葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)不同性別潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的比較

張琳珮，陸洪艷，史雯雪，蔣霞

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的一種，是一種非特異性腸道炎癥性疾病，其病程長，病情輕重不等，是近年來發(fā)病率逐漸升高且難以治愈的疾病之一［1］。基礎(chǔ)研究中建立符合疾病發(fā)展特點(diǎn)的動(dòng)物模型至關(guān)重要，在現(xiàn)有的復(fù)制UC 動(dòng)物模型的基礎(chǔ)研究中，探討較多的是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、周齡、模型制作方法等［2-5］，但尚未見有討論3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）溶液誘導(dǎo)UC動(dòng)物模型性別差異的研究。本實(shí)驗(yàn)通過給雌性、雄性C57BL/6J 小鼠自由飲用3% DSS 溶液復(fù)制UC 動(dòng)物模型，分析不同性別小鼠UC 模型的疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI），病死率，成模率，結(jié)腸長度，脾臟系數(shù)，結(jié)腸病理變化，來探討性別差異對(duì)UC 模型的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

葡聚糖硫酸鈉（相對(duì)分子質(zhì)量為35 000～50 000，美國MP），批號(hào)：S4140；糞便隱血定性檢測(cè)試劑盒（鄰聯(lián)甲苯胺法，北京雷根），批號(hào)：TC0511；HE 染液套裝（武漢賽維爾），貨號(hào)：G1003。

1.2 儀器

L204 電子天平（上海梅特勒托利多）；Milli-Q A10 超純水系統(tǒng)（美國Millipore）；VORTEX GENIUS 3型渦旋振蕩儀（德 國IKA）；Thermo Scientific SL 8R 型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher）；生物倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯）；脫水機(jī)（DIAPATH）；包埋機(jī)（武漢俊杰）；病理切片機(jī)（上海徠卡）。

1.3 動(dòng)物

雌性、雄性C57BL/6J 小鼠，SPF 級(jí)，6-8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF 級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0004］。

1.4 方法

1.4.1 使用3% DSS 溶液誘導(dǎo)UC 動(dòng)物模型 健康雌性、雄性C57BL/6J 小鼠24 只，隨機(jī)分為雌性對(duì)照組、雄性對(duì)照組、雌性DSS 組和雄性DSS 組，每組6 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，雌性、雄性對(duì)照組正常供給飼料、飲水，雌性、雄性DSS 組給予正常飲食+3% DSS 溶液造模自由飲用7 d 進(jìn)行造模［6］。

1.4.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法（1）一般情況及結(jié)腸長度測(cè)量：每日觀察并記錄小鼠的一般情況：精神狀態(tài)、體質(zhì)量、進(jìn)食量、毛色光澤、糞便性狀及隱血等。在第8 天用10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死小鼠后，解剖小鼠，測(cè)量結(jié)腸總長度。（2）疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）：自試驗(yàn)d0 開始，每日固定時(shí)間稱量各組小鼠體質(zhì)量，記錄每只小鼠的糞便性狀，運(yùn)用糞便隱血定性檢測(cè)試劑盒（鄰聯(lián)甲苯胺法）檢測(cè)糞便隱血情況。體質(zhì)量的變化以基線體質(zhì)量下降的百分比表示：體質(zhì)量變化(%)=［1+(造模后體質(zhì)量-造模前體質(zhì)量)/造模前體質(zhì)量］×100%。按表1 計(jì)算DAI 指數(shù)評(píng)分，DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+血便分?jǐn)?shù))/3［7］。（3）脾臟系數(shù)：摘取小鼠脾臟，量取脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟系數(shù)。脾臟系數(shù)（%）=［脾臟質(zhì)量（mg）/處死前小鼠體質(zhì)量（g）］×100%。（4）結(jié)腸病理切片觀察—蘇木精-伊紅（HE）染色檢測(cè)：剖腹后，剪取距肛門以上2 cm 結(jié)腸，剔除腸系膜，取病變最明顯處結(jié)腸組織2～3 cm，沿縱軸剪開，用生理鹽水清理腸內(nèi)容物，放置于4%多聚甲醛中固定，按常規(guī)包埋、切片，HE 染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況及體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)期間，兩對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好、反應(yīng)靈敏、皮毛光亮，體質(zhì)量緩慢增長，大便正常。DSS 組小鼠飲用3% DSS 溶液后，兩組小鼠體質(zhì)量均不同程度下降，蜷縮聚堆，精神萎靡，飲食量減少，拱背，皮毛枯槁無光澤，伴有黏液稀便、肉眼血便等癥狀。小鼠在活動(dòng)性結(jié)腸炎期間通常體重減重10%～20%，根據(jù)倫理規(guī)則，體質(zhì)量減輕20%～25%或更多被認(rèn)為是終止實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)［2］。與雌性對(duì)照組比較，雌性DSS 組體質(zhì)量明顯減少（P＜0.01）；與雄性對(duì)照組比較，雄性DSS 組體質(zhì)量明顯減少（P＜0.01）。與雄性DSS 組比較，雌性DSS 組體質(zhì)量減少幅度更小（P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化

表2 各組小鼠體質(zhì)量及變化（）

表2 各組小鼠體質(zhì)量及變化（）

注：與同性別對(duì)照組比較，aP＜0.01，不同性別DSS組比較，bP＜0.01。

2.2 小鼠DAI 指數(shù)、病死率、成模率結(jié)果分析

自由飲用3% DSS 溶液誘導(dǎo)的UC 小鼠模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一：造模后小鼠出現(xiàn)精神倦怠、飲食量下降、體質(zhì)量減少并伴有黏液稀便、血便等癥狀。實(shí)驗(yàn)期間，雌性和雄性DSS 組均出現(xiàn)不同程度的上述癥狀，表明造模成功。雄性DSS 組小鼠d2 開始出現(xiàn)黏液便及松散糞便，d3 開始出現(xiàn)糞便隱血陽性，d4 大部分小鼠出現(xiàn)肉眼血便，DAI 指數(shù)顯著升高，在d4、d5 各有1 只死亡，d7 整組小鼠體質(zhì)量均減少＞25%（體質(zhì)量減少＞25%應(yīng)終止實(shí)驗(yàn)）；雌性DSS 組小鼠d4 開始出現(xiàn)黏液便及糞便隱血陽性，d5 有1 只小鼠死亡，部分小鼠出現(xiàn)肉眼血便，DAI指數(shù)逐漸升高，癥狀出現(xiàn)時(shí)間及程度均明顯比雄性DSS 組輕。雌性和雄性DSS 小鼠DAI 指數(shù)均分別顯著高于同性別對(duì)照組小鼠（P＜0.05），其中雌性DSS 組DAI 指數(shù)較雄性DSS 組低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠的DAI 指數(shù)、病死率、成模率分析

2.3 小鼠結(jié)腸長度、脾臟系數(shù)

在UC 模型實(shí)驗(yàn)中，隨著炎癥的加重，結(jié)腸出現(xiàn)縮短的情況［8］。兩對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織均勻光滑，無水腫充血情況，糞便成型，而雌性和雄性DSS組小鼠結(jié)腸均出現(xiàn)明顯縮短的情況，結(jié)腸充血、腫脹，沒有成型糞便，結(jié)腸內(nèi)可見血色糞便，如圖2示。雌性DSS 組中小鼠的結(jié)腸長度與對(duì)照組相比，結(jié)腸長度減少了23.6%，而雄性DSS 組中小鼠的平均結(jié)腸長度與對(duì)照組相比減少了31.6%，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。雌性DSS 組結(jié)腸縮短長度明顯低于雄性DSS 組（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織圖

與對(duì)照組比較，雌性和雄性DSS 組脾臟器系數(shù)均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在同性別DSS 組中與雄性對(duì)照組比較，雌性DSS 組脾臟器系數(shù)增長較少（P＜0.01）。見表4。

表4 3% DSS對(duì)小鼠的結(jié)腸長度、脾臟器系數(shù)的影響（）

表4 3% DSS對(duì)小鼠的結(jié)腸長度、脾臟器系數(shù)的影響（）

注：與同性別對(duì)照組比較，aP＜0.01；不同性別DSS組比較，bP＜0.05，cP＜0.01。

2.4 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化

雌性、雄性對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整光滑，未見炎性、壞死的細(xì)胞、糜爛及潰瘍等。雌性、雄性DSS 組通過3% DSS 溶液誘導(dǎo)后出現(xiàn)了典型的UC 的病理變化：均可見結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞大量脫落形成潰瘍，伴大量炎性細(xì)胞浸潤，排列紊亂，侵入黏膜下層及肌層，但雌性DSS 組較雄性DSS 組黏膜充血水腫輕，黏膜下層及肌層炎癥細(xì)胞浸潤較雄性DSS 組少，可見少量完整杯狀細(xì)胞。見圖3。

圖3 3% DSS溶液對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響（HE，×200）

3 討論

UC 是目前最常見的炎性腸道性疾病，其發(fā)病機(jī)制、病因尚未完全明確，目前多認(rèn)為其發(fā)病可能由環(huán)境、感染、遺傳和免疫等多重因素相互影響［9-10］。UC 模型的建立是基礎(chǔ)研究工作的第一步，建立與人類UC 相似的動(dòng)物模型有助于開展UC 的機(jī)制及治療研究。DSS 是一種帶負(fù)電荷的葡萄糖聚合物，對(duì)結(jié)腸黏膜具有破壞性，可使腸黏膜通透性增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)［11］。研究發(fā)現(xiàn)由一定濃度的DSS 溶液誘導(dǎo)的UC 動(dòng)物模型是目前研究UC發(fā)病機(jī)制及評(píng)估某些藥物治療療效應(yīng)用最廣泛的模型之一，其誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動(dòng)物模型病理表現(xiàn)、臨床癥狀與人類UC 相似［12-13］。

目前小鼠UC 模型的建立方法有多種，但少有對(duì)性別差異與動(dòng)物模型影響因素的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過最常用的3%DSS 溶液誘導(dǎo)UC 小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行了關(guān)于動(dòng)物性別差異的研究，并成功誘導(dǎo)出了UC 的疾病模型，首次證實(shí)了3% DSS 溶液誘導(dǎo)下性別差異與UC 小鼠模型病理程度密切相關(guān)，甚至可能影響UC 模型的成模率。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雄性小鼠的DAI 指數(shù)水平顯著高于雌性小鼠，但雌性小鼠病死率低于雄性小鼠。由此可見，雌性小鼠可能更易于模型的誘導(dǎo)，且該方法容易復(fù)制，成模率高，病死率低。

建立符合人類UC 疾病特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)，但UC 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立方法仍缺少一個(gè)統(tǒng)一的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，且影響因素較多，如動(dòng)物的種屬選擇與周齡大小、模型誘導(dǎo)方法（包括誘導(dǎo)試劑的濃度、誘導(dǎo)周期等）、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等等，本實(shí)驗(yàn)對(duì)常用的化學(xué)法誘導(dǎo)的UC 動(dòng)物模型的性別因素進(jìn)行了研究，為后期實(shí)驗(yàn)人員建立UC動(dòng)物模型對(duì)動(dòng)物性別的選擇提供參考依據(jù)，但尋找一種UC 臨床相似度高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型尚需進(jìn)一步探索。