利用PLDMV/Twin-Strep侵染性克隆純化HC-Pro病毒蛋白

楊秀坤　沈文濤　庹德財　王赫　言普　黎小瑛　朱國鵬　周鵬

摘? 要：番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus， PLDMV）是一種新的潛在威脅番木瓜種植業(yè)的病毒，其輔助成分蛋白酶（helper component- proteinase， HC-Pro）是PLDMV編碼參與病毒復制、運動、寄主植物癥狀表現的多功能蛋白，因此純化獲得具有功能活性的HC-Pro蛋白，研究其多功能性具有重要意義。本研究利用In-Fusion拼接策略和E.coliCell-Free快速構建植物病毒侵染性克隆法，一步快速地將28個氨基酸組成的蛋白標簽Twin-Strep插入到PLDMV HC-Pro氨基端，成功獲得了基于農桿菌的攜帶Twin-Strep標簽的PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep。通過農桿菌滲透注射接種番木瓜植株，從感染PLDMV-Strep的番木瓜葉片總蛋白中，利用Twin-Strep蛋白標簽親和層析分離純化獲得PLDMV HC-Pro蛋白，并通過LC/ESI-MS/MS（liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometric）對其進行蛋白N端和C端序列測序，證明了純化獲得完整的PLDMV HC-Pro蛋白。研究結果為后續(xù)解析PLDMV HC-Pro在病毒侵染過程中的功能及與寄主蛋白相互作用奠定了基礎。

關鍵詞：番木瓜畸形花葉病毒;HC-Pro;馬鈴薯Y病毒;蛋白純化中圖分類號：S436.67 ?????文獻標識碼：A

Purification of the Potyviral Helper Component-proteinase Using Agroinfection-compatible Twin-Strep-tagged Infectious cDNA Clone of Papaya Leaf Distortion Virus

YANG Xiukun SHEN Wentao TUO Decai WANG He YAN Pu LI Xiaoying ZHU Guopeng ZHOU Peng

1. College of Horticulture， Hainan University / Key Laboratory of Quality Control of Tropical Horticultural Crops of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Papaya leaf distortion mosaic virus （PLDMV， genus Potyvirus） is an emerging threat to papaya production. The helper component proteinase （HC-Pro） encoded by potyvirus is a multifunctional protein involved in different steps of the viral cycle including aphid-vector transmission， virus replication and movement， cleavage of the polyprotein and suppression of RNA silencing. To enable the study of HC-Pro functions， high quantities of protein are required. Here we describe the construction of a PLDMV infectious clone that produces HC-Pro protein with a Twin-Strep-tag fused at the N-terminus， and the development of an efficient method to purify large amounts of PLDMV HC-Pro protein for the virus-infected papaya plants. To construct an agroinfection-compatible Twin-Strep-tagged PLDMV infectious cDNA clone designated pPLDMV-Strep， the previously constructed pPLDMV-WT plasmid that contained the full-length cDNA of the wild-type PLDMV genome was used as the template to amplify two DNA fragments containing all PLDMV viral sequences， the backbone of binary vector pGreenII-35S and Twin-Strep-tag by PCR with specific two primer pairs. Then， both PCR amplified fragments were assembled to produce the pPLDMV-Strep vector using one-step In-Fusion Cloning. Based on theEscherichia coliCell-Free method， the pPLDMV-Strep were directly transformed intoAgrobacterium tumefaciensto prevent potential problems such as plasmid instability during propagation inE. coli. Sequencing of the PCR products fromA.tumefaciens transformants confirmed that the full-length viral sequences in pPLDMV-Strep was identical to that of the wild-type PLDMV isolate and the Twin-Strep-tag was introduced correctly into N-terminus of the PLDMV HC-Pro. The agroinoculated papaya seedlings withA. tumefaciens transformant harboring the plasmid pPLDMV-Strep developed systemic mosaic symptoms on leaves at 20 days post inoculation （dpi） which were similar to those caused by wild-type PLDMV. The results suggested that the PLDMV-Strep was infectious and insertion of Twin-Strep-tag into PLDMV genome did not affect the viral infectivity. Furthermore， a protocol for purifying rapidly the PLDMV HC-Pro from PLDMV-Strep-infected papaya leaves based on the Strep-tag-Tactin@XT affinity chromatography was developed. the N- and C-terminal peptides from the purified Twin-Strep-tagged HC-Pro were identified by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometric （LC/ESI-MS/MS） analysis. Compared to previous several potyviral HC-Pro heterologous expression systems in baculovirus， yeast orE. coli，a major advantage of the expression system based on the agroinfection-compatible strep-tagged infectious cDNA clone was capable of producing more authentic HC-Pro proteins because purified PLDMV HC-Pro was from the virus-infected host plants. The results would provide a rapid and low-cost alternative method to obtain biologically active PLDMV HC-Pro protein and will facilitate to further study the structure and multifunction of PLDMV HC-Pro.

Keywords： Papaya leaf distortion mosaic virus; HC-Pro;Potyvirus; protein purification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.004

馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）是目前最大的植物RNA病毒屬，寄主范圍十分廣泛，是世界范圍內危害多種糧食作物、經濟作物和果樹最嚴重的病毒屬之一。輔助成分蛋白酶（HC-Pro）是Potyvirus病毒編碼一個重要多功能病毒蛋白，在病毒的侵染循環(huán)過程中，通過與多種寄主蛋白互作發(fā)揮重要功能^[1-2]，主要包括：協(xié)助病毒蛋白前體的加工，調控轉錄后基因沉默，參與病毒的長距離移動，輔助蚜傳，調控癥狀的形成，參與病毒的復制等^[2-4]。HC-Pro的三級結構可以明顯的分為3部分：羧基末端（C-terminal， C端）部分、中間區(qū)域、氨基末端（N-terminal， N端）部分，C端和N端有大約100個氨基酸，中央區(qū)有250個氨基酸左右，每個區(qū)域都存在不同功能的氨基酸保守基序^[2]。N端區(qū)域含有豐富的半胱氨酸，該區(qū)域包括1個類似鋅指結構的金屬結合基序，其中的KITC保守結構域是蚜蟲傳播必需區(qū)域^[5]，N端區(qū)域主要參與病毒基因組的擴增、病毒的蚜傳以及癥狀的形成等過程。中間區(qū)域可以參與病毒基因組的復制和長距離移動，同時還可以調控RNA沉默抑制活性以及與其他病毒的協(xié)生過程^[6]。純化獲得具有功能活性的HC-Pro蛋白，研究其多功能性具有重要意義。目前表達HC-Pro的系統(tǒng)主要包括：大腸桿菌原核表達體系、酵母表達體系、重組桿狀病毒和植物病毒表達體系、轉基因植物表達體系和攜帶蛋白標簽的HC-Pro病毒侵染性克隆系統(tǒng)。這些表達系統(tǒng)已被應用于西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）、煙草蝕刻花葉病毒（Tobacco etch virus， TEV）、煙草脈斑病毒（Tobacco vein mottling virus， TVMV）、李痘病毒（Plum pox virus， PPV）、菜豆普通花葉病毒（Bean common mosaic virus， BCMV）等馬鈴薯Y病毒屬病毒的HC-Pro功能研究^[7-11]。

番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus， PLDMV， genus Potyvirus）于1954年在日本琉球群島的沖蠅首次被發(fā)現^[12]。在我國，一直以來番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus， PRSV， genusPotyvirus）是威脅我國番木瓜種植業(yè)最為嚴重的病毒病害。2012年8月，本研究組在海南種植的‘華農1號轉基因抗PRSV番木瓜果園檢測到PLDMV^[13-14]，病株表現出PRSV類似病癥（葉片褪綠，黃化，嵌紋，皺縮和畸形;葉柄及嫩莖上會產生水浸狀斑;果實上產生水漬狀斑點，造成果實甜度，口感和風味下降，嚴重時可致果實畸形），極易被誤認為感染PRSV，但2種病毒之間并無血清學關系^[12]。HC-Pro蛋白對于解析PLDMV的致病機理以及病情防控策略研究至關重要。目前還沒有純化PLDMV HC-Pro的相關研究，因此本研究通過構建HC-Pro N端攜帶含28個氨基酸Twin-Strep標簽的PLDMV全長侵染性克隆pPLDMV-Strep侵染番木瓜植株，利用Twin-Strep蛋白標簽親和層析分離純化PLDMV HC-Pro蛋白，為后續(xù)研究其在病毒的侵染過程中的功能及與寄主蛋白互作機制奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1? 植物材料與菌株? 本研究所采用的植物材料‘蜜紅番木瓜幼苗種植于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所溫室;野生型PLDMV侵染性克隆pPLDMV-WT由本研究組構建^[15];農桿菌GV3101（pSoup）感受態(tài)細胞采購于上海唯地生物技術有限公司。

1.1.2? 儀器與試劑? 使用TaKaRa公司的Prime?STAR^?Max DNA Polymerase進行基因片段擴增;產物回收試劑盒FastPure^?Gel DNA Extraction Mini Kit、菌液PCR鑒定Taq酶2×RapidTaqMaster Mix采購自Vazyme公司;天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進行RNA提取，Thermo Scientific 公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA的合成;In-Fusion連接酶、DL5000 Marker以及DL15000 Marker均采購于TaKaRa公司、德國IBA公司的Strep- Tactin^@XT親和層析柱進行蛋白純化;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、彩色預染分子蛋白質分子量標準等均購置武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1? 引物設計及基因擴增? 為了將Twin-Strep標簽（WSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQF EK）插入P1與HC-Pro酶切位點MYHY/SD之后的位置，構建HC-Pro N端攜帶Twin-Strep標簽的PLDMV侵染性克隆載體pPLDMV-Strep，本研究基于PLDMV-WT基因組全長序列（GenBank accession no. JX974555），設計引物對Strep-HC-F / PLDMV9068-R和PLDMV9045-F / Strep-HC-R（表1），其中引物Strep-HC-F/R中均含有Twin- Strep部分編碼序列。分別利用這2對引物對，以pPLDMV-WT為模板進行PCR擴增基因片段I和II（圖1）。片段I包含7494 nt的PLDMV-WT核苷酸序列（第1575～9068 nt）和Twin-Strep標簽N端編碼序列（第33～84 nt）;片段II包含2659?nt的PLDMV-WT核苷酸序列（第1～1574?nt，9069～10153 nt），Twin-Strep標簽C端編碼序列序列（1～53?nt）和植物表達載體pGreenII-35S（KX826944）的骨架序列。PCR反應體系為：模板0.5 μL，PrimeSTAR Max Premix（2×）25?μL，正反向引物各0.5?μL，ddH₂O 23.5?μL。PCR反應程序如下：98℃預變性1 min;98℃變性10?s，55℃退火10?s，72℃延伸2?min 30?s，循環(huán)25次;72℃終延伸5 min。

1.2.2? In-Fusion拼接及農桿菌轉化鑒定? 按照In-Fusion試劑盒說明書，將上述PCR擴增獲得的I和II進行無縫克隆拼接，構建 pPLDMV-Strep載體。反應體系為：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2?μL，I片段4?μL，II片段4?μL。反應條件為：50℃，15?min。進一步利用本研究組建立的E. coliCell-Free one step快速構建植物病毒侵染性克隆法^[16]，將I和II的拼接產物轉化至含pSoup輔助質粒的農桿菌GV3101感受態(tài)細胞，并利用引物對pldseq1081-F/pldseq3220-R（表1）進行菌液PCR鑒定。菌液PCR反應體系為：2×RapidTaqMaster Mix酶（Vazyme）10?μL，上下游引物各1?μL，菌液2 μL，ddH₂O 7?μL。PCR的反應條件為：95℃預變性3 min;95℃變性15 s，50℃退火15 s，72℃延伸1?min，循環(huán)30次;72℃終延伸5?min。將鑒定為陽性的單克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

1.2.3? 滲透注射接種番木瓜植株? 將10?μL含測序正確的pPLDMV-Strep的農桿菌加入到5?mL含卡那霉素（50?μg/mL）與利福平（20?μg/mL）抗性的LB培養(yǎng)液中擴增培養(yǎng)，5000?r/min離心5?min后收集菌體，用農桿菌接種緩沖液[10?mmol/L MgCl₂，2.50 mmol/L MES （pH=5.7）和100 μmol/L乙酰丁香酮（AS）]將菌液重懸至OD值為0.6，暗處理3?h以上，使用無針頭的注射器對番木瓜葉片進行注射接種。同時以含有野生型番木瓜畸形花葉病毒pPLDMV-WT和pGreenII-35S空載體的農桿菌菌株為對照進行接種。對接種后的番木瓜植株進行定期觀察，并記錄發(fā)病情況。

1.2.4? PLDMV RT-PCR鑒定? 取50～100 mg葉片按照天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進行RNA提取。提取RNA后采用Thermo Scientific 公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA的合成。以cDNA為模板，利用引物對pldseq1081-F/pldseq3220-R進行PLDMV RT-PCR鑒定。PCR擴增反應體系為：cDNA 2 μL，2?PrimeSTAR^?Max DNA Polymerase 10?μL，正反向引物各0.5?μL，ddH₂O，7?μL。PCR反應程序如下：98℃預變性1?min;98℃變性10?s，55℃退火15?s，72℃延伸30?s，循環(huán)25次;72℃終延伸2 min。

1.2.5? 番木瓜總蛋白粗提取及Strep-Tactin^@XT 親和層析? 取10?g病葉經液氮充分研磨后加入30?mL蛋白提取緩沖液[100?mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），150 mmol/L KCl，10?mmol/L MgCl，10 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，1% P40，1% Protein inhibitor]。將研磨過后的樣品與蛋白提取緩沖液充分混勻后置于冰上冷卻30?min，將冷卻后的混合液以5000?r/min轉速離心30?min后，分別用0.45?μm和0.22?μm針頭過濾器將上清液過濾后得到粗提總蛋白液。最后參考德國IBA公司的Strep-Tactin^@XT層析柱說明書的方法和步驟對粗提蛋白液進行親和層析。

1.2.6? SDS-PAGE電泳及蛋白質譜檢測? 取上述層析產物進行SDS-PAGE凝膠電泳，切下目的蛋白膠條，首先利用50% ACN-50% 50?mmol/L NH₄HCO₃溶液脫色進行膠粒脫色，分別取濃度為25?ng/μL的Asp和Trypsin兩種蛋白酶（用100?mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）稀釋）對目的蛋白分別進行37℃水浴酶解16 h，酶解后獲得的樣品通過液質聯(lián)用LC-ESI-MS/MS分析，得到質譜原始結果經過軟件Byonic分析，匹配數據，得到最終蛋白質譜鑒定結果（蛋白質譜鑒定的操作流程由北京百泰派克生物科技有限公司完成）。

2? 結果與分析

2.1 構建pPLDMV-Strep所需拼接片段的克隆和In-Fusion拼接

以pPLDMV-WT為模板，分別利用引物對Strep-HC-F/PLDMV9068-R和PLDMV9045-F/ Strep-HC-R經PCR擴增構建pPLDMV-Strep所需拼接片段I（7586?bp）和片段II（5998 bp），瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：在預期大小位置出現了拼接片段I和II的特異條帶。利用In-Fusion策略，將這上述2個片段I和II進行拼接后，其產物凝膠電泳結果顯示（圖2）：除了拼接片段I和II外，還出現了一條14?000?bp左右的基因片段與預期13?576?bp結果一致，說明I和II已成功拼接，其產物可進一步進行農桿菌轉化。

2.2 基于農桿菌的pPLDMV-Strep侵染性克隆的構建

將上述拼接片段I和II In-Fusion拼接產物進行農桿菌轉化。隨機挑選6個農桿菌轉化子，利用引物pldseq1081-F和pldseq3220-R進行菌液PCR鑒定，結果顯示：3～8號菌液均擴增出預期大小的片段（2223?bp）（圖3A）。選取3號泳道的菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果顯示：Twin-Strep標簽序列正確的插入到了P1與HC-Pro酶切位點MYHY/SD后的位置（圖3B），閱讀框架無誤，成功拼接獲得了HC-Pro N端攜帶Twin-Strep標簽的PLDMV侵染性克隆載體pPLDMV-Strep。

2.3? pPLDMV-Strep的侵染性分析

利用農桿菌滲透注射技術，分別將含有pGreenII-35S、pPLDMV-WT、pPLDMV-Strep的農桿菌滲透緩沖液注射到4～5葉期的番木瓜葉片。接種20?d后發(fā)現：在接種pPLDMV-Strep和pPLDMV的植株上的新葉均出現了典型的PLDMV病癥：斑駁的花葉，葉片輕微卷曲，莖桿呈現水漬狀的現象，而對照pGreenII-35S侵染的植株則無病癥出現（圖4A）。進一步對感染了病毒的系統(tǒng)葉片Twin-Strep插入位置進行RT-PCR和測序分析證明（圖4B），基于農桿菌的pPLDMV-Strep侵染性克隆成功感染番木瓜植株，且Twin-Strep標簽插入未影響其侵染性。

2.4 親和層析分離PLDMV HC-Pro

通過分別提取感染了PLDMV-Strep和PLDMV-WT的番木瓜葉片總蛋白，經Strep- Tactin^?XT High Capacity親和層析柱純化獲得的層析產物，層析產物的SDS-PAGE分析發(fā)現（圖5），來自感染了PLDMV-Strep的樣品在55～ 72?kDa之間存在1條明顯的蛋白條帶，與預期大小帶Twin-Strep標簽的HC-Pro（Strep-HC-Pro）（56.5?kDa）一致，而無Twin-Strep標簽PLDMV-WT感染樣品對照則無任何條帶產生，初步推測來自感染PLDMV-Strep樣品層析產物在55～ 72?kDa之間出現的特異蛋白條帶為Strep-HC-Pro。

2.5? Strep-HC-Pro N/C端序列分析

進一步利用LC/ESI-MS/MS對感染PLDMV- Strep樣品層析產物在55～72 kDa之間出現的特異蛋白條帶進行蛋白N/C端測序，二級質譜圖結果表明，該條帶N端氨基酸序列（WSHPQFEK）與Twin-Strep標簽N端氨基酸序列一致（圖6A），C端氨基酸序列（DSEMKHYLVG）與PLDMV HC-Pro C端氨基酸序列一致（圖6B）。因此可以確定，利用攜帶Twin-Strep標簽PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep能夠成功分離純化出大小完整的PLDMV HC-Pro。

3? 討論

侵染性克隆是研究病毒的基因功能、侵染機理、病毒-宿主互作最為重要的基礎研究工具。PLDMV-WT基因組全長為10 153 nt，對于較大的病毒而言，如果使用傳統(tǒng)侵染性全長cDNA克隆構建法，將會擴增得到短的病毒片段，選擇合適限制性內切酶，使用連接酶將這些片段逐步組裝成質粒載體等繁瑣的亞克隆步驟^[16-18]?；谙拗菩詢惹忻负瓦B接酶的病毒侵染性克隆構建方法耗時費力，連接效率低^[19]。In-Fusion克隆技術通過識別目標DNA片段和線性化載體末端的15 bp同源序列將DNA片段和線性化載體高效地融合，該過程不需要使用任何限制性內切酶、連接酶。因此，本研究利用In-Fusion策略，將末端具有15個同源堿基的片段I（含有7586 nt PLDMV）和片段II（含2567 nt PLDMV和pGreenII-35S骨架序列）進行拼接，一步快速獲得預期大小的侵染性克隆pPLDMV-Strep。

較大的病毒基因組全長在克隆到大腸桿菌宿主細胞進行侵染性克隆的過程中，經常導致病毒基因組全長在大腸桿菌宿主細胞中出現基因片段缺失、重組、突變等不穩(wěn)定現象^{[15， 20-21]}，致使侵染性克隆構建失敗，而產生這種現象被報道與病毒基因組編碼的病毒蛋白對大腸桿菌有毒性有關。本研究為了避免PLDMV在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性，利用E. coli Cell-Free one step快速構建植物病毒侵染性克隆法避開大腸桿菌轉化過程^[15]，直接將包含pPLDMV-Strep侵染性克隆的2個片段（I和II）In-Fusion拼接產物轉化至農桿菌，成功獲得了與野生型PLDMV-WT一樣對番木瓜植株具有侵染性的攜帶Twin-Strep標簽PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep，為利用Twin-Strep蛋白標簽親和層析分離純化PLDMV HC-Pro蛋白奠定基礎。

與已報道的利用大腸桿菌原核表達體系、酵母表達體系、重組桿狀病毒、植物病毒表達體系和轉基因植物表達體系等表達、分離純化不同Potyvirus成員HC-Pro相比，本研究采用攜帶蛋白標簽的HC-Pro病毒侵染性克隆系統(tǒng)分離純化PLDMV HC-Pro優(yōu)點有：（1）通過病毒感染原宿主分離獲得的病毒蛋白能真實地反映出病毒蛋白的結構、功能特點和生物活性;（2）有效避免原核表達體系可能產生的不溶性包涵體和其他異源表達可能產生的錯誤翻譯后加工，從而影響后續(xù)功能分析。例如利用重組桿狀病毒在昆蟲細胞中表達TVMV HC-Pro，獲得的HC-Pro雖然具有蛋白酶活性但卻失去了蚜蟲傳播活性^[7]。2004年RUIZ-FERRER等^[9]利用酵母真核表達系統(tǒng)表達TEV HC-Pro，表達量達到了0.7?mg/L，但蚜蟲傳播生物活性較低。2011年FUELLGRABE等^[10]利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達ZYMV HC-Pro，可能由于蛋白表達量高或是缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類而產生了不溶性包涵體。

HC-Pro是Potyvirus病毒蛋白中功能最多且最復雜的一種，它參與病毒復制、細胞間系統(tǒng)運動、寄主植物癥狀表現及抑制寄主植物的基因沉默效應等^[22-23]。HC-Pro的多功能性預示著它們與寄主植物蛋白因子間的相互作用在病毒致病及植物防御過程中起重要作用，目前已報道與HC-Pro互作的寄主蛋白多達20余種，包括翻譯起始因子eIF4E/iso4E、環(huán)指蛋白HIP1、葉綠體蛋白質NtMinD、番木瓜鈣網蛋白PaCRT、轉錄因子RAV2等^[24-27]。另外，HC-Pro可通過與21?nt和22?nt病毒來源的siRNAs（virus-derived small interfering RNAs）雙鏈分子的競爭性結合，抑制RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex， RISC）形成，是病毒抑制植物基因沉默的一種重要反防御途徑^[3]。因此，本研究利用攜帶Twin-Strep標簽PLDMV侵染性克隆分離獲得的PLDMV HC-Pro將為后續(xù)研究其與寄主蛋白和siRNAs相互作用奠定基礎。

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