雛雞性別與蛋殼鈣含量和顯微結(jié)構(gòu)的相關(guān)性研究

劉韜虞，邊胤豪，王宇，吳紅翔，黃靖，王甜，徐靜若，黃宗玲

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

我國家禽養(yǎng)殖已有5 000多年歷史。自20世紀(jì)80年代以來,取得快速發(fā)展，正在向標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)代化生產(chǎn)邁進(jìn)[1～2]。在種蛋的孵化過程中人們不僅關(guān)心雛雞的數(shù)量和質(zhì)量，而且更多希望孵出母雞，少出公雞，從而提高生產(chǎn)效益。雛公雞由于沒有蛋用價(jià)值、生長速度慢，剛出殼就被淘汰，從而引起了一些社會(huì)人士對(duì)動(dòng)物福利的擔(dān)憂。如果能通過某些手段鑒定性別，使雛雞性別在發(fā)育不久的某個(gè)特定階段就被鑒定出來，被提前篩選，終止孵化。這樣既能避免上述問題，又能定向獲取所需性別的雛雞，從而降低成本，獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。因此雞性別的控制在現(xiàn)代養(yǎng)雞生產(chǎn)中有重要意義，然而目前仍沒有較好的方法實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)[3]。本試驗(yàn)主要研究海蘭灰蛋雞公母胚蛋蛋殼在顯微結(jié)構(gòu)和鈣成分含量的差別，旨在為家禽胚蛋蛋殼檢測鑒定性別的研究提供更多參考。

1 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采集在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)了360d的海蘭灰蛋雞孵出雛雞后的蛋殼，通過骨骼切片制作方法，固定、脫鈣軟化后制成石蠟切片，HE染色后在顯微鏡下觀察，比較孵出公雞和孵出母雞的胚蛋蛋殼顯微組織結(jié)構(gòu)間的差別；同時(shí)將蛋殼高溫灼燒成灰分后，采用高錳酸鉀滴定法，測定灰分中鈣的含量，比較孵出公雞和孵出母雞的胚蛋蛋殼鈣含量的差異，統(tǒng)計(jì)分析海蘭灰蛋雞出殼后公母胚蛋蛋殼間的差別。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS 25軟件進(jìn)行分析。

2 試驗(yàn)步驟

2.1 蛋殼切片制作

挑選公母雛的胚蛋蛋殼各8個(gè)。將所有蛋殼放入75%的酒精中消毒殺菌，每個(gè)蛋殼分別取鈍、中、銳端3部分，并去除內(nèi)殼膜。按Bouin氏液配方配置溶液[4]，裝入包埋盒，固定24h。按脫鈣液配方配置脫鈣液[5]，將固定完后的蛋殼組織脫鈣軟化24h，洗滌后進(jìn)行脫水和透蠟，完成包埋后進(jìn)行染色，切片。封片后將切片放在顯微鏡下觀察蛋殼的顯微結(jié)構(gòu)并使用電腦拍照軟件拍照。

2.2 蛋殼中鈣含量的測定

挑選公母雛的胚蛋蛋殼各6個(gè)，將帶殼膜的蛋殼放進(jìn)粉碎機(jī)中粉碎。干燥后取出，在電爐上碳化，再放入馬福爐中灼燒。用高錳酸鉀滴定法測出蛋殼中的鈣含量。

3 結(jié)果

3.1 蛋殼組織切片脫鈣后HE染色結(jié)果

由圖1可見，公雛的胚蛋變化明顯：鈍端的殼形在脫鈣、包埋、染色等處理之后，圓弧度形態(tài)變?yōu)橹本€形，深色的晶體層多為卟啉物質(zhì)，分離或斷裂或不見，致密的柵狀層也散在斷開，與厚厚的乳頭層端間隙大，棕紅色乳頭層的結(jié)構(gòu)也松弛。相對(duì)于公雛胚蛋，母雛胚蛋殼保持著一定的完整性和彈性，組織結(jié)構(gòu)依然可見，晶體層、柵狀層、乳頭層之間層次有序，沒有分離與分枝，結(jié)構(gòu)細(xì)致結(jié)實(shí)。

圖1 公母雛胚蛋蛋殼鈍端結(jié)構(gòu)差異比較（40×10倍）

由圖2可見，公雛胚蛋中端的殼形在脫鈣、包埋、染色等處理之后，大多圓弧度形態(tài)依然變?yōu)橹本€形或淺弧度形態(tài)，深色的晶體層公雛蛋殼第1張可見，其它已經(jīng)散開或點(diǎn)狀存在或斷裂或不見，致密的柵狀層也散在斷開，分布在厚厚的乳頭層邊上，內(nèi)殼膜網(wǎng)狀層僅見點(diǎn)狀殘跡，棕紅色乳頭層的結(jié)構(gòu)與母雛胚蛋殼沒有太多差異。相對(duì)于公雛胚蛋，母雛胚蛋殼大數(shù)依然保持著一定的完整性、層次性和彈性，組織結(jié)構(gòu)依然可見，晶體層、柵狀層、乳頭層之間層次有序，少數(shù)也有分離分枝。

圖2 公母雛胚蛋蛋中端蛋殼結(jié)構(gòu)差異比較（40×10倍）

由圖3可見，公雛胚蛋銳端的殼形在脫鈣、包埋、染色等處理之后，大多圓弧度形態(tài)依然保持弧度形態(tài)，一部份厚厚的乳頭層不見了，可能是其中的大量碳酸鈣、碳酸鎂、多種微量元素在處理中因松弛脫落，其它部分保持了完整性。母雛胚蛋殼大數(shù)依然保持著一定的完整性、層次性和彈性，組織結(jié)構(gòu)依然可見，晶體層?xùn)艩顚尤轭^層之間層次有序，少數(shù)也有分離與分枝。公胚蛋殼的乳頭層厚于母胚蛋。

圖3 公母雛胚蛋銳端蛋殼結(jié)構(gòu)差異比較（40×10倍）

通過將公母雛胚蛋蛋殼鈍端、中端、銳端的HE染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)比觀察，發(fā)現(xiàn)公母雛胚蛋蛋殼顯微結(jié)構(gòu)的存在差別。母雛胚蛋蛋殼組織表面晶體層緊致且較清晰，公雛胚蛋不明顯且有間斷；母雛胚蛋殼清晰，乳突顆粒連接更緊密。說明蛋殼基質(zhì)部母雛胚蛋結(jié)實(shí)。公雛胚蛋殼的乳頭層厚于母雛胚蛋，說明公雛胚蛋的厚度大。

3.2 公母雛胚蛋蛋殼鈣含量

從表1可知孵出公雛的胚蛋蛋殼和孵出母雛的胚蛋蛋殼鈣含量差異顯著。

表1 公母雛胚蛋蛋殼鈣含量 %

碳酸鈣是蛋殼的和重要組成部分，蛋殼中還含有多種微量元素，如鋅、銅、錳、鐵等。蛋殼的有機(jī)基質(zhì)由蛋殼膜、乳頭狀核心、蛋殼基質(zhì)和油質(zhì)層組成。公胚蛋殼鈣含量極顯著高于母胚蛋（P＜0.01）。

4 分析討論

蛋殼是一種結(jié)合非常完全的生物鈣，由無機(jī)物和有機(jī)蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)而成，有機(jī)物一般占整個(gè)蛋殼的4%，無機(jī)物占蛋殼的96%左右。無機(jī)物中主要包含碳酸鈣、碳酸鎂、碳酸鈣和碳酸鎂混合物等[6]。

通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比觀察，發(fā)現(xiàn)公母雛胚蛋蛋殼顯微結(jié)構(gòu)的存在差別。母雛胚蛋蛋殼組織表面晶體層緊致且較清晰，公雛胚蛋不明顯且有間斷；公雛胚蛋蛋殼組織乳頭層較母雛胚蛋殼清晰，乳突顆粒連接更緊密，母雛胚蛋組織紋理清晰不厚實(shí)。蛋殼分為三層，厚度一般在300um左右，從內(nèi)至外依次包括乳頭層、柵狀層和晶體層。最里層的乳頭層，大概占蛋殼厚度的1/3，即100um左右。中間層為柵狀層，由鈣質(zhì)纖維交錯(cuò)構(gòu)成，其厚度約占蛋殼厚度的2/3，即200um左右。表皮層是蛋殼最外面的包被部位，厚度一般為10um,主要由含鈣鹽較多的物質(zhì)構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)一般來說不間斷；里層蛋殼為乳頭層，影響著蛋殼的晶體發(fā)育，大多為乳頭狀，具有許多乳狀錐形體，錐體層厚約50um[7～9]。公母雛胚蛋結(jié)構(gòu)差異揭示母禽體內(nèi)相關(guān)激素水平及受精后胚蛋激素水平是影響公母結(jié)構(gòu)差異的主要因素，蛋殼受到某種信息傳遞導(dǎo)致變化，使結(jié)構(gòu)存在差異，同時(shí)后期胚蛋生長發(fā)育中，獲取公母胚吸收蛋殼中養(yǎng)分差異，導(dǎo)致蛋殼中成分的差異。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)公雛胚蛋蛋殼柵欄層、乳頭層厚度高于母雛胚蛋蛋殼。分析其原因是在形成蛋殼的過程中，蛋在子宮液中，而子宮液中有豐富鈣和碳酸根離子，蛋殼鈣化需要它們的不斷供應(yīng)。蛋殼的有機(jī)基質(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖和蛋白聚糖）分泌入子宮液中。因?yàn)樵诿總€(gè)階段具有特定作用的特異蛋白質(zhì)存在于子宮液中，所以有機(jī)基質(zhì)與蛋殼形成過程中的調(diào)控緊密相關(guān)。蛋殼的基底層和柵欄層的蛋白質(zhì)組成差異即這些不同的蛋白質(zhì)譜影響了晶體的生長機(jī)制。在蛋殼發(fā)育過程中基質(zhì)蛋白能夠通過調(diào)節(jié)蛋殼晶體生成來干擾蛋殼鈣化進(jìn)程[10～11]。孵出公雞的蛋殼和孵出母雞的蛋殼內(nèi)的有機(jī)基質(zhì)由于核酸差異（即雄性胚胎DNA比雌性胚胎高約2%[12]），激素成分不同，所以造成蛋殼組織結(jié)構(gòu)和鈣成分含量有差異。公雛胚蛋殼鈣含量極顯著高于母雛胚蛋（P＜0.01），與公雛胚蛋最厚的乳頭層厚度有一定的正相關(guān)性。

5 結(jié)論

不同性別胚蛋蛋殼脫鈣后組織顯微結(jié)構(gòu)與鈣含量存在差異，有關(guān)出殼性別與蛋殼的其他差異關(guān)系有待進(jìn)一步研究。