固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定燕窩中45種激素及其水平調(diào)查

徐敦明, 曾三妹, 柳訓(xùn)才, 王鷺驍, 范群艷, 張小江, 方恩華

(1. 廈門海關(guān)技術(shù)中心, 福建 廈門 361026; 2. 廈門市燕之屋絲濃食品有限公司, 福建 廈門 361101)

燕窩,又名燕菜、燕蔬菜及燕根,是由部分雨燕科金絲燕用其唾液及絨羽等混合凝結(jié)筑成用于繁衍后代的巢窩,含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、唾液酸及微量的礦物質(zhì)元素等[1,2],具有抗氧化[3-5]、改善免疫[6]、延緩衰老[7]、抗病毒[8,9]、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)[10]、防止胰島素抵抗[11]等功效,在《本草綱目拾遺》中有“大養(yǎng)肺陰,化痰止咳,補(bǔ)而能清,為調(diào)理虛損老擦之圣藥”的記載。燕窩自引入中國(guó)以來(lái)就被奉為高檔保健食品,廣受人們青睞。燕窩作為一種動(dòng)物源性食品,其中激素的安全性問(wèn)題也受到更多人的關(guān)注。通過(guò)索引,Ma等[12]采用免疫技術(shù)對(duì)燕窩中6種激素進(jìn)行測(cè)定,國(guó)內(nèi)外有關(guān)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)測(cè)定燕窩中激素含量的文獻(xiàn)報(bào)道甚少,鑒于此,建立一種準(zhǔn)確可靠的燕窩中多種激素同時(shí)確證的分析方法非常必要。

研究表明,長(zhǎng)期攝入激素對(duì)于人體健康存在一定風(fēng)險(xiǎn)與隱患。如雌激素其化學(xué)穩(wěn)定性高,不易降解,通過(guò)污水處理廠或養(yǎng)殖場(chǎng)廢棄物進(jìn)入環(huán)境后,在水體、土壤系統(tǒng)中將發(fā)生吸附、遷移等行為[13],可在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)蓄積,并通過(guò)食物鏈傳遞進(jìn)入人體,干擾內(nèi)分泌系統(tǒng),并引起發(fā)育、生殖、行為等方面的異常變化[14-16]。歐盟委員會(huì)禁止使用雌激素作為促生長(zhǎng)劑用于動(dòng)物育肥[17],我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告250號(hào)[18]也規(guī)定食品動(dòng)物中禁止使用己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚及其鹽、酯。目前,在環(huán)境領(lǐng)域研究較多的是雌激素,而對(duì)其他幾種類固醇激素的研究偏少,且多是集中在少數(shù)幾種物質(zhì)上的基礎(chǔ)研究,對(duì)于動(dòng)物源性食品中激素的研究主要針對(duì)肉制品、牛奶、蛋等食品。我國(guó)現(xiàn)行的動(dòng)物源性食品中激素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)近30個(gè),常用檢測(cè)痕量殘留激素的分析方法有主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[19,20]、電化學(xué)法[21,22]、酶免疫分析法[23]、放射免疫法[24]、高效液相色譜法[25]、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[26-30]等。其中,酶免疫分析法可測(cè)定范圍較窄且易存在假陽(yáng)性結(jié)果和交叉污染情況,適用于檢測(cè)常見、單一性激素;高效液相色譜法對(duì)熱穩(wěn)定差、高沸點(diǎn)物質(zhì)有較好分離度,但是紫外檢測(cè)器靈敏度及準(zhǔn)確性存在一定限制;GC-MS可對(duì)多種激素同時(shí)定性定量分析,但激素具有不易揮發(fā)及熱不穩(wěn)定性等特點(diǎn),多數(shù)需要衍生,目前尚未有一種衍生試劑可對(duì)所有激素進(jìn)行衍生化,而且衍生化過(guò)程還會(huì)出現(xiàn)副反應(yīng),使分析底物復(fù)雜化,過(guò)程繁瑣耗時(shí)。LC-MS/MS因具有檢測(cè)靈敏度高、選擇性和特異性好、分析時(shí)間短等特點(diǎn),是目前應(yīng)用最廣泛的激素殘留定量分析方法之一[31-35]。

本研究以燕窩為對(duì)象,以LC-MS/MS技術(shù)為檢測(cè)手段,建立了燕窩中皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素及孕激素類等45種激素的測(cè)定方法,該方法操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,準(zhǔn)確度好,對(duì)后續(xù)燕窩食品安全的監(jiān)管,以及回應(yīng)社會(huì)對(duì)燕窩中激素安全性的擔(dān)憂具有重要參考意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司), API5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司), CPX5800H超聲儀(美國(guó)Branson Ultrasonics公司), Supelco 24位固相萃取儀(美國(guó)Merck公司), N-EVAP-24氮吹儀(美國(guó)Organomation公司), MS3 Basic渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司), TDL-50B離心機(jī)(中國(guó)上海安亭科學(xué)儀器廠), Milli-Q Reference超純水器(美國(guó)Millipore公司), CPA225D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。

群勃龍等45種標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司、美國(guó)藥典公司、英國(guó)藥典公司、加拿大TRC公司)分別以甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中,使用時(shí)根據(jù)需要配成不同質(zhì)量濃度的中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)工作液。甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純(美國(guó)Merck公司),其他試劑為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 3 mL/60 mg親水-親脂平衡固相萃取柱(HLB,美國(guó)Waters公司)。本研究共收集1 021份燕窩樣品,來(lái)自馬來(lái)西亞、印度尼西亞、泰國(guó)和越南等國(guó)家,測(cè)定時(shí)間2017～2021年。

1.2 色譜條件

1.2.1正離子模式

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 70%A; 2.0～2.1 min, 70%A～50%A; 2.1～7.0 min, 50%A～36%A; 7.0～7.1 min, 36%A～16%A; 7.1～8.6 min, 16%A～0%A; 8.6～10.6 min, 0%A; 10.6～11.0 min, 0%A～70%A; 11.0～14.0 min, 70%A。進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.2負(fù)離子模式

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:A相為水,B相為乙腈;流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～1.5 min, 98%A～65%A; 1.5～3.5 min, 65%A; 3.5～3.8 min, 65%A～35%A; 3.8～5.0 min, 35%A; 5.0～5.3 min, 35%A～5%A; 5.3～7.0 min, 5%A; 7.0～7.1 min, 5%A～98%A; 7.1～10.0 min, 98%A。進(jìn)樣量:10 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源,正或負(fù)離子模式(ESI+或ESI-);離子源溫度:650 ℃;霧化氣壓力:413.7 kPa;干燥氣壓力:413.7 kPa;氣簾氣壓力:275.8 kPa;每個(gè)離子對(duì)駐留時(shí)間:10 ms。每種化合物的保留時(shí)間、檢測(cè)離子對(duì)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 (續(xù))

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0 g燕窩樣品,置于50 mL離心管中,加入8 mL水,旋渦混勻,超聲處理30 min。萃取劑為15 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v),均質(zhì)提取2 min,提取2次,室溫下離心5 min,轉(zhuǎn)速為4 000 r/min,合并上清液,于45 ℃氮吹濃縮至近干,加入5 mL 30%甲醇水溶液溶解殘?jiān)?。上樣至? mL甲醇和3 mL水活化過(guò)的HLB小柱中,然后依次用3 mL水、3 mL 50%甲醇水溶液淋洗,棄去淋洗液,再用3 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,并于45 ℃水浴中氮吹濃縮至近干,用1 mL 50%乙腈水溶液溶解殘?jiān)?旋渦混勻后經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾,濾液供LC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的建立

2.1.1質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

用單針進(jìn)樣分析目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,得到各化合物的準(zhǔn)分子離子([M+H]+或[M-H]-),比較兩種模式掃描的靈敏度,選取響應(yīng)值高的離子作為母離子。然后,對(duì)母離子施加一定的碰撞能量進(jìn)行轟擊,獲得其相應(yīng)的離子碎片,選擇信號(hào)較強(qiáng)、干擾較小的兩對(duì)子離子分別作為定量、定性離子。最后通過(guò)優(yōu)化碰撞能量,使每種化合物的特征碎片離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

在文獻(xiàn)[31-35]的基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)對(duì)比了Thermo Accucore-C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)和Phenomenex Kinetex C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)色譜柱對(duì)待測(cè)物分離的效果。發(fā)現(xiàn)采用Phenomenex Kinetex C18色譜柱時(shí),待測(cè)物色譜峰的保留時(shí)間、分離度以及對(duì)稱性都更優(yōu)。因此本方法選擇Phenomenex Kinetex C18色譜柱來(lái)分離待測(cè)物。

在正離子模式下,對(duì)比了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)待測(cè)物的分離效果。結(jié)果表明,流動(dòng)相甲酸化后有利于[M+H]+的形成,目標(biāo)化合物的響應(yīng)明顯增強(qiáng)。在負(fù)離子模式下,比較了水-乙腈、0.1%氨水溶液-乙腈為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相添加氨水后對(duì)[M-H]-的形成并無(wú)促進(jìn)作用。因此,在正、負(fù)離子模式下,分別采用0.1%甲酸水溶液-乙腈、水-乙腈為流動(dòng)相。45種化合物的總離子流色譜圖(TIC)見圖1。

圖 1 45種激素的總離子流色譜圖Fig. 1 TIC chromatograms of the 45 hormones

2.1.3提取溶劑的選擇

根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)方法[31-35],結(jié)合目標(biāo)化合物的性質(zhì),實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、甲醇、0.1%乙酸乙腈、乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)等4種不同提取溶劑對(duì)45種激素(10 μg/kg)的提取效果。結(jié)果表明,當(dāng)提取溶劑為乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)時(shí),甲睪酮的回收率為65%、布地奈德為69%,其他43種目標(biāo)物的回收率為74%～92%。而以乙腈、甲醇、0.1%乙酸乙腈為提取溶劑時(shí),目標(biāo)物回收率分別為34%～64%、26%～59%和42%～70%。故本文選擇乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)作為提取溶劑。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

與其他分析手段不同的是,質(zhì)譜分析尤其是以電噴霧電離為離子源的質(zhì)譜分析可能會(huì)存在基質(zhì)效應(yīng)。燕窩是天然材料,基質(zhì)中的雜質(zhì)會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的分析產(chǎn)生一定干擾,影響分析的準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度。本實(shí)驗(yàn)選取了燕窩基質(zhì)溶液與50%乙腈水溶液分別配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用公式ME=(基質(zhì)匹配曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)[28,33]?；|(zhì)效應(yīng)為負(fù)值時(shí),表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng);基質(zhì)效應(yīng)為正值時(shí),表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)的研究結(jié)果表明,醛固酮、醋酸氟輕松、炔諾酮、地塞米松、醋酸甲羥孕酮表現(xiàn)為增強(qiáng)效應(yīng);其他40種化合物均表現(xiàn)為抑制效應(yīng),其中21-羥基孕酮、17α-羥基孕酮、康力龍等3個(gè)分析目標(biāo)物的ME>15%,但<20%?？傮w評(píng)估,燕窩基質(zhì)對(duì)多數(shù)分析目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)不明顯,對(duì)回收率的影響在可接受范圍內(nèi),考慮到檢測(cè)的效率與成本,故本研究采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,外標(biāo)法定量。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1線性范圍、檢出限及定量限

配制45種激素的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各分析物的質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標(biāo),各激素定量離子對(duì)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R2)見表2。線性相關(guān)系數(shù)均≥0.999 0,在線性范圍內(nèi)線性良好。通過(guò)向燕窩樣品中添加45種激素考察方法的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10),分析目標(biāo)物檢出限和定量限分別為0.04～0.70 μg/kg和0.16～2.00 μg/kg。

表 2 45種激素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及回收率(n=6)

2.3.2準(zhǔn)確度和精密度

分別添加適量混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液至燕窩樣品中,添加水平為2.0(靈敏度最差目標(biāo)物的LOQ)、4.0和20.0 μg/kg,按照本文建立的方法進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)添加回收試驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確度和精密度(n=6),結(jié)果見表2。醛固酮、醋酸氟輕松、氟米龍、布地奈德、炔雌醇的回收率為40.2%～63.6%,其他40種激素的平均加標(biāo)回收率為72.2%～112.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～11.6%, 40種分析目標(biāo)物的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析要求。

在多殘留分析時(shí),涉及的化合物性質(zhì)存在差異,取得統(tǒng)一良好的回收率有一定難度。本研究中醛固酮等5種目標(biāo)物的回收率偏低,但考慮到其定量限分別為1.02、0.48、0.96、0.48、0.96 μg/kg,根據(jù)最低回收率折算(LOQ×40.2%),檢出值分別為0.41、0.19、0.39、0.19、0.39 μg/kg,均高于5種化合物的檢出限0.31、0.10、0.32、0.14、0.30 μg/kg,故本方法不會(huì)造成假陰性,可對(duì)醛固酮等5種目標(biāo)物進(jìn)行定性分析。如需準(zhǔn)確定量可以考慮使用同位素內(nèi)標(biāo)、基質(zhì)匹配、標(biāo)準(zhǔn)加入等方法。

2.4 燕窩中激素含量

2.4.1燕窩中激素含量情況

2017～2021年期間,采用本文建立的方法對(duì)1 021個(gè)樣品進(jìn)行了測(cè)定,僅勃地酮、雄烯二酮、孕酮有檢出(測(cè)定值≥LOD),其他激素水平均小于檢出限。勃地酮、雄烯二酮與孕酮有檢出的樣品個(gè)數(shù)分別為807個(gè)(檢出比率79%)、909個(gè)(檢出比率89%)、1 021個(gè)(檢出率為100%),測(cè)定值范圍分別為0～0.096、0～1.77、0.097～3.58 μg/kg。將檢出的測(cè)定值分成5等,統(tǒng)計(jì)每一等所占比例,結(jié)果見圖2。檢出的結(jié)果中,所有樣品中勃地酮測(cè)定值均<0.1 μg/kg; 764個(gè)樣品中雄烯二酮測(cè)定值<1.0 μg/kg; 888個(gè)樣品中孕酮測(cè)定值<1.0 μg/kg。所有樣品中檢出的激素含量均未超過(guò)5 μg/kg。此外,本次研究未檢出國(guó)家或地區(qū)禁止的類固醇激素。

圖 2 燕窩中勃地酮、雄烯二酮和孕酮的含量分布Fig. 2 Content distributions of boldenone, androstenedione, and progesterone in edible bird’s nest (EBN)

2.4.2燕窩中檢出激素的質(zhì)譜解析

勃地酮、雄烯二酮與孕酮的相對(duì)分子質(zhì)量分別為286.4、286.4和314.5，其形成的[M+H]+通過(guò)碰撞池時(shí)發(fā)生裂解生成產(chǎn)物離子,見圖3。勃地酮的[M+H]+丟失一個(gè)H2O,得到m/z為269.1的二級(jí)離子,丟失質(zhì)量數(shù)為152(C10H16O)的中性碎片,得到m/z為135.0的二級(jí)離子,丟失質(zhì)量數(shù)為166(C11H18O)的中性碎片,得到m/z為121.0的二級(jí)離子。雄烯二酮的[M+H]+丟失一個(gè)H2O,得到m/z為269.2的二級(jí)離子,丟失質(zhì)量數(shù)為178(C12H18O)的中性碎片,得到m/z為109.1的二級(jí)離子,丟失質(zhì)量數(shù)為190(C13H18O)的中性碎片,得到m/z為97.1的二級(jí)離子。孕酮的[M+H]+丟失一個(gè)H2O,得到m/z為297.3的二級(jí)離子,丟失質(zhì)量數(shù)為206(C14H22O)的中性碎片,得到m/z為109.0的二級(jí)離子,丟失質(zhì)量數(shù)為218(C15H22O)的中性碎片,得到m/z為97.0的二級(jí)離子。

圖 3 勃地酮、雄烯二酮、孕酮的二級(jí)碎片質(zhì)譜圖和裂解示意圖Fig. 3 Secondary fragment ion mass spectra and fragmentation schematics of boldenone, androstenedione, and progesterone

2.4.3燕窩、乳制品與雞蛋中激素水平比較分析

隨著人類活動(dòng)范圍越來(lái)越大,人工合成激素被大量使用并通過(guò)環(huán)境傳播或食物鏈富集導(dǎo)致食品污染，即便在非直接接觸的食品中亦可檢出其存在，且通過(guò)食品加工措施并不能改變其含量和性質(zhì),直接或間接影響到人體生理代謝。

本研究按GB/T 21981-2008方法對(duì)市售的16批純牛奶、70批乳制品以及15批雞蛋中的勃地酮、雄烯二酮和孕酮進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表3。 勃地酮在4類產(chǎn)品中的含量差別不大，均為微量；15批雞蛋中均檢出雄烯二酮，含量比其他3類產(chǎn)品略高；孕酮含量在雞蛋中最高，其次是純牛奶，燕窩中含量最低，部分乳制品中未檢出，可能是產(chǎn)品含乳量低的原因。

表 3 不同動(dòng)物源食品中勃地酮、雄烯二酮和孕酮的含量

以檢出的3種激素中含量最高的孕酮的平均含量進(jìn)行分析,常人每人每天燕窩食用量為5 g[36],雞蛋為40～50 g[37],牛奶為300 g[37],根據(jù)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法[38],估算出每人每天孕酮的攝入量為牛奶(3.54 μg/d)>雞蛋(1.09 μg/d)>燕窩(0.003 0 μg/d),由此可知食用燕窩時(shí)激素的攝入量遠(yuǎn)低于食用牛奶或雞蛋時(shí)激素的攝入量，對(duì)健康的影響較小。

3 結(jié)論

本文建立了燕窩中45種激素的HPLC-MS/MS分析方法,對(duì)醛固酮、醋酸氟輕松、氟米龍、布地奈德、炔雌醇可進(jìn)行定性分析,對(duì)其他40種激素可進(jìn)行定性定量分析。該方法的線性范圍、檢出限、回收率及精密度等方法學(xué)指標(biāo)均滿足燕窩中40種激素的定性定量分析要求,且方法簡(jiǎn)便快速,溶劑用量少,激素檢測(cè)的種類廣、數(shù)量多,可望為燕窩中激素的監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供方法學(xué)基礎(chǔ)。采用本研究建立的方法對(duì)燕窩中激素進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果表明燕窩中激素含量水平低于蛋與乳制品,對(duì)健康影響較小。