4-芳基-3-羥基異噻唑衍生物的合成與生物活性研究

周聰偉，林義峰，郭林朝，肖 勝，巨修練，劉根炎

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430205)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是動物神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過作用于GABA受體(離子型和代謝型)而發(fā)揮生理功能[1-3]。離子型GABA受體(以下GABA受體均指離子型)屬于一種配體門控氯離子通道，被GABA激活后通道打開，氯離子流入細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生抑制效應(yīng)[4-5]。GABA受體是殺蟲劑重要的作用靶標(biāo)之一，也是目前綠色農(nóng)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[6-7]。

GABA受體可被多種類型的小分子配體拮抗，根據(jù)作用機(jī)制不同，一般可分為非競爭性拮抗劑(noncompetitive antagonists,NCAs)和競爭性拮抗劑(competitive antagonists,CAs)[7-8]。NCAs可直接影響氯離子通道的開放，阻滯氯離子內(nèi)流，使神經(jīng)興奮不能得到有效抑制，最終導(dǎo)致昆蟲死亡[9-11]。目前靶向GABA受體的商用殺蟲劑均為NCAs。傳統(tǒng)的GABA受體NCAs類殺蟲劑如林丹和氟蟲腈等，在20世紀(jì)末期被廣泛使用，但由于對環(huán)境存在安全隱患，多數(shù)已被禁用或限制使用[12-14]。近年來，新型的NCAs類殺蟲劑，如氟雷拉納和溴蟲氟苯雙酰胺等被相繼報(bào)道，其作用位點(diǎn)可能位于受體跨膜段的一個獨(dú)特區(qū)域，有別于傳統(tǒng)的NCAs類殺蟲劑[15-16]。研究表明，氟雷拉納和溴蟲氟苯雙酰胺對抗性昆蟲活性高，且對非靶標(biāo)生物的安全性好[17-18]，作為綠色高效的農(nóng)用殺蟲劑具有廣闊的開發(fā)前景。

作者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲GABA受體CAs可與激動劑競爭同一結(jié)合位點(diǎn)從而調(diào)節(jié)GABA受體的功能，表現(xiàn)出一定的殺蟲活性[19-20]，有潛力開發(fā)為作用機(jī)制新穎的新型殺蟲劑，克服昆蟲對現(xiàn)有NCAs類殺蟲劑的抗性問題[21]。3-羥基異噻唑作為一種獨(dú)特的雜環(huán)小分子，具有豐富的生物活性[22]，在異噻唑環(huán)上引入不同取代基或構(gòu)造雙環(huán)，會大幅改變其藥理活性。課題組前期研究證明，3-羥基異噻唑是設(shè)計(jì)昆蟲GABA受體CAs的有效骨架結(jié)構(gòu)之一，通過結(jié)構(gòu)修飾所得部分衍生物對昆蟲GABA受體的拮抗作用較為顯著[23-24]。在此基礎(chǔ)上，作者通過兩步法[25]合成原料3-羥基異噻唑，對異噻唑環(huán)3位羥基進(jìn)行保護(hù)后，通過N-碘代丁二酰亞胺(NIS)在4位引入碘，隨后采用Suzuki-Miyaura偶聯(lián)反應(yīng)引入芳基，最后在強(qiáng)酸性條件下脫保護(hù)合成一系列4-芳基-3-羥基異噻唑衍生物，通過1HNMR、13CNMR和HRMS對目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并測試目標(biāo)化合物的昆蟲GABA受體抑制活性及殺蟲活性，以期發(fā)現(xiàn)活性較高的昆蟲GABA受體CAs，為探尋新型殺蟲劑的先導(dǎo)化合物提供更多理論依據(jù)。合成路線如圖1所示。

圖1 4-芳基-3-羥基異噻唑衍生物的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

溴芐、無水碳酸鉀、N-碘代丁二酰亞胺(NIS)、五水合硫代硫酸鈉、無水硫酸鈉、四(三苯基膦)鈀、3-噻吩硼酸、3-聯(lián)苯硼酸、4-聯(lián)苯硼酸、1-萘硼酸、2-萘硼酸、4-甲氧基苯硼酸、溴化氫醋酸溶液、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、1,4-二氧六環(huán)、氨水、乙酸乙酯(EA)、石油醚(PE,60～90 ℃)、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)、Sigma-Aldrich公司等；層析柱純化用200～300目硅膠；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

400/54 Premium Shielded型核磁共振波譜儀，安捷倫科技股份有限公司；Thermo LTQ XL型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher公司。

1.2 材料

昆蟲GABA受體抑制活性測試：供試品為6個目標(biāo)化合物，溶劑為DMSO，待測對象為斜紋夜蛾(Spodopteralitura)和家蠅(Muscadomestica)，雌性非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母細(xì)胞，無Ca2+卵母細(xì)胞培養(yǎng)液[100 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH值7.6]，無菌標(biāo)準(zhǔn)卵母細(xì)胞培養(yǎng)液(100 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1KCl，1.8 mmol·L-1CaCl2，1 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1HEPES，0.1%間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，2 mg·mL-1膠原酶，50 μg·mL-1慶大霉素，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素，2.5 mmol·L-1丙酮酸鈉，pH值7.6)，納升微量注射系統(tǒng)。

殺蟲活性測試：供試品為6個目標(biāo)化合物，溶劑為DMSO，待測對象為3齡斜紋夜蛾幼蟲，所用人工飼料在實(shí)驗(yàn)室配制，其配方為：黃豆粉450 g，麥胚粉250 g，酵母80 g，干酪素40 g，對羥基甲酸酯15 g，膽固醇0.6 g，肌醇0.7 g，山梨酸6.0 g，氯化膽堿3.0 g，抗壞血酸14 g，甲醛3 mL，滅菌蒸餾水2 800 mL。

1.3 目標(biāo)化合物的合成

1.3.1 中間體3-芐氧基異噻唑(Ⅰ)的合成

在冰浴條件下依次將3-羥基異噻唑(2.02 g，20.0 mmol)、無水碳酸鉀(4.15 g，30.0 mmol)和DMF(30 mL)加入100 mL單口瓶中，攪拌均勻后，緩慢滴加溴芐(3.76 g，22.0 mmol)，滴完6 h后撤除冰浴，室溫繼續(xù)反應(yīng)12 h；加入去離子水100 mL淬滅，用EA萃取(80 mL×2)，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌(60 mL×2)，用適量無水硫酸鈉干燥后抽濾，減壓濃縮。粗產(chǎn)品經(jīng)層析柱純化(洗脫劑為PE-EA，體積比40∶1)，得無色油狀液體中間體Ⅰ3.28 g，產(chǎn)率85.7%。

1.3.2 中間體4-碘-3-芐氧基異噻唑(Ⅱ)的合成

依次將中間體Ⅰ(1.91 g，10.0 mmol)、NIS(4.50 g，20 mmol)和乙腈(20 mL)加入50 mL單口瓶中，65 ℃下攪拌36 h；加入飽和硫代硫酸鈉溶液40 mL淬滅，用EA萃取(40 mL×2)，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌(30 mL×2)，用適量無水硫酸鈉干燥后抽濾，減壓濃縮。粗產(chǎn)品經(jīng)層析柱純化(洗脫劑為PE-EA，體積比30∶1)，得無色油狀液體中間體Ⅱ2.54 g，產(chǎn)率80.0%。

1.3.3 中間體4-芳基-3-芐氧基異噻唑(Ⅲa～Ⅲf)的合成

依次將中間體Ⅱ(1.27 g，4.0 mmol)、芳基硼酸(4.0 mmol)、四(三苯基膦)鈀(0.12 g，0.1 mmol)、無水碳酸鉀(0.83 g，6.0 mmol)、1,4-二氧六環(huán)(15 mL)和去離子水(5 mL)加入100 mL雙口瓶中，將裝置通氬氣5 min以排凈空氣，隨后升溫至95 ℃，攪拌8 h；加入去離子水40 mL，用EA萃取(40 mL×2)，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌(30 mL×2)，用適量無水硫酸鈉干燥后抽濾，減壓濃縮。粗產(chǎn)品經(jīng)層析柱純化(洗脫劑為PE-EA，體積比1∶2)，得中間體Ⅲa～Ⅲf，產(chǎn)率73.7%～83.7%。

4.事件發(fā)生的必然性。“冰凍三尺，非一日之寒”，群體性公共事件的突發(fā)并非是偶然的，其大多屬于“能量積累型”，當(dāng)事件累積到其所能承受的臨界點(diǎn)時(shí)就會突然引爆。一般在群體性公共事件發(fā)生之前，社會周遭輕微躁動已初見端倪，當(dāng)問題累積的愈多或問題久拖不決，這種躁動跡象則會愈明顯。如果忽視周圍環(huán)境產(chǎn)生的這些預(yù)兆，或阻斷民眾搜集消息的來源，最終會導(dǎo)致事件一觸即發(fā)，大規(guī)模、突發(fā)性群體性公共事件的發(fā)生也就不可避免。

1.3.4 目標(biāo)化合物4-芳基-3-羥基異噻唑(Ⅳa～Ⅳf)的合成

依次將中間體Ⅲa～Ⅲf(3.0 mmol)和質(zhì)量濃度為33%的溴化氫醋酸溶液(18 mL)加入50 mL單口瓶中，常溫?cái)嚢?2 h；緩慢滴加20 mL去離子水，再滴加質(zhì)量濃度為25%的氨水，直到無氣泡產(chǎn)生；所得溶液用EA萃取(60 mL×2)，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌(40 mL×2)，用適量無水硫酸鈉干燥后抽濾，減壓濃縮。粗產(chǎn)品經(jīng)層析柱純化(洗脫劑為PE-EA-MeOH，體積比10∶10∶1)，真空干燥，得目標(biāo)化合物Ⅳa～Ⅳf。

1.4 昆蟲GABA受體抑制活性測試

采用電生理法測試目標(biāo)化合物在100 μmol·L-1濃度下對斜紋夜蛾和家蠅GABA受體的抑制率。以斜紋夜蛾和家蠅GABA受體RDLbd亞基的cDNA為模板，通過聚合酶試劑盒(mMESSAGE mMACHINETMT7 Ultra Kit;Ambion,Austin,TX,USA)合成并純化得到受體亞基的cRNA。利用納升微量注射系統(tǒng)，將cRNA注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，每個細(xì)胞5 ng，培養(yǎng)48 h。確認(rèn)受體成功表達(dá)后，通過雙電極電壓鉗技術(shù)測定目標(biāo)化合物對斜紋夜蛾和家蠅GABA受體的抑制活性。

1.5 殺蟲活性測試

配制目標(biāo)化合物濃度分別為100 mg·kg-1和500 mg·kg-1的有毒飼料，分別加入2個6孔板中，每孔0.5 g。將大小一致且生長健康的3齡斜紋夜蛾幼蟲接入孔中，每孔10只，每隔24 h更換一次有毒飼料；48 h后，觸碰所有蟲體，將無任何反應(yīng)的受試蟲計(jì)入死亡數(shù)。做3個平行實(shí)驗(yàn)，按下式對死亡率進(jìn)行校正，排除溶劑等因素的干擾。

式中：P為實(shí)驗(yàn)組死亡率；P0為對照組死亡率。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征

4-(3-噻吩基)-3-羥基異噻唑(Ⅳa)：紫色固體，產(chǎn)率78.0%。1HNMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:12.03(s,1H,OH),8.99(s,1H,CH),7.89(s,1H,ArH),7.65～7.50(m,2H,ArH);13CNMR(100 MHz,DMSO-d6),δ:166.87,144.12,133.18,127.43,126.62,121.85,120.59;HRMS,m/z:calcd for C7H6NOS2[M+H]+183.989 1,found 183.988 5。

4-(3-聯(lián)苯基)-3-羥基異噻唑(Ⅳc)：淡黃色固體，產(chǎn)率70.9%。1HNMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:12.03(s,1H,OH),9.14(s,1H,CH),8.20～7.20(m,9H,ArH);13CNMR(100 MHz,DMSO-d6),δ:166.95,146.27,140.88,140.61,133.49,133.18,129.53,129.40,128.00,127.43,127.26,126.63,126.53,126.09,125.91,124.58;HRMS,m/z:calcd for C15H12NOS [M+H]+254.064 0, found 254.063 4。

4-(2-萘基)-3-羥基異噻唑(Ⅳd)：淡黃色固體，產(chǎn)率72.1%。1HNMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:11.97(s,1H,OH),9.06(s,1H,CH),7.90～7.30(m,7H,ArH);HRMS,m/z:calcd for C13H9NOSNa [M+Na]+250.030 3,found 250.029 7。

4-(1-萘基)-3-羥基異噻唑(Ⅳe)：淡黃色固體，產(chǎn)率77.1%。1HNMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:11.77(s,1H,OH),8.86(s,1H,CH),8.10～7.40(m,7H,ArH);13CNMR(100 MHz,DMSO-d6),δ:167.40,148.66,133.69,131.81,131.13,128.66,128.52,128.26,126.67,126.36,125.90,125.81,124.45;HRMS,m/z:calcd for C13H9NOSNa [M+Na]+250.030 3,found 250.029 7。

4-(4-甲氧基苯基)-3-羥基異噻唑(Ⅳf)：白色固體，產(chǎn)率72.7%。1HNMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:11.88(s,1H,OH),8.87(s,1H,CH),7.68(d,2H,ArH),6.94(d,2H,ArH),3.75(s,3H,CH3);13CNMR(100 MHz,DMSO-d6),δ:166.79,167.18,143.36,128.76,124.89,123.86,116.09,115.63,114.29,55.54;HRMS,m/z:calcd for C10H9NO2SNa [M+Na]+230.025 2,found 230.024 6。

2.2 目標(biāo)化合物對昆蟲GABA受體的抑制活性(表1)

表1 目標(biāo)化合物(100 μmol·L-1)對斜紋夜蛾和家蠅GABA受體的抑制活性

由表1可知，6個目標(biāo)化合物在100 μmol·L-1濃度下對斜紋夜蛾和家蠅GABA受體均表現(xiàn)出一定的抑制活性，其中3-聯(lián)苯衍生物Ⅳc對家蠅GABA受體的抑制活性最高，抑制率為36.9%，遠(yuǎn)高于4-聯(lián)苯衍生物Ⅳb(6.5%)，說明聯(lián)苯環(huán)上取代位置可能對抑制活性有顯著影響；3-聯(lián)苯衍生物Ⅳc對斜紋夜蛾和家蠅GABA受體的抑制活性差別較大，說明其對2種昆蟲受體可能具有一定的選擇性；萘環(huán)上取代位置也對目標(biāo)化合物的抑制活性影響較大，2-萘衍生物Ⅳd對2種昆蟲GABA受體的抑制率較高，其中對斜紋夜蛾GABA受體的抑制率達(dá)到了28.6%，而1-萘衍生物Ⅳe對2種昆蟲GABA受體的抑制活性均很低；3-噻吩衍生物Ⅳa對2種昆蟲GABA受體均表現(xiàn)出相對較高的抑制活性，說明后續(xù)可設(shè)計(jì)和合成更多雜環(huán)取代的衍生物。

2.3 目標(biāo)化合物的殺蟲活性

采用混藥接蟲法測試了6個目標(biāo)化合物分別在100 mg·kg-1和500 mg·kg-1濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的殺蟲活性，結(jié)果見表2。

表2 目標(biāo)化合物在100 mg·kg-1和500 mg·kg-1濃度下對斜紋夜蛾的殺蟲活性

由表2可知，目標(biāo)化合物Ⅳa、Ⅳc和Ⅳd在100 mg·kg-1和500 mg·kg-1濃度下對斜紋夜蛾幼蟲均有一定的殺蟲活性，且對斜紋夜蛾GABA受體的抑制率相對較高(表1)，表明較好的拮抗活性可能是產(chǎn)生殺蟲活性的因素之一；在100 mg·kg-1濃度下，除目標(biāo)化合物Ⅳb外，其它目標(biāo)化合物均對斜紋夜蛾幼蟲表現(xiàn)出不同程度的殺蟲活性，且殺蟲活性并不隨著濃度的升高而顯著升高。

3 結(jié)論

以3-羥基異噻唑?yàn)樵希O(shè)計(jì)并合成了一系列4-芳基-3-羥基異噻唑衍生物，其中，4位單取代的3-羥基異噻唑衍生物對斜紋夜蛾和家蠅GABA受體的抑制活性偏低，僅有少數(shù)衍生物的抑制活性接近中等，這也可能是目標(biāo)化合物對斜紋夜蛾幼蟲表現(xiàn)出較低殺蟲活性的原因之一?；诖?，認(rèn)為對3-羥基異噻唑環(huán)在4位進(jìn)行單取代或芳環(huán)修飾不能顯著提高該類化合物的活性，可能還需引入含氮雜環(huán)或同時(shí)在5位引入其它基團(tuán)。該研究為昆蟲GABA受體新型CAs的設(shè)計(jì)提供了重要信息和理論依據(jù)。