生物表面活性劑產(chǎn)生菌的誘變育種及特性研究

吳從文，劉曉麗，鐘世坤，馬艷清，裴 帥

(1.中國石油新疆油田分公司陸梁油田作業(yè)區(qū)，新疆 克拉瑪依 834000；2.中國石油新疆油田分公司實(shí)驗(yàn)檢測研究院，新疆 克拉瑪依 834000；3.中國石油集團(tuán)川慶鉆探工程有限公司國際工程公司，四川 成都 610000)

生物表面活性劑是微生物或植物在一定條件下培養(yǎng)時(shí)，在代謝過程中分泌的一種具有一定表界面活性、集親水基和疏水基結(jié)構(gòu)于一分子內(nèi)部的兩親化合物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性類脂衍生物等[1]。生物表面活性劑無毒，可以生物降解，對(duì)環(huán)境影響很小，熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性較好，具有高效的表面活性，是合成表面活性劑的理想替代品，受到研究者的廣泛關(guān)注[2]。生物表面活性劑能增大石油烴類物質(zhì)在水相中的溶解度，降低表面張力，在石油采收和生物修復(fù)環(huán)境污染等方面具有巨大的應(yīng)用潛力[3]。研究和開發(fā)生物表面活性劑的應(yīng)用價(jià)值和潛力、優(yōu)化發(fā)酵方法和降低發(fā)酵成本、篩選和培育生物表面活性劑高產(chǎn)菌株是當(dāng)前主要的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向[4]。

生物表面活性劑的合成方法主要有微生物發(fā)酵法、酶合成法、天然生物提取法等[5-6]。其中通過微生物發(fā)酵法可以在不同的條件下得到不同類型的生物表面活性劑，在技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上非常適合批量生產(chǎn)[7]。微生物在發(fā)酵過程中，使用的菌種一般生長較慢，并且容易出現(xiàn)菌種退化的現(xiàn)象，因此需要通過自然或誘變選育來保持菌種的優(yōu)良性能，防止菌種退化，同時(shí)進(jìn)一步提高菌種的正突變率[8]。常見的誘變方法有紫外誘變、微波誘變、化學(xué)誘變等，由于微生物突變生理生化反應(yīng)復(fù)雜，單一誘變往往難以篩選到優(yōu)良菌株，因此，多采用復(fù)合誘變使菌株發(fā)生較大的突變，進(jìn)而篩選出優(yōu)良菌株以提高生物表面活性劑的產(chǎn)量[9]。Zouari等[10]從石油污染土壤中篩選出假單胞菌(Pseudomonassp.)，該菌株所產(chǎn)生物表面活性劑在高鹽度(10%)、高pH值(6～12)、高溫(80 ℃)時(shí)依然能夠保持較高的活性，同時(shí)可以降解柴油。張卉等[11]以NTG為誘變劑對(duì)出發(fā)菌株P(guān)seudomonasaeruginosaJZ-5進(jìn)行誘變處理，以發(fā)酵液排油圈直徑和生物表面活性劑產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，選育出高產(chǎn)且遺傳穩(wěn)定的突變菌株NTG-6，其排油圈直徑為6.7 cm，生物表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到40.83 g·L-1，較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了50.84%。門欣等[12]篩選到一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌PseudomonasaeruginosaBQ11，在15 W紫外燈下38 cm處誘變60 s后，獲得一株正突變率達(dá)28%的生物表面活性劑高產(chǎn)菌株UBQ11-4，糖脂產(chǎn)量從5.3 g·L-1提高到6.8 g·L-1，并且突變菌株UBQ11-4所產(chǎn)生物表面活性劑的特性(乳化性能和臨界膠束濃度)優(yōu)于出發(fā)菌株。陳利娟等[13]對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變(ARTP)，選育出一株高產(chǎn)突變菌株P(guān)seudomonasaeruginosaSC-11，其鼠李糖脂產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了74.1%。沈薇等[14]采用紫外誘變和紫外+氯化鋰復(fù)合誘變對(duì)PseudomonasaeruginosaBS-03菌株進(jìn)行誘變，篩選出一株生物表面活性劑高產(chǎn)菌株LY4，可將鼠李糖脂產(chǎn)量由4.1 g·L-1提高到6.8 g·L-1。

作者以新疆油田油井采出液中分離得到的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69為出發(fā)菌株，采用紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變的方法對(duì)菌株FC-69進(jìn)行種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)；以發(fā)酵液的排油圈直徑和生物表面活性劑產(chǎn)量為考核指標(biāo)，進(jìn)一步篩選生物表面活性劑高產(chǎn)菌株，并對(duì)其特性進(jìn)行研究，為豐富生物表面活性劑高產(chǎn)菌種資源和提高生物表面活性劑產(chǎn)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與儀器

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69，分離自新疆油田油井采出液中，保存于克拉瑪依市新奧達(dá)石油技術(shù)服務(wù)有限公司。

紫外燈(30W/5A)，中國四通特種電光源；JA2103N型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；LDZM-80KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；HC-1014型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；A101型全自動(dòng)表面張力儀，美國科諾工業(yè)有限公司；BCD-205HK型電冰箱，廣東海信容聲冰箱有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；SW-CS-2F型凈化工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

平板(斜面)培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖3.0，蛋白胨8.0，酵母膏3.0，磷酸二氫鉀2.7，氯化鈉5.0，瓊脂20.0。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉膏2.0，氯化鈣0.05，磷酸氫二鉀2.0，葡萄糖10.0，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀2.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20.0，硝酸銨3.0，磷酸氫二鉀1.5，硫酸鎂0.1，硫酸鐵0.01。

1.3 菌懸液的制備

刮取活化的FC-69菌株，于30 ℃、200 r·min-1搖瓶培養(yǎng)12 h后收集菌液，4 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，加入無菌生理鹽水，置于漩渦振蕩器上振蕩20 s使菌體混合均勻，用雙層無菌脫脂棉紗布過濾，即得菌懸液，用生理鹽水稀釋使菌濃為106個(gè)·mL-1左右，備用。

1.4 高產(chǎn)菌株的誘變選育

1.4.1 紫外誘變時(shí)間的選擇[15]

吸取5 mL菌懸液于無菌玻璃平皿，置于30 W紫外燈下15 cm處照射(紫外燈提前預(yù)熱30 min)；每隔一定時(shí)間(15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、115 s)吸取照射過的菌懸液，稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基上，以未經(jīng)紫外燈照射的菌懸液作為對(duì)照，用黑紙包裹后置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；觀察平板上的菌落數(shù)，按式(1)計(jì)算致死率，確定合適的紫外誘變時(shí)間。

(1)

取菌懸液，按上述方法紫外誘變合適時(shí)間，分別挑取形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌落經(jīng)種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑；挑選排油圈直徑>3 cm的菌落進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵后再次測定排油圈直徑，平行測定3次，取平均值[16]。根據(jù)排油圈直徑增幅計(jì)算正突變率：

(2)

1.4.2 亞硝基胍濃度的選擇[17]

將菌懸液按1.4.1方法紫外誘變合適時(shí)間，稀釋后涂布于含不同濃度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)亞硝基胍的平板培養(yǎng)基上，以未涂布亞硝基胍的培養(yǎng)基作為對(duì)照，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；觀察平板上的菌落數(shù)，計(jì)算致死率，確定合適的亞硝基胍濃度。

取菌懸液，按上述方法紫外誘變合適時(shí)間后涂布在含合適濃度亞硝基胍的平板培養(yǎng)基上，分別挑取形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌落經(jīng)種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑。

1.4.3 高產(chǎn)菌株的篩選及遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取菌懸液，在確定的最佳條件下進(jìn)行紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變，篩選生物表面活性劑高產(chǎn)菌株。將最終篩選的高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，檢測生物表面活性劑產(chǎn)量，分析其高產(chǎn)性能的遺傳穩(wěn)定性。

1.5 高產(chǎn)菌株的特性研究

將篩選的高產(chǎn)菌株經(jīng)一級(jí)種子培養(yǎng)成熟后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)4 d，每12 h取樣測定菌體密度(OD值)、表面張力、乳化值和生物表面活性劑產(chǎn)量。

采用濁度法測定菌體密度[16]；采用表面張力儀測定發(fā)酵液的表面張力，平行測定3次，取平均值[18]；采用超聲體積比法測定乳化值[19]；生物表面活性劑產(chǎn)量測定方法：將發(fā)酵液pH值調(diào)至8.0，6 000 r·min-1離心20 min，上清液用超濾膜過濾，濾液于40 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原體積的20%，再將濃縮液pH值調(diào)至2.0，于4 ℃下靜置12 h，于4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀物(生物表面活性劑粗提物)[11]，稱重。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變時(shí)間的確定

FC-69菌株在紫外誘變不同時(shí)間后，稀釋涂布于平板培養(yǎng)基上，計(jì)算致死率，結(jié)果見表1。

表1 FC-69菌株在紫外誘變不同時(shí)間后的致死率

由表1可知，隨著紫外誘變時(shí)間的延長，菌落數(shù)逐漸減少，F(xiàn)C-69菌株的致死率逐漸升高；0～75 s內(nèi)致死率快速升高，75 s之后致死率升幅趨緩。紫外誘變60 s時(shí)，致死率為88.98%；紫外誘變90 s時(shí)，僅長出1個(gè)菌落，致死率達(dá)到99.21%；紫外誘變115 s時(shí)，菌株已無法生長。通過前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，致死率一般在80%左右時(shí)正突變率較高，因此，選擇紫外誘變時(shí)間為60 s。

2.2 紫外誘變排油圈直徑測定結(jié)果

FC-69菌株紫外誘變60 s后，通過培養(yǎng)共篩選出52個(gè)形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌落，經(jīng)過種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑，結(jié)果見表2。

表2 FC-69菌株紫外誘變后的排油圈直徑測定結(jié)果

由表2可知，F(xiàn)C-69菌株經(jīng)紫外誘變后，排油圈直徑基本呈正態(tài)分布。排油圈直徑在5.0～5.9 cm的菌落最多，有16個(gè)，其次是在4.0～4.9 cm的，有12個(gè)；排油圈直徑大于3.0 cm的菌落有47個(gè)，占菌落總數(shù)的90.38%；排油圈直徑大于7.0 cm的菌落有2個(gè)，占菌落總數(shù)的3.85%；排油圈直徑大于出發(fā)菌株FC-69的有9個(gè)，占菌落總數(shù)的17.31%，其中最大的達(dá)到7.2 cm，較出發(fā)菌株提高了16.13%。

2.3 亞硝基胍濃度的確定

FC-69菌株紫外誘變60 s后，稀釋涂布于含有不同濃度亞硝基胍的平板培養(yǎng)基上，計(jì)算致死率，結(jié)果見表3。

表3 FC-69菌株在復(fù)合誘變后的致死率

由表3可知，隨著亞硝基胍濃度的增加，菌落數(shù)逐漸減少，F(xiàn)C-69菌株的致死率逐漸升高；當(dāng)亞硝基胍濃度為0.5%時(shí)，僅長出1個(gè)菌落；當(dāng)亞硝基胍濃度為0.6%時(shí)，菌株已不能生長，這也是菌株對(duì)亞硝基胍的耐受臨界濃度。因此，選擇0.4%的亞硝基胍對(duì)FC-69菌株進(jìn)行復(fù)合誘變。

2.4 復(fù)合誘變排油圈直徑測定結(jié)果

FC-69菌株紫外誘變60 s后，稀釋涂布于含有0.4%亞硝基胍的平板培養(yǎng)基上，通過培養(yǎng)共篩選出55個(gè)形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌落，經(jīng)過種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑，結(jié)果見表4。

表4 FC-69菌株復(fù)合誘變后的排油圈直徑測定結(jié)果

由表4可知，F(xiàn)C-69菌株經(jīng)復(fù)合誘變后，排油圈直徑在5.0～5.9 cm的菌落最多，有14個(gè)；排油圈直徑大于7.0 cm的菌落有3個(gè)，占菌落總數(shù)的5.45%；排油圈直徑大于出發(fā)菌株FC-69的有10個(gè)，占菌落總數(shù)的18.18%，其中最大的達(dá)到7.35 cm，較出發(fā)菌株提高了18.55%。

2.5 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性

在紫外誘變時(shí)間為60 s、亞硝基胍濃度為0.4%的條件下對(duì)FC-69菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，挑選6個(gè)排油圈直徑較大的菌落進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑和生物表面活性劑產(chǎn)量，結(jié)果見表5。

表5 高產(chǎn)菌株的篩選

由表5可知，F(xiàn)C-69-52菌株的排油圈直徑達(dá)到7.12 cm，生物表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到42.86 g·L-1，分別較出發(fā)菌株FC-69提高了14.84%和19.06%。

對(duì)高產(chǎn)菌株FC-69-52進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：該菌株在傳代1～5代后的生物表面活性劑產(chǎn)量分別為：42.31 g·L-1、41.92 g·L-1、42.56 g·L-1、42.19 g·L-1、42.03 g·L-1，變化不大，說明復(fù)合誘變選育的高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

2.6 高產(chǎn)菌株的特性(圖1)

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液表面張力呈先降低后升高的變化趨勢，菌體密度、乳化值、生物表面活性劑產(chǎn)量則呈先升高后降低的變化趨勢。發(fā)酵0～48 h，較強(qiáng)的疏水性能增加了高產(chǎn)菌株FC-69-52與環(huán)境有機(jī)物的接觸機(jī)會(huì)，菌體密度顯著上升，發(fā)酵液表面張力大幅下降，并產(chǎn)生大量的生物表面活性劑；發(fā)酵48 h，發(fā)酵液表面張力降至最低(27.05 mN·m-1)，生物表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到最高(42.21 g·L-1)，乳化值也達(dá)到最高(65.68%)；發(fā)酵60 h后，高產(chǎn)菌株FC-69-52生長進(jìn)入衰亡期，菌體密度開始緩慢下降，發(fā)酵液表面張力維持在30.00 mN·m-1左右，乳化值和生物表面活性劑產(chǎn)量緩慢下降，但整體穩(wěn)定性良好，說明菌株FC-69-52所產(chǎn)生物表面活性劑對(duì)油水界面的親和力更強(qiáng)，可使乳化相在96 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖1 高產(chǎn)菌株FC-69-52的特性

3 結(jié)論

以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變，篩選得到了一株生物表面活性劑高產(chǎn)菌株FC-69-52，其排油圈直徑達(dá)到7.12 cm、生物表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到42.86 g·L-1，分別較出發(fā)菌株提高了14.84%和19.06%。該高產(chǎn)菌株發(fā)酵48 h，生物表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到42.21 g·L-1，乳化值達(dá)到65.68%，發(fā)酵液表面張力降至27.05 mN·m-1，對(duì)油水界面的親和力更強(qiáng)，可使乳化相在96 h內(nèi)保持穩(wěn)定，可作為優(yōu)良高產(chǎn)菌株保存使用。該研究為微生物發(fā)酵法產(chǎn)生物表面活性劑的工業(yè)化提供了優(yōu)質(zhì)菌種資源和發(fā)酵工藝指導(dǎo)。