PD-Anammox快速啟動(dòng)過程中氮代謝功能基因的表達(dá)特征

劉 寧，何 陽，王德朋，楊 慶，邱晨晨，羅 琦，，黃開龍，，張徐祥

（1.南京大學(xué)金陵學(xué)院，江蘇南京 210032；2.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210023；3.南京江島環(huán)境科技研究院有限公司，江蘇南京 210019）

短程反硝化-厭氧氨氧化（PD-Anammox）耦合工藝通常以氨態(tài)氮和硝酸鹽氮作為基質(zhì)富集培養(yǎng)厭氧氨氧化菌和反硝化菌，從而實(shí)現(xiàn)耦合工藝的啟動(dòng)〔1〕。受厭氧氨氧化菌倍增周期長以及耦合工藝中有機(jī)物對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌富集的影響〔2〕，PD-Anammox耦合工藝的常規(guī)啟動(dòng)過程十分漫長〔1〕。近年有研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控進(jìn)水基質(zhì)比例，將耦合工藝初始進(jìn)水氮源由硝酸鹽改為亞硝酸鹽，待脫氮效率穩(wěn)定后逐步將亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)換為硝酸鹽氮，可以有效減輕進(jìn)水基質(zhì)（特別是進(jìn)水中的有機(jī)物）對(duì)厭氧氨氧化菌的影響，從而實(shí)現(xiàn)耦合工藝的快速啟動(dòng)〔3〕。需要指出的是，進(jìn)水基質(zhì)的變化可顯著改變微生物的代謝功能〔4〕。在長期馴化過程中，厭氧氨氧化系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能均呈現(xiàn)出明顯的演替過程〔5-8〕。目前，關(guān)于PD-Anammox耦合工藝中微生物菌群演替及其氮代謝功能基因表達(dá)隨基質(zhì)改變的瞬時(shí)響應(yīng)機(jī)制的研究較少，而相關(guān)機(jī)理的解析對(duì)耦合工藝的快速啟動(dòng)和穩(wěn)定運(yùn)行具有重要意義。

筆者擬通過切換進(jìn)水的氮源基質(zhì)類型（亞硝酸鹽氮完全轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮）實(shí)現(xiàn)耦合工藝的快速啟動(dòng)，重點(diǎn)揭示啟動(dòng)過程中微生物功能菌群的變化規(guī)律，并基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)深入解析基質(zhì)改變時(shí)功能菌群的瞬時(shí)響應(yīng)機(jī)制，闡明耦合工藝中脫氮效能恢復(fù)的微生物學(xué)機(jī)理，為實(shí)現(xiàn)PD-Anammox耦合工藝的快速啟動(dòng)提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與接種污泥

實(shí)驗(yàn)裝置為膨脹污泥床反應(yīng)器（EGSB）（見圖1），有機(jī)玻璃材質(zhì)，內(nèi)徑5 cm，有效容積1 L。運(yùn)行過程中，用恒溫槽（HX-08，無錫沃信儀器有限公司）保持反應(yīng)器內(nèi)水溫為（30±1.5）℃，水力停留時(shí)間（HRT）為8 h，同時(shí)設(shè)置回流比為10∶1。接種污泥取自實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行的厭氧氨氧化-反硝化耦合反應(yīng)器〔9〕，污泥接種量為200 mL，SS為11.3 g∕L。

圖1 EGSB耦合反應(yīng)器Fig.1 EGSB coupled reactor

1.2 PD-Anammox耦合工藝的快速啟動(dòng)

采用EGSB反應(yīng)器及模擬污水，通過改變進(jìn)水基質(zhì)比例實(shí)現(xiàn)PD-Anammox耦合工藝的快速啟動(dòng)。該過程分為3個(gè)階段（階段Ⅰ進(jìn)水氮素為氨氮和亞硝酸鹽氮，階段Ⅱ進(jìn)水氮素為氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的混合液，階段Ⅲ進(jìn)水氮素為氨氮和硝酸鹽氮），運(yùn)行時(shí)間為77 d，具體運(yùn)行情況見表1。耦合工藝運(yùn)行過程中嚴(yán)格控制反應(yīng)器內(nèi)p H在7.0～8.0，模擬污水進(jìn)水碳源的配制參照文獻(xiàn)〔10〕。為保證微生物正常生長，在1 L進(jìn)水中添加1 mL微量元素儲(chǔ)備液。運(yùn)行期間，每48 h采集1次出水樣品（3個(gè)平行），并用0.45μm濾頭過濾，統(tǒng)一保存在4℃冰箱中，用于水質(zhì)檢測(cè)。污泥樣品每次采集3個(gè)平行樣品，當(dāng)天提取污泥樣品中的RNA送往測(cè)序公司，同時(shí)在收集的污泥樣品中加入等體積的無水乙醇，置于-20℃冰箱中用于后續(xù)提取樣品總DNA。

表1 PD-Anammox耦合工藝啟動(dòng)過程中進(jìn)水水質(zhì)及污泥采樣信息Table 1 Influent quality and sludge sampling information during the start-up of PD-Anammox coupled system

1.3 分析方法

氨氮采用納氏試劑分光光度法測(cè)定；亞硝態(tài)氮采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測(cè)定；硝態(tài)氮采用紫外分光光度法測(cè)定；總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定；COD采用重鉻酸鹽法〔11〕測(cè)定。

PD-Anammox耦合工藝中總氮去除的貢獻(xiàn)率按式（1）〔12〕計(jì)算，全程反硝化貢獻(xiàn)率按式（2）計(jì)算。

式中：（NH4+-N）inf——進(jìn)水氨氮，mg∕L；

（NH4+-N）eff——出水氨氮，mg∕L；

TNinf——進(jìn)水總氮，mg∕L；

TNeff——出水總氮，mg∕L。

1.4 高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析

1.4.1 16SrRNA基因高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

采集的污泥樣品用FastDNA?Spin Kit土壤試劑盒（MP Biomedicals，美國）提取總DNA，將DNA樣品送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用ABIGeneAmp?9700型PCR儀擴(kuò)增16SrRNA基因的序列V3-V4區(qū)域〔13〕。PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)純化和建庫后上機(jī)測(cè)序。原始數(shù)據(jù)通過qiime2軟件合并數(shù)據(jù)，再通過質(zhì)量篩選、模塊降噪后生成特征表和代表序列，最終獲得物種分類信息。

1.4.2 宏基因組測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

對(duì)DNA樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序，每個(gè)樣品的測(cè)序深度為6 GB。DNA數(shù)據(jù)處理流程如圖2所示。

圖2 DNA數(shù)據(jù)處理流程Fig.2 Flow of DNA data processing

1.4.3 宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

污泥樣品中的RNA采用全式金試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）提取，將RNA樣品置于干冰中寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)樣品的測(cè)序深度為6 GB。RNA原始數(shù)據(jù)處理流程如圖3所示。

圖3 RNA原始數(shù)據(jù)處理流程Fig.3 Flow of raw RNA data processing

1.4.4 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

挑選LDA絕對(duì)值＞4.0物種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在線 分 析 網(wǎng) 址http：∕∕huttenhower.sph.harvard.edu∕galaxy∕。利用T-檢驗(yàn)對(duì)水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行差異性分析，再用R語言EasyAovWlxPlot程序包對(duì)菌群豐度和氮代謝基因進(jìn)行方差分析，將符合正態(tài)分布、方差齊性＞0.05的平行數(shù)據(jù)用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析，不同字母表示具有顯著性差異（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 PD-Anammox耦合工藝的快速啟動(dòng)

PD-Anammox耦合工藝快速啟動(dòng)過程中，出水氮素濃度及總氮去除率變化情況如圖4所示。

圖4 耦合反應(yīng)器出水氮素及其去除率變化Fig.4 Variations of effluent nitrogen and their removal rates in the coupled system

階段Ⅰ中，進(jìn)水中氨氮為30 mg∕L，亞硝酸鹽氮為30 mg∕L，硝酸鹽氮為0。從開始至運(yùn)行20 d穩(wěn)定后，總氮去除率從最初的（73.7±2.4）%升至（90.9±1.6）%，相應(yīng)的總氮負(fù)荷去除速率由0.190 kg∕（m3·d）增至0.241 kg∕（m3·d）。出水中亞硝酸鹽氮和氨氮能被完全去除，存在少量硝酸鹽氮累積（硝酸鹽氮平均值2.9 mg∕L），此時(shí)反應(yīng)器中Anammox的總氮去除貢獻(xiàn)率為100%。

階段Ⅱ中，進(jìn)水亞硝酸鹽氮降至16 mg∕L，硝酸鹽氮增至16 mg∕L，相應(yīng)的碳源質(zhì)量濃度由20 mg∕L提升至40 mg∕L。運(yùn)行前2天總氮去除率降至（77.4±0.6）%，出水中的硝酸鹽氮為10.5 mg∕L，表明進(jìn)水改變初期耦合工藝的反硝化活性較弱，導(dǎo)致硝酸鹽累積。運(yùn)行20 d后（階段Ⅱ末期），去除率回升至（89.4±0.7）%，總氮去除速率為0.224 kg∕（m3·d），此時(shí)反應(yīng)器中PD-Anammox總氮去除貢獻(xiàn)率為100%。

階段Ⅲ中，進(jìn)水硝酸鹽氮提高至33 mg∕L（COD為75 mg∕L）。進(jìn)水第1天總氮去除率突降至66.4%，出水中氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮分別為8.6、11.0、0.9 mg∕L，第2天總氮去除率上升至70.6%，第4天快速上升至76.6%；經(jīng)30余天的馴化，總氮去除率回升至（89.1±0.5）%，出水中的氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮分別為2.0、3.3、1.7 mg∕L，總氮負(fù)荷去除速率升至0.227 kg∕（m3·d）。此時(shí)PD-Anammox總氮去除貢獻(xiàn)率為97.1%，全程反硝化貢獻(xiàn)率為2.9%。綜上，氮源基質(zhì)的改變（亞硝酸鹽氮完全轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮）在短期內(nèi)顯著降低了耦合工藝的脫氮效能，但長期運(yùn)行后PD-Anammox耦合工藝與全程反硝化可達(dá)到新的平衡，從而恢復(fù)系統(tǒng)的脫氮效果。

2.2 氮源沖擊過程微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征

通過16SrRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)獲得耦合工藝中微生物群落結(jié)構(gòu)受氮源改變瞬時(shí)沖擊（階段Ⅱ切換至階段Ⅲ）時(shí)的響應(yīng)特征，結(jié)果如圖5所示。

圖5 瞬時(shí)沖擊下耦合反應(yīng)器門水平微生物的群落結(jié)構(gòu)變化Fig.5 Variations of microbial community structure（phylum level）in coupled system under transient impact

在階段Ⅱ穩(wěn)定期，變形菌門（Proteobacteria，38.0%～63.6%）、浮霉菌門（Planctomycetes，10.7%～22.5%）和綠彎菌門（Chloroflexi，8.7%～13.2%）是耦合工藝中的主要菌門。變形菌門包含廣泛的反硝化菌〔14〕，當(dāng)進(jìn)水硝酸鹽和碳源增加2 h（S1）后，變形菌門相對(duì)豐度從38.0%（S0）顯著升高至59.3%（p＜0.05），并 在 進(jìn) 水1 d后（S2）豐 度 達(dá) 到 最 大 值（63.6%），但隨后其豐度在第3天（S3）時(shí)顯著降低至42.0%，與階段Ⅲ穩(wěn)定階段（S4，42.2%）相比并無顯著差異（p＞0.05）。進(jìn)水硝酸鹽氮含量增加可誘導(dǎo)變形菌門豐度升高，表明進(jìn)水硝態(tài)氮的沖擊短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)了耦合系統(tǒng)中反硝化菌群的快速增殖〔5〕。浮霉菌門豐度在進(jìn)水2 h后降至11.9%，并在1 d后達(dá)到最低豐度（10.7%）；3 d后（S3）其豐度升至16.7%，在穩(wěn)定期豐度為12.1%。進(jìn)水改變瞬間，碳源濃度增加對(duì)厭氧氨氧化菌產(chǎn)生了抑制，導(dǎo)致浮霉菌門豐度顯著下降〔15〕。隨著厭氧氨氧化菌對(duì)進(jìn)水條件的適應(yīng)，其豐度逐漸上升，但穩(wěn)定期后碳源升高導(dǎo)致異養(yǎng)菌滋生過多，造成厭氧氨氧化菌相對(duì)豐度的降低。與此同時(shí)，異養(yǎng)菌Calditrichaeota門的豐度在穩(wěn)定運(yùn)行期間顯著高于氮源沖擊前。該菌門可利用細(xì)胞裂解的碳源和蛋白質(zhì)進(jìn)行富集生長〔16〕，是運(yùn)行后期浮霉菌門相對(duì)豐度下降的主要原因。

為進(jìn)一步了解耦合工藝快速啟動(dòng)過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況，在屬水平對(duì)微生物進(jìn)行LEfSe分析，以獲得氮源沖擊下的差異微生物信息，如圖6、圖7所示。

如圖7所示，S0～S4樣品中豐度差異最大的菌屬分別是陶厄氏菌（Thauera）、動(dòng)膠菌（Zoogloea）、球衣菌（Sphaerotilus）、Denitratisoma和JdFR_76。從進(jìn)化樹分支（圖6）可知，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）包含的5個(gè)特異性菌屬分別為陶厄氏菌（Thauera）、動(dòng)膠菌（Zoogloea）、球衣菌（Sphaerotilus）、Denitratisoma和固氮螺菌（Azospira），其中陶厄氏菌（Thauera）〔17〕、動(dòng) 膠 菌（Zoogloea）〔18〕和Denitratisoma〔19〕都屬于反硝化菌，表明γ-變形菌亞門內(nèi)反硝化菌差異物種在瞬時(shí)沖擊后的富集顯著。此外，Calorithrix（2.4%～5.8%）是耦合工藝啟動(dòng)后的差異菌，其隸屬的Calditrichaeota門豐度也在進(jìn)水沖擊后顯著上升。Calorithrix屬中包含一種新型細(xì)菌Calorithrix insularissp〔20〕，能 異 化 硝 酸 鹽 還 原 為 銨（DNRA），推測(cè)在階段Ⅲ中部分硝酸鹽被異化還原為銨鹽。

圖6 瞬時(shí)沖擊下耦合反應(yīng)器微生物群落結(jié)構(gòu)LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of microbial community structure in coupled system under transient impact

圖7 瞬時(shí)沖擊下耦合反應(yīng)器微生物群落結(jié)構(gòu)LDA分析Fig.7 LDA analysis of microbial community structure in coupled system under transient impact

為進(jìn)一步確定脫氮功能菌在氮源沖擊下的響應(yīng)特征，考察沖擊后的豐度變化情況，如圖8所示。

圖8 瞬時(shí)沖擊下耦合反應(yīng)器脫氮功能菌群的變化情況Fig.8 Variations of nitrogen removal functional bacteria in coupled system under transient impact

隨著進(jìn)水中硝酸鹽和碳源含量的增加，耦合工藝中的厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia豐度由21.9%（S0）降為11.2%（S1），1 d后（S2）達(dá)到谷值（9.5%），其原因在于有機(jī)物濃度突升對(duì)厭氧氨氧化菌產(chǎn)生一定抑制作用〔21〕。3 d后（S3）Candidatus Brocadia豐度回升至16.1%。該趨勢(shì)與總氮去除率的變化趨勢(shì)一致。在階段Ⅲ穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)期（S4），厭氧氨氧化菌豐度相對(duì)于氮源沖擊第3天后（S3 16.1%）降至11.0%，原因可能與長期運(yùn)行下異養(yǎng)菌（如Calorithrix）的滋生有關(guān)。

相對(duì)豐度較高的反硝化菌分別為Denitratisoma（2.3%～7.6%）、動(dòng) 膠 菌（2.2%～6.4%）和 陶 厄 氏 菌（2.3%～5.2%）。其中內(nèi)源性反硝化菌Denitratisoma的相對(duì)豐度在瞬時(shí)沖擊2 h后下降為2.3%，并在1 d（3.4%）和3 d（7.6%）后迅速上升，在階段Ⅲ穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)期（S4），反硝化菌Denitratisoma豐度由7.6%降至3.9%。Denitratisoma主要利用細(xì)胞死亡裂解的有機(jī)碳源富集生長〔22〕。受到氮源沖擊后，部分細(xì)胞死亡裂解促進(jìn)了Denitratisoma的生長，該菌是厭氧氨氧化菌重要的共生細(xì)菌〔23-24〕。與此同時(shí)，陶厄氏菌是多種PD-Anammox耦合工藝中的優(yōu)勢(shì)短程反硝化菌〔8，25-26〕，其豐度在瞬時(shí)沖擊2 h后也呈現(xiàn)先下降（2.3%）后上升（3.5%）的趨勢(shì)，表明Denitratisoma和陶厄氏菌是氮源沖擊后耦合工藝恢復(fù)階段的關(guān)鍵反硝化菌。

2.3 氮源沖擊過程對(duì)耦合工藝氮代謝基因差異表達(dá)的影響

利用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析氮代謝功能基因表達(dá)特征，揭示耦合工藝受氮源沖擊后的瞬時(shí)與長期響應(yīng)，以及氮源改變前后的基因變化規(guī)律，如圖9所示。

圖9 瞬時(shí)沖擊下耦合反應(yīng)器氮代謝功能基因的表達(dá)量（TPM）Fig.9 Expression of nitrogen metabolic genes in coupled system under transient impact

圖9中，當(dāng)進(jìn)水硝酸鹽和碳源升高2 h后（S1），厭氧氨氧化反應(yīng)的主要功能基因hdh∕hzo和hzsA∕B∕C表達(dá)豐度分別從階段Ⅱ運(yùn)行末期（S0）的38 652和54 505 TPM顯著下降至5 537和7 687 TPM（p＜0.05），1 d后（S2）開始顯著上升（p＜0.05），同時(shí)反應(yīng)器中的Candidatus Brocadia菌呈現(xiàn)明顯富集趨勢(shì)。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，耦合工藝脫氮效能逐漸恢復(fù)，hdh∕hzo和hzsA∕B∕C基 因 表 達(dá) 量 無 顯 著 變 化（p＞0.05），說明厭氧氨氧化反應(yīng)活性自第3天開始趨于穩(wěn)定。階段Ⅱ運(yùn)行末期（S0）的hdh∕hzo和hzsA∕B∕C基因表達(dá)活性下降，主要是由于進(jìn)水中的亞硝酸鹽氮減半，硝酸鹽難以被厭氧氨氧化菌直接利用，且碳源升高對(duì)厭氧氨氧化菌有抑制作用〔27〕。此外，穩(wěn)定時(shí)期（S4）hdh∕hzo和hzsA∕B∕C基因表達(dá)豐度顯著低于進(jìn)水改變前（S0），主要原因在于進(jìn)水中硝酸鹽和碳源濃度的升高分別促進(jìn)了反硝化細(xì)菌和異養(yǎng)菌的生長與活性〔28〕。

硝酸鹽還原基因napA∕B∕C和narB∕C、亞硝酸鹽還原基因nirS和一氧化二氮還原酶基因nosZ的表達(dá)量在進(jìn)水硝酸鹽和碳源升高2 h后（S1）下降明顯，氮源沖擊1 d后（S2），反硝化相關(guān)功能基因napA∕B∕C、nirK、nirS及nosZ表達(dá)量顯著上升（p＜0.05），S2階段反硝化相關(guān)功能基因表達(dá)量升高，其反硝化活性增強(qiáng)，系統(tǒng)中的有機(jī)物被反硝化菌利用，進(jìn)而減少了有機(jī)物對(duì)厭氧氨氧化菌活性的抑制。另外，narG∕H基因表達(dá)受到氮源沖擊后（S1～S3）表達(dá)豐度沒有顯著差異，有研究顯示narG基因豐度受NO3--N濃度變化的影響不顯著〔29-30〕。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，硝酸鹽還原基因中除napA∕B∕C基因表達(dá)量顯著下降，narB∕C∕G∕H∕I∕J∕Y∕Z基因表達(dá)量均呈顯著上升趨勢(shì)，而nosZ基因表達(dá)量無顯著變化。表明在長期適應(yīng)過程中，細(xì)胞周質(zhì)中的硝酸鹽還原活動(dòng)減弱，細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽還原活動(dòng)相對(duì)上升，而一氧化氮還原為氮?dú)獾牡x過程并未加強(qiáng)。與進(jìn)水改變前（S0）比較，穩(wěn)定時(shí)期（S4）的硝酸鹽還原酶基因narG∕H、narI∕J、narY∕Z和異化硝酸鹽還原為銨的關(guān)鍵基因nrfA∕B∕C∕D均呈顯著上升趨勢(shì)，銨化的相關(guān)功能菌（Calorithrix）的豐度（5.8%）與氮源沖擊前的豐度（2.5%）相比也明顯上升，表明在穩(wěn)定階段Calorithrix在短程反硝化過程中起到重要作用，narG基因已被證實(shí)在短程反硝化中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔31〕，高濃度硝酸鹽和碳源能促進(jìn)異化硝酸鹽為銨的反應(yīng)活性〔32〕。

2.4 氮源沖擊下耦合工藝氮代謝通路的變化趨勢(shì)

基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果，構(gòu)建了氮源沖擊條件下耦合工藝中氮代謝活性通路圖，如圖10所示。

圖10 瞬時(shí)沖擊下氮代謝通路Fig.10 Nitrogen metabolic pathways under transient shock

由基因表達(dá)活性可知，活性較高的氮代謝途徑為厭氧氨氧化作用和反硝化作用。氮源瞬時(shí)沖擊（2 h）會(huì)對(duì)上述2種氮代謝途徑產(chǎn)生抑制，其中厭氧氨氧化功能基因hdh∕hzo和hzsA∕B∕C，反硝化功能基因napA∕B∕C、norB∕C和nosZ均顯著下降（p＜0.05），總氮去除率降至最低（66.4%）。氮源沖擊1 d后，厭氧氨氧化功能基因hdh∕hzo和hzsA∕B∕C，反硝化功能基因napA∕B∕C和nosZ表達(dá)量逐步上升（p＜0.05），3 d后其基因表達(dá)量升至峰值，運(yùn)行末期厭氧氨氧化功能基因hdh∕hzo和hzsA∕B∕C表達(dá)量豐度降低且保持穩(wěn)定，反硝化作用功能基因napA∕B∕C和nosZ表達(dá)量豐度升高且趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

（1）硝酸鹽氮沖擊在短期內(nèi)顯著降低了耦合工藝的脫氮效能，但長期運(yùn)行后系統(tǒng)中的PDAnammox與全程反硝化反應(yīng)可達(dá)到新的平衡，進(jìn)而恢復(fù)系統(tǒng)的脫氮效能。

（2）進(jìn)水硝酸鹽氮含量升高導(dǎo)致變形菌門豐度升高，碳源濃度的增加導(dǎo)致浮霉菌門豐度顯著下降。γ-變形菌門內(nèi)的不同反硝化菌種在受到氮源瞬時(shí)沖擊后富集情況差異顯著，Calorithrix為耦合工藝啟動(dòng)后最主要的差異菌屬。Candidatus Brocadia為氮源沖擊后耦合工藝恢復(fù)效能的關(guān)鍵厭氧氨氧化功能菌，Denitratisoma和陶厄氏菌為氮源沖擊后耦合工藝恢復(fù)效能的關(guān)鍵反硝化功能菌。

（3）氮源沖擊會(huì)抑制耦合工藝中的厭氧氨氧化和反硝化氮代謝途徑。其中，厭氧氨氧化功能基因hdh∕hzo和hzsA∕B∕C，硝 酸 鹽 還 原 基 因napA∕B∕C和narB∕C，亞硝酸鹽還原基因nirS、一氧化二氮還原酶基因nosZ表達(dá)量均顯著下降；氮源沖擊引起的抑制作用在1 d后開始減弱，hdh∕hzo和hzsA∕B∕C，napA∕B∕C和nosZ基因表達(dá)量顯著上升；系統(tǒng)恢復(fù)脫氮效能穩(wěn)定運(yùn)行后，與沖擊前相比，hdh∕hzo和hzsA∕B∕C基因表達(dá)豐度降低，nosZ基因表達(dá)量升高。