基于HPLC 法測(cè)定王不留行不同炮制品中主成分含量

黃檢平，周鳴，陳秀娟，李晶，高慧，葉喜德

1.上高縣中醫(yī)院，江西 上高 336400；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；3.福州市長(zhǎng)樂區(qū)婦幼保健院，福建 福州 350200

王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜［Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke］的干燥成熟種子，在夏季果實(shí)成熟、果皮尚未開裂時(shí)采收［1］。其味苦性平，主入肝胃經(jīng)，具活血通絡(luò)、下乳消腫、利尿祛濕之功［2］。臨床常以復(fù)方入藥以治療女性閉經(jīng)、痛經(jīng)、母乳不降、乳房膿腫腫痛、淋證澀痛等證［3-5］。主含黃酮類、生物堿、三萜皂苷、環(huán)肽、多糖和揮發(fā)油等成分，其中王不留行黃酮苷（vaccarin）和刺桐堿（hypaphorine）是其主要有效成分。前者具有促進(jìn)乳汁分泌、血管新生、內(nèi)皮細(xì)胞增殖，改善內(nèi)皮損傷、肝臟糖脂代謝紊亂，抑制高血糖、高血壓、高血脂等藥理作用［6］。而刺桐堿具抗炎、增強(qiáng)免疫和抗肝損傷等作用［7］。歷代醫(yī)學(xué)典籍記載，王不留行炮制方法較多，如制炭、清蒸、酒蒸和清炒等［8］。目前《中國藥典》2020 版只保留了生品和清炒品兩種規(guī)格，而其他古法炮制多已不用且研究較少。在炒制法中，王不留行除清炒外，現(xiàn)衍化出其他許多不同炮制方法，如潤(rùn)炒法、酒炒法、油砂炒法等［9］。在對(duì)其炮制工藝研究時(shí)，王不留行中的刺桐堿和王不留行黃酮苷常作為其重要的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)［10］。由于中藥在臨床應(yīng)用前必須進(jìn)行炮制，而不同炮制方法涉及的因素各異，從而對(duì)藥材化學(xué)成分產(chǎn)生不同的影響，進(jìn)而影響藥效?；诖耍狙芯炕贖PLC法測(cè)定王不留行不同炮制品中刺桐堿和王不留行黃酮苷的含量，以比較不同炮制方法對(duì)王不留行主要有效成分含量變化的影響，為深入研究提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器設(shè)備

Agilent 1100 高效液相色譜儀（安捷倫儀器有限公司）；FA1004N 萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；YF-111B 高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；十萬分之一分析天平ESJ180-4，沈陽龍騰電子有限公司；KQ-500E 超聲波清洗器（120 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-80-2C 低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥材

王不留行藥材購自安徽匯仁堂中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千峰教授鑒定為石竹科植物麥藍(lán)菜的干燥成熟種子。

1.3 試劑

王不留行黃酮苷對(duì)照品（四川省維克奇生物有限公司，批號(hào)：wkq20060206，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；刺桐堿對(duì)照品（四川省維克奇生物有限公司，批號(hào)：wkq20070902，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙蒸水，江西中醫(yī)藥大學(xué)大型精密儀器共享服務(wù)中心（簡(jiǎn)稱大儀中心）制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 王不留行炮制品的制備

2.1.1 生品 取100 g 王不留行藥材，篩去雜質(zhì)后洗凈曬干。用塑料封口袋密封保存，做好標(biāo)簽，備用。

2.1.2 清炒品 取王不留行藥材100 g，篩去雜質(zhì)后洗凈曬干，確保其充分干燥。用中火把鍋預(yù)熱，投入少許王不留行，王不留行入鍋即爆花后，投入剩余藥材，用小竹帚同方向連續(xù)炒制大部分爆白花，出鍋，放涼。用塑料封口袋密封保存，做好標(biāo)簽，備用。

2.1.3 潤(rùn)炒品［11］取王不留行藥材100 g，篩去雜質(zhì)后洗凈曬干，使其充分干燥。干燥后用10 g 左右的水浸潤(rùn)，浸潤(rùn)15 min 左右。用中火把鍋預(yù)熱后，投入少許王不留行試藥，待王不留行一入鍋就爆花后，倒入剩余王不留行，用小竹帚同方向連續(xù)炒制大部分爆白花，取出晾涼，用塑料封口袋密封保存，做好標(biāo)簽，備用。

2.1.4 酒炒品 取王不留行藥材100 g，篩去雜質(zhì)，洗凈曬干，確保其充分干燥。充分干燥后加入10 g左右的黃酒拌勻，浸潤(rùn)15 min 左右，同上用中火預(yù)熱鍋和試藥后，倒入王不留行，用小竹帚同方向連續(xù)炒制大部分爆白花，出鍋，放涼，用塑料封口袋密封保存，做好標(biāo)簽，備用。

2.1.5 油制品［12］取2 號(hào)篩至3 號(hào)篩之間的中粗砂，篩去石子，洗凈，晾干，放入鍋中加熱，加入食用油約10 g，用武火翻炒至油完全散開，待砂色均勻、深沉后取出，冷卻備用。將篩去雜質(zhì)并洗凈的王不留行充分干燥，用中武火把鍋預(yù)熱，把200 g 左右的砂子投入鍋內(nèi)翻炒至砂子處于滑利狀態(tài)。投入少許王不留行試藥，王不留行入鍋即爆花后，投入100 g 藥材，用小竹帚同方向連續(xù)炒制大多數(shù)爆成白花時(shí)，出鍋，放涼，篩砂。用塑料封口袋密封保存，做好標(biāo)簽，備用。

將制備好的5 種王不留行炮制品粉碎成粉末，通過3 號(hào)篩，裝袋并做標(biāo)記。各炮制品中輔料和藥物的比例見表1。

表1 不同炮制方法參數(shù)（g/100g）

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件色譜柱 Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1% 甲酸水（B），梯度洗脫（0～10 min，13% A；10～20 min，13%→20% A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量:5 μL。各溶液色譜圖見圖1。

圖1 各待測(cè)液HPLC色譜圖：A.刺桐堿、王不留行黃酮苷混合對(duì)照品；B.生品；C.清炒品；D.潤(rùn)炒品；E.酒炒品；F.油制品

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取刺桐堿對(duì)照品、王不留行黃酮苷對(duì)照品，分別加色譜級(jí)甲醇制成濃度為1.13 mg/mL、1.02 mg/mL 的對(duì)照品溶液的刺桐堿和王不留行黃酮苷母液。從母液中吸取刺桐堿50 μL、王不留行黃酮苷225 μL 至同一樣品瓶中，再吸取725 μL 色譜級(jí)甲醇至樣品瓶中，混合均勻，配成每1 mL 含刺桐堿56.5 μg、王不留行黃酮苷229.5 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取王不留行不同炮制品粉末1.0 g，精密稱定，裝入15 mL 的EP 管中，首次提取加入5.5 mL 50%甲醇水溶液，Vortexfor 混旋至粉末完全溶于甲醇水溶液中且混合均勻（即EP 管底部不殘留粉末）。然后在常溫下超聲提取30 min，取出放至溫室，3 000 rpm 離心10 min，傾取上清液，放入10 mL 容量瓶中。重復(fù)以上步驟，連續(xù)反復(fù)提取3 次（第2、3 次添加溶劑量約3.5 mL），合并3 次提取液，定容至10 mL。提取液先經(jīng)0.45 μL 的微孔濾膜過濾，去除1 mL 后，用5 mL 的一次性注射器注入到10 mL 樣品瓶中，留樣備用。再從該樣品瓶中用1 mL 的一次性注射器吸取1 mL 的提取液，經(jīng)0.22 μL 微孔濾膜過濾，去除前面2 滴后，注入到樣品瓶，即為供試品。將已經(jīng)制備好的樣品冷藏保存。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 刺桐堿、王不留行黃酮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.5 精密度試驗(yàn) 吸取“2.2.2”項(xiàng)下刺桐堿、王不留行黃酮苷對(duì)照品母液各100 μL 至樣品瓶（內(nèi)置內(nèi)插管），充分混勻，制成混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分峰面積，計(jì)算得到刺桐堿、王不留行黃酮苷峰面積的RSD 分別為1.18%，1.25%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于配制后0、3、6、9、12、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μL，計(jì)算得到刺桐堿、王不留行黃酮苷峰面積的RSD 分別為2.04%，1.43%，表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)方法平行制備王不留行供試品溶液6 份。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μL，計(jì)算得到刺桐堿、王不留行黃酮苷峰面積的RSD 分別為1.72%，1.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 樣品含量測(cè)定 分別稱取1.0 g 王不留行5 種炮制品粉末，按“2.2.3”的方法配制供試品溶液，按“2.2.1”的色譜條件測(cè)定其中刺桐堿和王不留行黃酮苷的含量。結(jié)果見表3。

表3 不同炮制品中刺桐堿、王不留行黃酮苷的含量（n=3，mg/g）

3 討論與小結(jié)

王不留行主要成份王不留行黃酮苷，含量易受外界環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，從而影響藥材的質(zhì)量。該藥材雖有許多不同炮制品，但《中國藥典》主要以清炒品為主。由于清炒法涉及加熱溫度、時(shí)間等環(huán)節(jié)，這些因素勢(shì)必會(huì)影響王不留行中化學(xué)成分含量，進(jìn)而影響飲片質(zhì)量。

目前對(duì)王不留行的研究，主要集中在對(duì)臨床應(yīng)用和化學(xué)成分的研究，而臨床使用的王不留行多以清炒法為主，而砂炒法也逐漸在企業(yè)中應(yīng)用，被認(rèn)為是王不留行最佳炮制方法［13］。在炮制方面，主要是比較王不留行炮制前后藥效差異，但并未開展其炮制機(jī)制研究。因此，課題組選擇不同炮制方法對(duì)刺桐堿和王不留行黃酮苷等含量的影響，目的是探討不同炮制方法對(duì)王不留行主要有效成分的影響，以確立發(fā)生炮制變化的生物標(biāo)志物。因此，基于HPLC 法測(cè)定王不留行不同炮制品中刺桐堿和王不留行黃酮苷的含量差異，為優(yōu)選王不留行優(yōu)質(zhì)飲片提供科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果表明，刺桐堿和王不留行黃酮苷含量以生品最高，不同炮制品的刺桐堿和王不留行黃酮苷含量存在差異。如表3 所示，炮制對(duì)王不留行中刺桐堿的含量影響不大，而對(duì)王不留行黃酮苷的影響顯著。相比生品，油制品中王不留行黃酮苷含量顯著下降，刺桐堿的含量亦是下降最多；其他炮制方法比生品也相應(yīng)降低，其中清炒法下降最少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，不同炮制方法對(duì)王不留行中刺桐堿和王不留行黃酮苷的含量產(chǎn)生影響，這種變化與加熱時(shí)間、溫度等方面存在關(guān)聯(lián)，從而導(dǎo)致生物堿類和黃酮類成分破壞流失［14］。

本試驗(yàn)比較了不同炮制方法王不留行中刺桐堿、王不留行黃酮苷的含量變化，測(cè)定方法穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，可為其炮制工藝的改進(jìn)和新工藝的建立提供數(shù)據(jù)支撐。試驗(yàn)所用的HPLC 測(cè)定中藥含量的方法，重復(fù)性高，簡(jiǎn)單易行。但縱觀整個(gè)實(shí)驗(yàn)，本研究還存在一些不足之處，如王不留行的質(zhì)量指標(biāo)選擇較少，未能從多成分、多指標(biāo)的角度進(jìn)行深入研究，希望本研究能為王不留行的深入研究提供參考。