已知物分析,且檢測通量受四極桿掃描速度的限制,無法實現(xiàn)高通量篩查。同時,低分辨的四極桿質(zhì)量分析器無法區(qū)分質(zhì)荷比相近的干擾物,易造成假陽性結(jié)果。超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF HRMS)具有高質(zhì)量精度、高掃描速度、高通量和全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集等優(yōu)勢,可以大大提高定性篩查的準確度,配合數(shù)據(jù)庫譜庫檢索功能可廣泛用于樣品中未知物篩查和多組分的高通量檢測[9]。

此外,目前已有的標準和檢測方法多是針對化妝品中的糖皮質(zhì)激素類[1,4]、抗生素類[5]、抗過敏類[10,11]、抗組胺類[12]、性激素類[13]等單一類別化合物進行檢測。但化妝品中實際添加的禁用物質(zhì)種類繁多,檢測過程中需要多個標準或檢測方法組合使用,存在檢測成本高、周期長和效率低等問題。而且檢測標準中的大部分化合物在實際樣品檢測中并未檢出過,目標針對性不強。因此,需要整合化妝品中實際添加的多種類禁用物質(zhì),建立一種高效、準確、覆蓋廣、針對性強的化妝品中常見禁用物質(zhì)的篩查方法,以實現(xiàn)對批量樣品的快速篩查。而目前對于化妝品中多種禁用物質(zhì)的同時檢測還鮮有報道。

本研究根據(jù)文獻[14-18]檢索結(jié)果和監(jiān)測結(jié)果篩選出在市售化妝品中檢出過的17大類73種常見禁用物質(zhì)作為目標分析物,建立了化妝品中73種常見禁用物質(zhì)的UPLC-Q-TOF HRMS檢測方法。此外,在不合格化妝品通告和文獻[14-18]檢索的基礎(chǔ)上,還針對性地建立了化妝品中禁用物質(zhì)高分辨質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù)庫,并將數(shù)據(jù)庫應(yīng)用于日?；瘖y品監(jiān)督檢驗和風險監(jiān)測。篩查數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用大大提高了日常檢驗的工作效率和化妝品安全風險監(jiān)測水平,對于保障化妝品質(zhì)量安全、保護消費者健康具有非常重要的現(xiàn)實意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Exion LC超高效液相色譜儀、X500R四極桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜儀(配有Sciex OS數(shù)據(jù)處理軟件和LibraryView數(shù)據(jù)庫軟件)(美國AB Sciex公司), 3-18KS高速冷凍離心機(美國Sigma公司), MS3 basic旋渦振蕩器(德國IKA公司), XS205DU電子天平(瑞士Mettler公司), Ti-H20超聲波儀(德國Heidolpn公司), Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

乙酸銨(質(zhì)譜純,美國Sigma公司);甲酸(質(zhì)譜純)、甲醇、乙腈(色譜純)、N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、無水硫酸鎂(優(yōu)級純)均購自德國CNW公司。73種禁用物質(zhì)包括33種激素類(25種糖皮質(zhì)激素和8種性激素)、18種抗生素類(4種喹諾酮類、4種四環(huán)素類、4種磺胺類、3種林可酰胺類、2種硝基咪唑類和1種酰胺醇類)、7種抗真菌類、3種抗組胺類、3種香豆素類、3種局部麻醉類、2種腎上腺素類、1種解熱鎮(zhèn)痛類、1種育發(fā)類、1種抗寄生蟲類和1種促進膠原蛋白合成類。73種禁用物質(zhì)按上述類別順序和同一類中化合物的保留時間順序依次列于表1。

表 1 73種化合物的品牌、純度和質(zhì)譜參數(shù)

表 1 (續(xù))

1.2 實驗條件

1.2.1樣品前處理

準確稱取化妝品樣品0.2 g,置于15 mL離心管中,加入3 mL飽和氯化鈉溶液,渦旋30 s,分散均勻,加入含0.2%甲酸的乙腈溶液10 mL,渦旋30 s,超聲提取30 min,渦旋混合搖勻,于0 ℃以8 000 r/min轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min,吸取上清液5 mL,置于10 mL離心管中,加入50 mg PSA凈化吸附劑渦旋1 min混勻,于0 ℃以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心后,取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,上機測定。

1.2.2標準溶液的配制

分別精確稱取10 mg對照品,置于10 mL棕色容量瓶中,加入甲醇充分溶解后(對于在純甲醇中溶解性差的環(huán)丙沙星、美滿霉素、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑和金霉素可加入少量甲酸或水促進溶解),室溫超聲10 min,用甲醇定容至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液,置于-18 ℃冰箱中儲存。用甲醇將標準儲備液逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度的標準工作液。

取15 mL離心管8支,每支稱取與待測化妝品配方相同或相近的基質(zhì)空白樣品0.2 g,分別精密加入標準工作液適量,渦旋30 s混勻,按1.2.1節(jié)樣品前處理步驟進行處理,配制成含量為50～10 000 μg/kg的系列基質(zhì)匹配標準溶液。

1.2.3色譜條件

色譜柱:Waters Acquity HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.35 mL/min。正離子模式流動相:含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液(A)和含0.1%甲酸的甲醇(B);正離子模式梯度洗脫程序:0～1.0 min, 2%B; 1.0～3.0 min, 2%B～20%B; 3.0～8.0 min, 20%B～40%B; 8.0～15.0 min, 40%B～60%B; 15.0～20.0 min, 60%B～80%B; 20.0～25.0 min, 80%B～95%B; 25.0～27.0 min, 95%B; 27.0～27.5 min, 95%B～2%B; 27.5～30.0 min, 2%B。負離子模式流動相:0.005%甲酸水溶液(C)和含0.005%甲酸的甲醇(D);負離子模式梯度洗脫程序:0～0.5 min, 2%D; 0.5～14.0 min, 2%D～98%D; 14.0～17.5 min, 98%D; 17.5～17.6 min, 98%D～2%D; 17.6～20.0 min, 2%D。進樣量:5 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;離子化方式:ESI+和ESI-;毛細管溫度:600 ℃;霧化氣(gas 1)壓力:379.21 kPa(55 psi);干燥氣(gas 2)壓力:379.21 kPa (55 psi);氣簾氣(curtain gas)壓力:241.32 kPa (35 psi);碰撞氣(CAD gas)壓力:48.26 kPa (7 psi);監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測高分辨掃描模式(MRM HR);噴霧電壓:5.5/-4.5 kV;去簇電壓(DP):±80 V;一級全掃描模式:全掃描范圍m/z100～1 000;二級MRM HR模式:掃描范圍m/z60～600。73種化合物的母離子、子離子、碰撞能量(CE)、保留時間、標準物質(zhì)純度等參數(shù)列于表1。

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來在我國的發(fā)病率逐年上升。手術(shù)切除是治愈肺癌的主要方法，但大多患者在肺癌確診時早已失去了手術(shù)治療的時機［11］。特別是當前晚期非鱗非小細胞肺癌的治療目標是緩解臨床癥狀，提高生存率及延長生存時間［12］。

每次實驗前,利用廠家提供的正、負離子調(diào)諧液,通過內(nèi)置調(diào)諧液傳輸系統(tǒng)(CDS)對儀器分別進行MS和MS/MS模式的質(zhì)量精度校正。序列進行中,每運行5針樣品,利用廠家提供的校正液自動進行一次質(zhì)量精度校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 高分辨質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù)庫的建立和應(yīng)用

采用AB X500R Q-TOF構(gòu)建化妝品中禁用物質(zhì)高通量風險篩查質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,目前已通過購買標準品自建了化妝品中650種禁用物質(zhì)的高通量風險篩查識別數(shù)據(jù)庫,并應(yīng)用于日常化妝品的風險監(jiān)測。采用信息依賴掃描模式(IDA)建立數(shù)據(jù)庫并應(yīng)用于樣品的快速篩查。通過數(shù)據(jù)庫中化合物的保留時間、母離子及碎片離子精確質(zhì)量信息、同位素豐度比等對樣品中的禁用物質(zhì)進行快速篩查和定性確證。如果被測樣品出現(xiàn)了與標準品保留時間一致的色譜峰、精確質(zhì)量數(shù)偏差小于5×10-6、同位素豐度比差異小于5%、二級質(zhì)譜圖譜庫匹配得分大于70分時,則可判斷被測樣品中存在相應(yīng)的化合物[19]。

以克羅米通的快速篩查確證為例,對未知樣品進行IDA模式下的一級、二級全掃描檢測,將檢測結(jié)果通過Library View軟件與自建數(shù)據(jù)庫進行比對篩查和確證,結(jié)果篩查出克羅米通,匹配度為99.5%?？肆_米通的提取離子色譜圖、一級、二級高分辨質(zhì)譜圖及數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果見圖1。

圖 1 克羅米通的(a)色譜圖、(b)一級、(c)二級高分辨質(zhì)譜圖及數(shù)據(jù)庫鏡像結(jié)果Fig. 1 (a) Chromatogram, (b) mass spectrum (MS1),(c) mass spectrum (MS2) and mirror mass spectrum of crotamiton

2.2 質(zhì)譜條件選擇

根據(jù)73種化合物的電離性質(zhì),分別選用ESI+和ESI-作為離子化模式,采用流動注射泵連續(xù)進樣方式進行一級質(zhì)譜全掃描,選擇響應(yīng)最強的目標離子作為一級母離子,同時對去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。氯霉素、雌酮和己烯雌酚均在負離子模式下響應(yīng)最大,準分子離子為[M-H]-;其余化合物均在正離子模式下響應(yīng)最大,準分子離子為[M+H]+。本文使用的飛行時間質(zhì)譜可以根據(jù)需要選擇IDA模式、連續(xù)窗口全理論碎片離子采集模式(SWATH)和高分辨多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM HR)等3種不同的掃描模式。其中,對于已知化合物的定量,選擇MRM HR模式響應(yīng)最好,并可通過根據(jù)化合物保留時間分段采集和設(shè)置最佳CE值來獲得質(zhì)譜最佳響應(yīng)。相較于IDA模式,MRM HR模式下，73種禁用物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)可提高約1.3～37倍。

2.3 色譜條件選擇

實驗考察了不同流動相組成(水-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇、含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液-含0.1%甲酸的甲醇)對待測化合物分離和質(zhì)譜響應(yīng)的影響。流動相中酸度越強,正離子模式下化合物響應(yīng)越高,負離子模式下化合物響應(yīng)受抑制。綜合考慮待測組分的化學性質(zhì)、色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng),最終選擇正離子模式下含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液和含0.1%甲酸的甲醇溶液作為流動相。負離子模式下0.005%甲酸水溶液和含0.005%甲酸的甲醇溶液作為流動相。

實驗對梯度洗脫程序進行了優(yōu)化,使得不同類別、不同性質(zhì)的化合物能夠較好地色譜分離,且保留時間分布較均勻。

由于17類73種常見禁用物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)差異較大,本研究考察了73種禁用物質(zhì)在Waters Acquity HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、Agilent Poroshell 120 SB-AQ(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)和Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)3款通用型色譜柱上的色譜行為(見附圖1,詳見http://www.chrom-China.com)。實驗結(jié)果表明,73種禁用物質(zhì)在3款色譜柱上的色譜峰均對稱性好,峰形窄。相較于SB-AQ和EC-C18色譜柱,大多數(shù)化合物在HSS T3色譜柱上保留時間延長,且質(zhì)譜響應(yīng)信號也明顯增強,有利于目標分析物與樣品中雜質(zhì)的有效分離。Acquity HSS T3色譜柱采用亞微米填料技術(shù),比傳統(tǒng)的色譜柱具有更好的色譜分離度,特別可增強極性化合物的色譜保留。因此,本實驗最終選擇HSS T3色譜柱用于73種禁用物質(zhì)的色譜分離。73種禁用物質(zhì)的提取離子色譜圖見圖2。

圖 2 73種禁用物質(zhì)的提取離子色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the 73 prohibited compounds

2.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.4.1提取溶劑的選擇

圖 3 提取溶劑對73種禁用物質(zhì)回收率的影響Fig. 3 Effects of extraction solvents on the recoveries of the 73 prohibited compounds

本實驗采用飽和氯化鈉溶液對化妝品樣品進行加速破乳,但林可酰胺類等水溶性化合物因分布在水層而導致回收率低于30%,林可霉素回收率更是低于10%(見圖3),林可霉素較低的回收率與文獻[19]結(jié)果一致。因此,針對林可酰胺類物質(zhì)，如采用飽和氯化鈉溶液破乳,則需采用基質(zhì)匹配外標法進行定量。如果待測化妝品屬于“油包水”劑型,還可加入適量的四氫呋喃或異丙醇進行破乳,以提高目標化合物的回收率。

由于化妝品基質(zhì)較為復雜,考察了渦旋分散和超聲的提取方法,渦旋分散有利于樣品與提取溶劑充分接觸,超聲對于化合物的提取效率更高,兩者結(jié)合操作簡便,提取效率更好。采用高速冷凍離心的方式凈化除雜,可快速簡便地將提取溶液與化妝品基質(zhì)中的脂類等大分子物質(zhì)有效分離。

2.4.2凈化吸附劑的選擇

QuEChERS的原理是利用固體吸附劑選擇性吸附雜質(zhì)從而達到凈化樣品的目的,因此吸附劑的選擇和用量是一個重要的考察因素。常用凈化劑一般包括PSA、C18和無水硫酸鎂。PSA是同時含有伯胺和仲胺基團的高純硅膠基質(zhì)類極性吸附劑,具有極性作用和弱陰離子交換作用,可有效去除有機酸、脂肪和色素等水溶性雜質(zhì)。C18是一種憎水硅膠基吸附劑,能夠吸附脂肪等非極性干擾物。無水硫酸鎂在凈化過程中可吸取多余的水分。

本研究比較了PSA、C18和硫酸鎂3種凈化吸附劑對化妝品中73種常見禁用物質(zhì)的凈化效果。選擇基質(zhì)更為復雜的膏霜樣品為考察基質(zhì),樣品加入200 ng混合標準溶液后按前處理方法提取,以17大類禁用物質(zhì)的平均回收率為考察指標,研究了PSA(0、50、100、200和500 mg)、C18(0、50、100和200 mg)和硫酸鎂(0、100、200、500、1 000和1 500 mg)用量對于各類化合物回收的影響(見圖4)。每個條件均進行2次平行實驗,2次平行測定的相對偏差均小于15%。由圖4a可知,PSA對于喹諾酮類化合物具有明顯吸附作用,回收率隨著PSA用量的增加而顯著降低,與陳少波等[21]研究結(jié)果一致。糖皮質(zhì)激素、磺胺類、抗組胺類、腎上腺素類、阿法骨化醇等化合物均隨著PSA用量增加回收率降低,當PSA用量為50 mg時,對絕大多數(shù)化合物在有凈化效果的同時保證了較好的回收?？瞻赘嗨|(zhì)經(jīng)50 mg的PSA凈化前后的總離子流圖見圖5。由圖可見,50 mg的PSA具有很好的凈化效果,可大大降低基質(zhì)干擾。

圖 4 凈化吸附劑對73種禁用物質(zhì)回收率的影響Fig. 4 Effects of purification adsorbents on the recoveries of the 73 prohibited compounds

圖 5 采用PSA凈化前后膏霜劑樣品的總離子流色譜圖Fig. 5 Total ion chromatograms of the cream sample before and after primary secondary amine (PSA) purifying

由圖4b可知,C18對抗真菌類、抗組胺類、腎上腺激素類、米諾地爾、阿法骨化醇有一定的吸附作用,回收率隨著C18用量的增加而降低,且對大多數(shù)化合物,C18用量對化合物的回收影響不大,因此不采用C18作為凈化劑。

無水硫酸鎂可作為鹽析劑和除水劑,有利于有機相和水相分層,防止水分和雜質(zhì)進入提取液,在商品化的QuEChERS凈化管中常與C18和PSA聯(lián)合使用。文獻[22]報道硫酸鎂可能與喹諾酮類化合物吸附結(jié)合,形成配合物,導致回收率低于10%,本研究中喹諾酮類化合物回收率較低與文獻結(jié)果一致,但硫酸鎂對其他類化合物的影響不顯著(見圖4c)。因此,不采用無水硫酸鎂作為凈化劑。

綜合各化合物的回收效果,本研究最終選擇50 mg PSA。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)(η)是指共流出干擾物對目標物離子造成離子抑制或增強的效應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜分析中普遍存在,影響分析結(jié)果的準確性。本研究選取膏霜劑和水劑作為典型基質(zhì)對基質(zhì)效應(yīng)進行考察,分別制備溶劑標準溶液、膏霜劑和水劑的基質(zhì)匹配標準溶液,測得溶劑標準曲線和2種基質(zhì)匹配標準曲線性方程的斜率?；|(zhì)效應(yīng)=(基質(zhì)匹配標準曲線斜率-溶劑標準曲線斜率)/溶劑標準曲線斜率×100%[23],η的絕對值隨著基質(zhì)效應(yīng)的增強而變大,η為正值說明基質(zhì)增強,負值則為基質(zhì)抑制。當η絕對值<20%時表示基質(zhì)效應(yīng)微弱,η絕對值在20%～50%范圍時表示具有中等強度基質(zhì)效應(yīng),η絕對值>50%時表示基質(zhì)效應(yīng)較強[24]。膏霜劑和水劑中73種禁用物質(zhì)的η值見附表1,由附表1可知,水劑η值為-95.4%～-0.2%,膏霜劑η值為-96.3%～-8.9%。水劑基質(zhì)中50%的化合物都具有中等以上強度的基質(zhì)抑制效應(yīng),膏霜基質(zhì)中88%的化合物都具有中等以上強度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此,本實驗采用基質(zhì)匹配工作溶液定量以減小基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.6 線性范圍、檢出限和定量限

本實驗分別以水劑和膏霜劑化妝品空白樣品為基質(zhì),對8個含量在50～10 000 μg/kg(部分化合物對5個含量在500～10 000μg/kg)之間的系列混合基質(zhì)標準工作溶液進行測定,以化合物含量為橫坐標(μg/kg),以峰面積為縱坐標繪制基質(zhì)匹配標準曲線。結(jié)果表明,各化合物兩種基質(zhì)下在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。以信噪比(S/N)≥3確定檢出限,為5～150 μg/kg;以S/N≥10確定定量限,為15～450 μg/kg。73種禁用物質(zhì)水劑和膏霜劑的線性范圍、檢出限和定量限見附表1。

2.7 回收率和精密度

分別選取膏霜和水劑空白基質(zhì)樣品,做3個添加水平(LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ)的加標回收試驗,每個添加水平分別連續(xù)測定6次和連續(xù)3 d每天連續(xù)測定6次,計算各待測物的平均回收率及日內(nèi)和日間相對標準偏差(見附表2)。結(jié)果表明,73種禁用物質(zhì)在膏霜劑及水劑兩種基質(zhì)中3個加標水平下的平均加標回收率為60.3%～130.3%,日內(nèi)RSD為0.8%～10.0%(n=6),日間RSD為1.1%～15.0%(n=3)。

2.8 實際樣品測定

應(yīng)用本實驗所建立的方法對日?；瘖y品風險監(jiān)測所抽取的692份化妝品樣品進行分析。從其中16個樣品中檢出16種禁用物質(zhì),檢出的禁用物質(zhì)有磺胺甲基異噁唑、甲基潑尼松、林可霉素、對乙酰氨基酚、甲氧芐啶、阿法骨化醇、倍他米松戊酸酯、溴莫尼定、氯霉素、氯苯那敏、氯倍他索丙酸酯、克羅米通、益康唑、酮康唑、潑尼松醋酸酯和潑尼松,檢出禁用物質(zhì)的含量范圍為0.5～1 136.1 mg/kg,每個樣品平行測定2份,2份平行樣品的相對偏差均小于10%,樣品的測定結(jié)果見附表3。當樣品中被測組分的含量超過基質(zhì)匹配標準曲線范圍后,用含0.2%甲酸的乙腈溶液對樣品提取液進行適當稀釋后進行檢測。其中,阿法骨化醇、對乙酰氨基酚、甲基潑尼松、甲氧芐啶、克羅米通和溴莫尼定等6種化合物為現(xiàn)行檢測標準外的禁用物質(zhì)。

3 結(jié)論

本文采用UPLC-Q-TOF HRMS建立了化妝品中73種常見禁用物質(zhì)的快速篩查確證方法。經(jīng)實際樣品檢測考察,該方法準確、快速、簡便、實用,適用于化妝品中常見禁用物質(zhì)的同時檢測,具有較強的實際應(yīng)用價值,大大提高了日常監(jiān)督檢驗和風險監(jiān)測的檢驗效率,降低了檢測成本,方法的各項技術(shù)指標也滿足現(xiàn)行標準要求。同時,本研究還建立了化妝品中安全風險物質(zhì)高分辨質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù)庫,并將其應(yīng)用于日常的監(jiān)管工作。數(shù)據(jù)庫的建立和應(yīng)用將為化妝品監(jiān)管提供新工具和新方法,有助于實現(xiàn)化妝品安全風險的及時監(jiān)測、準確研判、科學預警和有效處置。