消癥化瘀灌腸液薄層色譜鑒別研究

劉鳳樂(lè)，羅悠悠，高文全，陳忻宇，王蕊蕊

（云南省大理白族自治州中醫(yī)醫(yī)院，云南 大理 671000）

消癥化瘀灌腸液由黃柏、黃芪、延胡索、丹參、川芎、甘草、當(dāng)歸、敗醬草、魚(yú)腥草等10 余味藥材組方，黃柏為君藥，有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等功效，黃芪、延胡索、丹參、當(dāng)歸、敗醬草等為臣藥，可補(bǔ)氣行氣、活血化瘀、理氣止痛、排膿，配伍魚(yú)腥草、甘草等佐使藥，共奏活血化瘀、清熱利濕、理氣止痛功效，臨床主要用于治療急慢性盆腔炎癥［1］。薄層色譜（TLC）法因重復(fù)性好、對(duì)設(shè)備要求較低、方便易操作等特點(diǎn)常用于中藥復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中定性鑒別研究。本研究中采用TLC法對(duì)制劑中黃柏、黃芪、丹參、延胡索、甘草5 味藥材進(jìn)行了定性鑒別?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PS - 30 型超聲波清洗儀（深圳市潔康洗凈電器有限公司）；SP - Ⅲ型薄層條帶點(diǎn)樣器（上?？普苌萍加邢薰荆?；DHG - 9030 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；DV215CD 型電子分析天平（美國(guó)奧豪斯儀器有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

丹參對(duì)照藥材（批號(hào)為120923 - 201615），黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)為121510 - 201606），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713-201613，含量為86.8%），延胡索對(duì)照藥材（批號(hào)為120928-201609），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)為120904-202021），延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)為110726-201819，含量為99.8%），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為110781-201606，含量為97.4%），黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)為120974-201612），丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)為111562-201917，含量為96.6%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；薄層層析硅膠G 板（青島海洋化工廠、煙臺(tái)江友硅膠有限公司、浙江臺(tái)州生化塑料廠，規(guī)格為10 cm ×10 cm 或10 cm×20 cm）；消癥化瘀灌腸液（批號(hào)分別為20210301，20210302，20210303）及其陰性樣品均由醫(yī)院制劑室提供；其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

黃柏［2-3］：取樣品2 mL，加甲醇20 mL，加稀鹽酸調(diào)pH至2，超聲（功率180 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液濃縮至2 mL，即得供試品溶液。稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品9.74 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得質(zhì)量濃度為0.97 mg/mL的對(duì)照品溶液。稱取黃柏對(duì)照藥材粉末0.15 g，精密稱定，加甲醇20 mL 混勻，再加稀鹽酸調(diào)pH 至2，超聲30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，即得對(duì)照藥材溶液。取缺黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各1.5 μL，對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2，V/V/V）為展開(kāi)劑，展距8 cm，展開(kāi)，晾干后置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜與對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置的熒光斑點(diǎn)顏色一致，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 A。

延胡索［4］315，［5］：取樣品10 mL，加濃氨試液調(diào)至堿性，分別加乙醚30 mL 振搖提取3 次，合并提取液，蒸干，加甲醇1 mL 溶解殘?jiān)?，即得供試品溶液。稱取延胡索乙素對(duì)照品1.25 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 的對(duì)照品溶液。稱取延胡索對(duì)照藥材粉末1 g，精密稱定，加甲醇50 mL 溶解，超聲處理30 min，濾過(guò)，蒸干濾液，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用濃氨試液調(diào)至堿性，分別加乙醚10 mL 振搖提取3 次，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，即得對(duì)照藥材溶液。取缺延胡索的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，對(duì)照藥材溶液5 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-丙酮（6∶1，V/V）為展開(kāi)劑，預(yù)飽和30 min，展距11 cm，展開(kāi)，取出，晾干后置碘缸中，約3 min后取出，揮盡板上吸附的碘，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜與對(duì)照品溶液及對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置的熒光斑點(diǎn)顏色一致，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 B。

黃芪［4］315，［6］：取樣品5 mL，以水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次10 mL，合并正丁醇液，分別以15 mL 1% NaOH 溶液洗滌3 次，倒掉NaOH 液，正丁醇用水洗至中性，取正丁醇液，置水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解殘?jiān)吹霉┰嚻啡芤?。稱取黃芪甲苷對(duì)照品5.03 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為1.01 mg/mL 的對(duì)照品溶液。稱取黃芪對(duì)照藥材粉末2.25 g，精密稱定，加水30 mL使溶解，加熱回流1 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液，濃縮至10 mL，分別以水飽和的正丁醇20 mL 振搖提取3 次，合并正丁醇，分別以1%NaOH 溶液15 mL 洗滌3 次，取正丁醇液，用水洗至中性，取正丁醇液，置水浴蒸干，再加甲醇1 mL 溶解殘?jiān)?，即得?duì)照藥材溶液。取缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，吸取上述陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，對(duì)照藥材溶液5 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿- 甲醇- 水（13∶7∶2，V/V/V），靜置下層液為展開(kāi)劑，預(yù)飽和30 min，展距10 cm，展開(kāi)，晾干后噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱，待斑點(diǎn)顯色清晰停止。結(jié)果供試品溶液色譜與對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置的斑點(diǎn)顏色一致，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 C。

1-3. 供試品溶液 4. 對(duì)照藥材溶液 5. 對(duì)照品溶液6. 陰性對(duì)照品溶液A. 黃柏 B. 延胡索 C. 黃芪 D. 丹參 E. 甘草圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution 5.Refer?ence solution 6.Negative reference solutionA.Phellodendri Chinensis Cortex B.Corydalis Rhizoma C.Astragali Radix D.Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma E.Glycyrrhizae Radix et RhizomaFig.1 TLC chromatograms

丹參［4］79，［7］：取樣品10 mL，加稀鹽酸調(diào)pH 至2，再用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 mL，取乙酸乙酯液，置水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解殘?jiān)?，即得供試品溶液。稱取丹酚酸B 對(duì)照品5.14 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1.03 mg/mL的對(duì)照品溶液。稱取丹參對(duì)照藥材粉末0.2 g，加水25 mL使溶解，加熱回流1 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用稀鹽酸調(diào)pH至2，分別以乙酸乙酯振搖提取2 次，取乙酸乙酯液，置水浴蒸干，加1 mL 甲醇溶解殘?jiān)吹脤?duì)照藥材溶液。取缺丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。參考2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液各2 μL，對(duì)照品溶液5 μL，對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，氯仿-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（3∶2∶5∶0.5∶2，V/V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展距為11 cm，展開(kāi)，晾干后噴以5%三氯化鐵顯色。結(jié)果供試品溶液色譜與對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置的斑點(diǎn)顏色一致，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 D。

甘草［8-9］：取樣品10 mL，分別以乙醚20 mL振搖提取3 次，收集提取溶液，蒸干，加1 mL 甲醇溶解殘?jiān)?，即得供試品溶液。取甘草?duì)照藥材粉末1 g，加水50 mL 使溶解，加熱回流30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。取缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性對(duì)照品溶液。參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液各15 μL，對(duì)照藥材溶液6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯- 乙酸乙酯- 冰醋酸（14∶6∶0.5，V/V/V）為展開(kāi)劑，展距12 cm，展開(kāi)，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置的熒光斑點(diǎn)顏色一致，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 E。

2.2 耐用性考察

黃柏：3個(gè)廠家薄層板展開(kāi)時(shí)間跨度為36～133 min，分離度存在一定差異，但斑點(diǎn)行為一致，重復(fù)性好；條帶點(diǎn)樣和圓點(diǎn)點(diǎn)樣方式分離度均較好，斑點(diǎn)清晰；點(diǎn)樣量為1.5，3.0，5.0 μL 時(shí)，薄層展開(kāi)行為一致，斑點(diǎn)分離度較好，清晰可辨。

延胡索：3個(gè)廠家薄層板展開(kāi)時(shí)間跨度為14～45 min，分離度存在差異較小，斑點(diǎn)行為一致，重復(fù)性好；條帶點(diǎn)樣方式的斑點(diǎn)分離度均較好，圓點(diǎn)點(diǎn)樣方式斑點(diǎn)分離度稍差；點(diǎn)樣量為5，10，15 μL 時(shí)，展開(kāi)行為一致，斑點(diǎn)分離度較好，5 μL點(diǎn)樣量斑點(diǎn)顏色較淡。

黃芪：3個(gè)廠家薄層板展開(kāi)時(shí)間跨度為20～70 min，分離度存在差異較小，斑點(diǎn)行為一致，重復(fù)性好；條帶點(diǎn)樣方式的斑點(diǎn)分離度均較好，可清晰辨識(shí)，圓點(diǎn)點(diǎn)樣方式斑點(diǎn)顯色較慢、顏色較淡；點(diǎn)樣量為5，10，15 μL時(shí)，展開(kāi)行為一致，斑點(diǎn)分離度較好，5 μL 點(diǎn)樣量斑點(diǎn)顏色較淡。

丹參：3個(gè)不同廠家的薄層板展開(kāi)時(shí)間跨度為24～55 min，分離度差異較小，斑點(diǎn)行為一致，重復(fù)性好；條帶點(diǎn)樣和圓點(diǎn)點(diǎn)樣方式的斑點(diǎn)分離度均較好，可清晰辨識(shí)；點(diǎn)樣量為5，10，15 μL 時(shí)，展開(kāi)行為一致，斑點(diǎn)分離度較好，不同體積點(diǎn)樣量斑點(diǎn)顏色稍有差異。

甘草：3個(gè)廠家薄層板展開(kāi)時(shí)間跨度為35～55 min，重復(fù)性好；條帶點(diǎn)樣和圓點(diǎn)點(diǎn)樣方式的展開(kāi)行為一致，圓點(diǎn)點(diǎn)樣方式分離度稍差；點(diǎn)樣量為5，10，15 μL 時(shí)，斑點(diǎn)分離度較好，斑點(diǎn)顏色稍有差異。

另選取黃柏、黃芪、丹參、延胡索、甘草5味藥材，分別在溫度5 ℃、相對(duì)濕度58%，以及溫度25 ℃、相對(duì)濕度45%條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果重復(fù)性、耐用性均較好。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中對(duì)當(dāng)歸- 川芎藥對(duì)［10］及敗醬草［11］等臣藥進(jìn)行了研究，由于始終無(wú)法排除陰性干擾或因與對(duì)照藥材、對(duì)照品斑點(diǎn)不一致，無(wú)法列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。最終確定納入黃柏、黃芪、延胡索、丹參、甘草5 味藥材的TLC鑒別。

本研究中參考2020 年版《中國(guó)藥典》，并查閱了大量文獻(xiàn)，結(jié)合盡量少用或不用毒性較大試劑、樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)單等原則，分別對(duì)文中所選5味藥材的供試品溶液制備方法、展開(kāi)條件、顯色方法等反復(fù)優(yōu)化，并分別對(duì)不同的薄層板、溫濕度條件、點(diǎn)樣方式、點(diǎn)樣量、顯色方法等條件進(jìn)行考察。其中甘草的預(yù)試驗(yàn)中采用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開(kāi)系統(tǒng)［12-13］，結(jié)果斑點(diǎn)均顯色，但位置不一致。最終采用甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（14∶6∶0.5，V/V/V）為展開(kāi)系統(tǒng)。結(jié)果各薄層板顯示主斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。各藥材在相應(yīng)薄層板展開(kāi)時(shí)間跨度內(nèi)斑點(diǎn)行為一致，重復(fù)性好，且在不同點(diǎn)樣方式和點(diǎn)樣量下的薄層展開(kāi)行為一致，斑點(diǎn)分離度較好。

綜上所述，本研究中所建立的黃柏等5 味藥材TLC鑒別方法，耐用性、重復(fù)性等符合要求，能對(duì)消癥化瘀灌腸液所含藥味進(jìn)行定性鑒別。