超高效液相色譜串聯(lián)質譜檢測配合飼料中三聚氰胺的方法研究

馮光寶 ，閆躍飛，高 娜，岳婷婷，潘 磊，侯玉芳，閆 磊

(1.新鄉(xiāng)市農業(yè)農村局，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2.河南省種牛遺傳性能測定中心，河南 鄭州 450000； 3.河南省奶牛生產(chǎn)性能測定有限公司，河南 鄭州 450000)

三聚氰胺，俗稱蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，常被不良商家添加到飼料中以提高蛋白質含量。農業(yè)部第1218號公告明令禁止在飼料中人為添加三聚氰胺，并將飼料原料和飼料產(chǎn)品中三聚氰胺的限量值定為2.5 mg/kg。

目前檢測三聚氰胺常用的檢測方法有酶聯(lián)免疫試劑盒檢測法(ELSAE)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜檢測法(GC-MS)、液相色譜法和液質聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)等[1-8]。ELISA 方法受非特異性吸附影響，易導致假陽性；HPLC方法靈敏度低，檢出限偏高，易造成假陽性，適合于飼料中高含量的三聚氰胺的定量分析；GC-MS法用N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，衍生過程中不定因素多，影響檢測結果。

液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質譜作為檢測系統(tǒng)，將色譜高分離能力和質譜的高靈敏度和高選擇性優(yōu)點相結合[9-10]，與傳統(tǒng)定量檢測方法相比，該方法不僅可以實現(xiàn)定量檢測，還可以實現(xiàn)定性檢測。目前，該方法在食品、環(huán)境和飼料等許多領域得到了廣泛的應用[11-13]，且由于其智能化，處理后的多個樣品能夠完全機械化上機進樣，省時省力。目前飼料中三聚氰胺檢測，農業(yè)部NY/T 1372—2007的檢測標準中采用的是高效液相色譜和氣質聯(lián)用儀，標準中還沒有專門針對飼料中三聚氰胺檢測的液質方法。因此，我們在傳統(tǒng)方法基礎上，研究建立配合飼料中三聚氰胺的超高效液相色譜串聯(lián)質譜檢測方法，旨在為配合飼料中三聚氰胺的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1試劑耗材

對照品：三聚氰胺，純度99.4%；甲醇、乙腈和甲酸，色譜純；乙二胺四乙酸二鈉，分析純。固相萃取柱：Agela Cleanert PCX SPE，60 mg/3 ml。

1.1.2儀器與設備

1290 Infinity Ⅱ-6460 Triple Quad超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜聯(lián)用儀,美國安捷倫;超純水儀,Millipore synergy；電子天平,梅特勒-托利多。

1.1.3溶液配制

標準儲備液：準確稱取適量三聚氰胺標準品，用甲醇溶解并定容至100 ml，配制成質量濃度為1 mg/ml的標準儲備液，冷凍保存。

標準中間液：吸取標準儲備液1.00 ml于10 ml容量瓶內，用甲醇定容至10 ml，該溶液質量濃度為100 μg/ml，4℃冰箱內冷藏。

三氯乙酸溶液：稱取10 g三氯乙酸加水定容至1 000 ml。飽和乙酸鉛溶液：在50 ml水中加入一定量的乙酸鉛，超聲5 min，直至固體不再溶解。

氨水甲醇溶液：量取5 ml氨水于100 ml容量瓶中，用水定容至100 ml。

1.2 實驗方法

1.2.1色譜條件

色譜柱為C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm); 柱溫為40℃；進樣體積為10 μl；流動相A為水，B為甲醇，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2質譜參數(shù)

離子源為ESI；離子化模式為正離子模式；干燥氣溫度為350℃；干燥氣流速為11 L/min；干燥氣壓力為275.8 kPa；毛細管電壓為4 000 V。

1.2.3提取與凈化

(1)提取

稱取配合飼料2 g(精確至0.001 g)于50 ml離心管中，準確加入18 ml三氯乙酸溶液和2 ml飽和乙酸鉛溶液，混合均勻，超聲提取20 min，0～4℃條件下，10 000 r/min離心10 min，上清液備用。

(2)凈化

固相萃取小柱先用3 ml甲醇和3 ml水進行預處理。取上清液3 ml過柱，濾液以1滴/s的速度過柱，待樣液完全流出后，依次用3 ml 水和3 ml甲醇淋洗，棄去全部流出液。最后用5 ml的氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液于50℃氮氣吹干，用初始流動相1 ml復溶，濾膜過濾，供高效液相色-質譜聯(lián)用儀測定。

(3)基質加標標準曲線的繪制

稱取空白配合飼料2 g，分別精密量取三聚氰胺中間液適量，添加到空白飼料中，制得濃度范圍為5～500 μg/kg的基質添加標準曲線，供超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜聯(lián)用儀測定。

1.2.4檢出限和定量限

稱取空白配合飼料2 g(精確至0.001 g)，精密量取三聚氰胺標準溶液，添加到空白配合飼料中，制備成三聚氰胺含量分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg飼料樣品，按照1.2.3節(jié)的方法進行提取和凈化。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優(yōu)化

采用ESI源(電噴霧離子源)對三聚氰胺的標準溶液進行掃描，通過優(yōu)化解離電壓，讓準離子分子[M+H]+豐度達到最大，通過優(yōu)化碰撞電壓，使子離子的豐度最大化，選擇干擾小和豐度大的離子作為定型離子和定量離子。優(yōu)化后的質譜參數(shù)見表2。

表2 質譜參數(shù)

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

化合物采用正離子模式進行掃描，以水和甲醇為流動相，進行梯度洗脫，為了獲得良好的化合物峰形，對梯度洗脫條件進行優(yōu)化。三聚氰胺標準溶液的總離子流圖見圖1。

圖1 三聚氰胺總離子流圖

從圖1中可以看出，三聚氰胺峰尖峭，且峰形對稱，無雜質干擾。

2.3 線性范圍

根據(jù)上述的儀器條件，對標準溶液進行測定，以三聚氰胺的濃度為橫坐標，響應面積為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線見圖2。

由圖2可以看出，三聚氰胺在1.0～100 ng/ml時呈現(xiàn)出了良好的線性關系，其相關系R2大于0.999。

圖2 三聚氰胺的標準曲線

2.4 準確度及精密度實驗

在空白樣品中加入不同濃度的三聚氰胺標準溶液，加入量分別1、20、50和100 μg/kg，每個加標量同時做6個平行實驗，按照上述的實驗條件進行樣品處理，通過數(shù)據(jù)處理計算方法的回收率和相對標準偏差RSD，結果見表3。

由表3可見，在4個不同加標量水平條件下，回收率85.5%～95.2%，RSD≤3.3%(n=6)，說明本方法具有較好的精密度。

表3 三聚氰胺的回收率和精密度(n=6)

2.5 檢出限和定量限

該方法的檢出限(LOD)通過信噪比(S/N)≥3來確定，定量限(LOQ)通過信噪比(S/N)≥10來確定。該方法的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

3 結論

建立了超高效液相色譜聯(lián)用質譜測定配合飼料中三聚氰胺的檢測方法，通過優(yōu)化儀器條件和前處理條件，該方法的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，與NY/T 1372—2007標準相比，本方法的定量限更低，可以檢測配合飼料中微量添加的三聚氰胺，而且本方法中采用了基質加標標準曲線，大大提高了加標回收率和準確度。結果證明該方法具有靈敏度高、特異性好、重復性高和操作簡單等優(yōu)點，適合測定配合飼料中的三聚氰胺。