硫酸軟骨素螯合鋅的制備、表征及體外生物活性

高 然，蘇 贇，陳俊德, ，鄭美華

（1.自然資源部第三海洋研究所，自然資源部海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361001；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021）

鋅是人體必需微量元素之一，以二價(jià)陽離子形式存在于皮膚、肌肉和骨骼中。鋅作為人體抗氧化酶、DNA聚合酶和其他基質(zhì)金屬蛋白酶等體內(nèi)多種酶的主要組成成分和酶促因子，可人體調(diào)節(jié)碳水化合物、脂肪及蛋白質(zhì)的代謝活動，對人體的維生素代謝、細(xì)胞免疫及生長發(fā)育等方面具有重要作用[1?2]。缺鋅易引發(fā)人體多種生物學(xué)功能降低，如生長功能下降、免疫系統(tǒng)受損、內(nèi)分泌系統(tǒng)失衡等[3?4]。目前，市面上常見的補(bǔ)鋅劑多為硫酸鋅和葡萄糖酸鋅，此類產(chǎn)品以鋅離子形式進(jìn)入人體后，一方面胃酸的分泌影響鋅離子的吸收，一方面在消化道中，鋅離子幾乎不能穿過腸道粘膜[5]，導(dǎo)致人體對鋅離子的吸收率和利用度較低[6]。

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一種以蛋白聚糖形式存在的線性糖胺聚糖，分子結(jié)構(gòu)中主要的活性基團(tuán)為羧基和磺酸基團(tuán)[7?9]，可與鋅離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成硫酸軟骨素鋅螯合物[10?12]。硫酸軟骨素鋅螯合物以有機(jī)結(jié)合態(tài)穿過小腸粘膜屏障，可有效降低游離鋅離子對胃腸道粘膜的刺激[13]。當(dāng)釋放鋅離子后，CS配體還可繼續(xù)發(fā)揮其生物活性。

市場上現(xiàn)有的以CS和鋅為主要成分的補(bǔ)鋅劑產(chǎn)品，只是將CS和無機(jī)鋅鹽進(jìn)行簡單混合，并沒有形成真正意義上的硫酸軟骨素鋅配位化合物，無法避免胃腸環(huán)境對鋅離子的干擾。本研究以硫酸軟骨素和硫酸鋅為原料，采用生物螯合技術(shù)，將游離鋅離子以共價(jià)鍵形式結(jié)合到硫酸軟骨素上，形成結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的硫酸軟骨素螯合鋅制品。硫酸軟骨素螯合鋅作為一種既可補(bǔ)充鋅離子，同時(shí)又具有多種生物活性的新型多糖補(bǔ)鋅劑，市場上未見相關(guān)產(chǎn)品。本論文采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化硫酸軟骨素螯合鋅的制備工藝，并分析其結(jié)構(gòu)特征和體外消化吸收特性，為新型補(bǔ)鋅劑的開發(fā)提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯊魚源硫酸軟骨素（含量90%） 實(shí)驗(yàn)室自制；七水合硫酸鋅、氫氧化鈉 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、濃硝酸、濃鹽酸、無水乙醇、溴化鉀 均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；高氯酸 優(yōu)級純，天津政成化學(xué)制品有限公司；鋅單元素標(biāo)準(zhǔn)液（1000 Ug/mL） 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；人工胃液（無菌）、人工腸液（無菌）

福州飛凈生物科技有限公司；透析袋（3500 Da）蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限回公司。

Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；SG2便攜式pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器

蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LyoBeta 25冷凍干燥機(jī) 泰事達(dá)機(jī)電設(shè)備（上海）有限公司；UV1780紫外可見分光光度計(jì)、AA-6880原子分光光度計(jì) 日本島津儀器公司；Tensor27 &Tensor37紅外光譜儀

布魯克光譜儀器公司；TGA2（SF）熱重分析儀 梅特勒-托利多中國；Nano ZS90 Zeta電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；PA Nalytical X射線衍射儀荷蘭帕納科公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸軟骨素螯合鋅的制備 將硫酸軟骨素溶于50 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)螯合反應(yīng)溫度、pH，條件穩(wěn)定后加入5 g七水合硫酸鋅進(jìn)行螯合，10000 r/min，4 ℃下離心10 min去除沉淀，取上清液。在4 ℃條件下，向上清液中加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉處理，醇沉?xí)r間為2 h，取醇沉樣將其冷凍干燥即得硫酸軟骨素螯合鋅樣品[14]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 pH對鋅螯合率的影響 稱取硫酸軟骨素、七水合硫酸鋅，使反應(yīng)體系中七水合硫酸鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅的質(zhì)量比1:1，設(shè)定反應(yīng)溫度50 ℃，調(diào)節(jié)pH（3、4、5、6、7），反應(yīng)時(shí)間2 h，得硫酸軟骨素螯合鋅溶液，經(jīng)乙醇醇沉、冷凍干燥，制得硫酸軟骨素螯合鋅固體樣品，并測定樣品鋅螯合率。

1.2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對鋅螯合率的影響 稱取硫酸軟骨素、七水合硫酸鋅，使反應(yīng)體系中七水合硫酸鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅的質(zhì)量比1:1，設(shè)定反應(yīng)溫度50 ℃，pH4，分別反應(yīng)0.5、1、2、4和6 h，得硫酸軟骨素螯合鋅溶液，經(jīng)乙醇醇沉、冷凍干燥，制得硫酸軟骨素螯合鋅固體樣品，測定樣品鋅螯合率。

1.2.2.3 硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅質(zhì)量比對鋅螯合率的影響 稱取硫酸軟骨素、七水合硫酸鋅，使反應(yīng)體系中七水合硫酸鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，硫酸軟骨素（m1）與七水合硫酸鋅（m2）的質(zhì)量比分別為0.1:1、0.5:1、1:1、2:1和5:1，設(shè)定反應(yīng)溫度50 ℃，pH4，反應(yīng)時(shí)間2 h，得硫酸軟骨素螯合鋅溶液，經(jīng)乙醇醇沉、冷凍干燥，制得硫酸軟骨素螯合鋅固體樣品，測定樣品鋅螯合率。

1.2.2.4 反應(yīng)溫度對鋅螯合率的影響 稱取硫酸軟骨素、七水合硫酸鋅，使反應(yīng)體系中七水合硫酸鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅的質(zhì)量比1:1，設(shè)定反應(yīng)溫度（20、30、40、50、60 ℃），pH4，反應(yīng)時(shí)間2 h，得硫酸軟骨素螯合鋅溶液，經(jīng)乙醇醇沉、冷凍干燥，制得硫酸軟骨素螯合鋅固體樣品，測定樣品鋅螯合率。

1.2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定七水合硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，選取pH、反應(yīng)時(shí)間（h）、硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅的質(zhì)量比（m1:m2）、反應(yīng)溫度（℃）為試驗(yàn)考察因素，鋅的螯合率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)確定硫酸軟骨素螯合鋅的最佳螯合工藝。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 鋅螯合率的測定 參照GB 5009.14-2017《食品中鋅的測定》中火焰原子吸收法測定單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)中硫酸軟骨素螯合鋅樣品中鋅的含量。按照公式（1）計(jì)算鋅的螯合率。

式中：X為鋅螯合率（%），M為螯合物中鋅的含量（g），M0為反應(yīng)體系中鋅的總含量（g）。

1.2.5 硫酸軟骨素螯合鋅結(jié)構(gòu)表征

1.2.5.1 紫外光譜分析 分別稱取硫酸軟骨素螯合鋅凍干樣品、硫酸軟骨素樣品和硫酸鋅樣品溶于蒸餾水中，配成1 mg/mL溶液，用紫外-可見光分光光度計(jì)在200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描[15]。

1.2.5.2 紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法，按照1:100比例分別將硫酸軟骨素螯合鋅凍干樣品、硫酸軟骨素樣品和硫酸鋅樣品與溴化鉀研磨均勻，制成半透明狀薄片，溴化鉀做測試對照，在400～4000 cm?1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描[16]。

1.2.5.3 掃描電鏡分析 分別將硫酸軟骨素螯合鋅凍干樣品和硫酸軟骨素樣品用導(dǎo)電膠粘結(jié)在鋁制樣品座上，放置于真空鍍膜機(jī)內(nèi)，樣品表面噴金鍍膜，在掃描電鏡下觀察樣品微觀形態(tài)并照相。放大倍數(shù)為3000倍和24000倍[16]。

1.2.5.4 熱重分析 分別稱取硫酸軟骨素樣品和硫酸軟骨素螯合鋅樣品，溫度由30 ℃升至600 ℃，以10 ℃/min的速率升溫，在氮?dú)馔繛?0 mL/min環(huán)境下進(jìn)行熱重分析。以溫度為X軸，以質(zhì)量損失率（某一溫度下質(zhì)量損失后樣品的實(shí)測質(zhì)量與樣品總質(zhì)量的比值）為Y軸，繪制熱重變化曲線[17]。

1.2.5.5 X射線衍射分析 將硫酸軟骨素螯合鋅樣品、硫酸軟骨素樣品和硫酸鋅樣品分別用瑪瑙研缽研至無顆粒感為佳，裝入制樣框，插入樣品臺，設(shè)置CuKα射線，在5～80°衍射角度范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)掃描，確定結(jié)構(gòu)信息[18]。

1.2.6 硫酸軟骨素螯合鋅生物利用率

1.2.6.1 體外模擬胃腸道消化吸收 模擬胃消化：分別取10 mg/mL的硫酸軟骨素螯合鋅和硫酸鋅溶液，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH到2，向溶液中加入5 mL模擬胃液，放置于37 ℃水浴中振蕩2 h，反應(yīng)結(jié)束后，將溶液置于100 ℃水浴中10 min滅酶。模擬腸吸收：取胃消化液，用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到7，向溶液中加入5 mL模擬腸液，將混合溶液裝入透析袋中（3500 Da），放置于37 ℃水浴中震蕩2 h，反應(yīng)結(jié)束后，將溶液置于100 ℃水浴中10 min滅酶[19]。

1.2.6.2 鋅離子溶解率的測定 分別測定模擬胃消化溶液和模擬腸吸收溶液中鋅離子的溶解率。取兩種溶液10000 r/min離心10 min，采用1.2.4中鋅含量測定方法，分別測定上清液中鋅離子的含量和溶液中總鋅離子的含量。按照公式（2）計(jì)算鋅離子溶解率。

式中：C1為上清液中鋅離子的濃度（mg/mL），C2為溶液中鋅離子的濃度（mg/mL）。

1.2.6.3 鋅離子透過率的測定 測定模擬腸吸收溶液中鋅離子的透過率。模擬膜吸收結(jié)束后，分別測定透析袋外的溶液中鋅離子的含量和溶液中總鋅離子的含量。按照公式（3）計(jì)算鋅離子透過率。

式中：C1為透析袋外鋅離子的濃度（mg/mL），C2為溶液中鋅離子的濃度（mg/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文中單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)（n=3），取平均值，數(shù)據(jù)表示為±S（S：標(biāo)準(zhǔn)差）。采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），不同字母代表差異顯著（P<0.05），用Origin 9.1軟件完成作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH對鋅螯合率的影響 由圖1可知，隨著pH增大，鋅螯合率先上升后下降，pH4時(shí)鋅螯合率最高（78.68%±1.04%）。pH小于4時(shí)，體系中存在大量氫離子，氫離子與鋅離子爭奪供電基團(tuán)[20]，不利于螯合反應(yīng)進(jìn)行；pH大于4時(shí)，鋅離子的螯合能力減弱，優(yōu)先與體系中的氫氧根離子形成氫氧化鋅沉淀，使得鋅離子不能充分與硫酸軟骨素進(jìn)行螯合反應(yīng)[21]。測定硫酸軟骨素螯合鋅在不同pH時(shí)的電位值，pH3（ζ=20.5 mV）>pH4（ζ=15.8 mV）>pH5（ζ=?7.3 mV）>pH6（ζ=?16.7 mV）>pH7（ζ=?23.6 mV），推測螯合物的等電點(diǎn)（PI）[22]位于4附近，此時(shí)，鋅離子與硫酸軟骨素形成螯合物后更有利于聚集反應(yīng)發(fā)生。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)pH為4。

圖1 pH對鋅螯合率的影響Fig.1 Effect of pH on the chelation rate of zinc

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對鋅螯合率的影響 由圖2可知，在0.5～2 h范圍，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，硫酸軟骨素與鋅離子的結(jié)合更為充分，鋅螯合率顯著上升（P<0.05），反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)，鋅螯合率達(dá)到最高（71.39%±0.81%），當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，鋅螯合率呈現(xiàn)下降態(tài)勢。其主要原因是，在酸性的反應(yīng)體系中，若反應(yīng)時(shí)間過長，反應(yīng)體系穩(wěn)定性降低，極易引起螯合物中的糖苷結(jié)構(gòu)斷裂[23]或硫酸基水解[24]，影響螯合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致鋅螯合率降低[25?26]。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)時(shí)間為2 h。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對鋅螯合率的影響Fig.2 Effect of reaction time on the chelation rate of zinc

2.1.3 硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅質(zhì)量比對鋅螯合率的影響 由圖3可知，硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅質(zhì)量比在0.1:1～1:1范圍內(nèi)時(shí)，鋅螯合率呈現(xiàn)增大趨勢，在比值為1:1時(shí)，鋅螯合率最高（78.73%±1.55%），在比值大于1:1時(shí)，鋅螯合率呈現(xiàn)下降趨勢。增加硫酸軟骨素在體系中的占比，可以增加反應(yīng)物的接觸幾率，更易形成環(huán)狀螯合結(jié)構(gòu)，提高螯合率，但硫酸軟骨素與鋅離子結(jié)合的位點(diǎn)有限[27]，加入過多硫酸軟骨素不僅使螯合液過于黏稠，不利于反應(yīng)進(jìn)行，同時(shí)也會影響螯合物形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，降低螯合率[28]。在質(zhì)量比為1:1時(shí)，與鋅離子作用的硫酸軟骨素結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅質(zhì)量比為1:1。

圖3 質(zhì)量比對鋅螯合率的影響Fig.3 Effect of mass ratio on the chelation rate of zinc

2.1.4 反應(yīng)溫度對鋅螯合率的影響 由圖4可知，反應(yīng)溫度對鋅螯合率的影響較為顯著。鋅螯合率隨著反應(yīng)溫度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢。反應(yīng)體系在較低溫度范圍（20～30 ℃）時(shí)，鋅螯合率呈現(xiàn)升高態(tài)勢。其主要原因可能是，從動力學(xué)角度分析，升高溫度有利于分子間運(yùn)動，增加硫酸軟骨素與鋅離子的結(jié)合幾率，有利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行[29]。從空間結(jié)構(gòu)角度講，在相對適宜的溫度范圍內(nèi)，糖鏈結(jié)構(gòu)較為舒展，與鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)暴露的較多[30]。反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí)，鋅螯合率最高（75.74%±3.71%）。由于螯合反應(yīng)為放熱反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，阻礙了螯合反應(yīng)的進(jìn)行。同時(shí)溫度過高，致使硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差，分子間易發(fā)生聚團(tuán)現(xiàn)象，導(dǎo)致與鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)減少[31]，鋅螯合率降低。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對鋅螯合率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the chelation rate of zinc

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果如表2和表3所示。由表2可知，4因素對鋅螯合率的影響大小的順序依次為C>D>A>B，即硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅質(zhì)量比影響最大，其次是反應(yīng)溫度，pH次之，反應(yīng)時(shí)間的影響最小[32]。通過比較各因素的均值大小確定最佳反應(yīng)組合A2B1C2D2，即pH4，反應(yīng)時(shí)間1 h，硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅質(zhì)量比1:1，反應(yīng)溫度30 ℃。由表3可知，4因素中質(zhì)量比對鋅螯合率的影響顯著（P<0.05），而pH、時(shí)間及溫度對鋅螯合率的影響不顯著（P>0.05）。選取正交試驗(yàn)最佳工藝A2B1C2D2，在此實(shí)驗(yàn)條件下開展驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得鋅螯合率為（80.6%±1.31%），優(yōu)于所有正交試驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)成功。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal design and results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of variance analysis

2.3 硫酸軟骨素螯合鋅結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外光譜分析 如圖5所示，硫酸軟骨素的最強(qiáng)吸收峰在204 nm，該峰為多糖的特征吸收峰，是多糖中的發(fā)色基團(tuán)發(fā)生電子躍遷引起[33]，硫酸軟骨素螯合鋅的多糖特征吸收峰出現(xiàn)在212 nm。吸收峰藍(lán)移是由于鋅離子結(jié)合在氧原子和氮原子上導(dǎo)致了n→π﹡躍遷[34]。同時(shí)，硫酸軟骨素在255 nm處出現(xiàn)一弱吸收峰，與鋅離子螯合之后，吸收峰藍(lán)移至260 nm。這是鋅離子與多糖分子中的發(fā)色基團(tuán)結(jié)合后，基團(tuán)偏振的結(jié)果[35]。此外，硫酸軟骨素螯合鋅的吸光度明顯強(qiáng)于硫酸軟骨素，原因可能是鋅離子結(jié)合后導(dǎo)致的電荷轉(zhuǎn)移[36]。硫酸鋅在200～600 nm近紫外-可見光區(qū)未顯示特征吸收。紫外光譜表明鋅離子與硫酸軟骨素結(jié)合形成了螯合物，吸收峰的藍(lán)移及強(qiáng)度變化表明發(fā)色基團(tuán)與鋅離子螯合過程中發(fā)生了極化變化。

圖5 硫酸軟骨素螯合鋅及硫酸軟骨素和硫酸鋅的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of chondroitin sulfate chelated zinc,chondroitin sulfate and zinc sulfate

2.3.2 紅外光譜分析 為進(jìn)一步研究分子結(jié)構(gòu)的變化，采用紅外光譜研究了分子振動和不同原子間的極性鍵，如圖6所示。硫酸軟骨素螯合鋅的紅外光譜在參數(shù)和形狀上與硫酸軟骨素類似。3591.08 cm?1處為硫酸軟骨素羥基的伸縮振動峰，與鋅螯合后，該峰紅移至3556.30 cm?1，這是由于感應(yīng)效應(yīng)或偶極場效應(yīng)改變了羥基的電子云密度[37]，與Wang等[38]的報(bào)道一致。1658.35和1425.74 cm?1處為硫酸軟骨素羧基中羰基的特征伸縮振動峰，與鋅螯合后，該峰分別紅移至1647.04和1418.18 cm?1，說明羧基參與了螯合物的形成[39]；1256.78和1043.61 cm?1處為硫酸軟骨素磺酸基的非對稱拉伸振動峰和對稱拉伸振動峰，與鋅螯合后，該峰分別移動至1239.53和1114.16 cm?1，說明磺酸基參與了螯合反應(yīng)[40]。硫酸軟骨素螯合鋅圖譜的指紋區(qū)617.02 cm?1處有一弱吸收峰，推測為Zn-O的彎曲振動峰。紅外光譜結(jié)果表明，鋅離子與硫酸軟骨素成功配位，這種吸收峰的位移和強(qiáng)度變化，可能是Zn-O鍵形成和配合物物理吸附的結(jié)果[41]。

2.3.3 掃描電鏡分析 采用掃描電鏡觀察硫酸軟骨素及硫酸軟骨素螯合鋅的微觀形貌結(jié)構(gòu)差異，如圖7所示。放大3000倍可以看到，如圖7A、圖7B所示。二者都為不規(guī)則顆粒體，硫酸軟骨素表面光滑，呈現(xiàn)層狀結(jié)構(gòu)；硫酸軟骨素螯合鋅表面較粗糙，呈現(xiàn)顆粒的凹凸?fàn)顟B(tài)。放大24000倍可看到，如圖7C、圖7D所示。硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)松散，有許多不規(guī)則尺寸空腔，與報(bào)道的多糖表面形態(tài)一致[42]；硫酸軟骨素螯合鋅則呈現(xiàn)顆粒狀的緊密結(jié)構(gòu)，主要原因可能是鋅與硫酸軟骨素之間形成配位鍵改變了內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)致密[43]。由此推測，硫酸軟骨素螯合鋅與硫酸軟骨素的形貌區(qū)別是由于鋅離子與硫酸軟骨素發(fā)生了螯合反應(yīng)，形成了硫酸軟骨素螯合鋅的微顆粒導(dǎo)致的。

圖7 硫酸軟骨素螯合鋅及硫酸軟骨素的掃描電鏡圖Fig.7 SEM spectra of chondroitin sulfate chelated zinc and chondroitin sulfate

2.3.4 熱重分析 利用熱重分析法分析熱穩(wěn)定性差異，如圖8A、圖8B所示。根據(jù)熱重分析的結(jié)果，硫酸軟骨素及硫酸軟骨素螯合鋅的失重均分為三個(gè)階段。第一階段30～150 ℃，質(zhì)量損失是失水所致。硫酸軟骨素質(zhì)量損失率15.39%；相比之下，硫酸軟骨素螯合鋅質(zhì)量損失率18.69%，說明硫酸軟骨素螯合鋅分子中的結(jié)晶水散失率大于硫酸軟骨素。第二階段

圖8 硫酸軟骨素（A）及硫酸軟骨素螯合鋅（B）的熱重曲線圖Fig.8 Thermogravimetric curve of chondroitin sulfate（A） and chondroitin sulfate chelated zinc（B）

150～300 ℃，主要是由樣品化學(xué)鍵和基本結(jié)構(gòu)的熱降解[44]引發(fā)的。此階段，硫酸軟骨素質(zhì)量損失率29.55%；相比之下，硫酸軟骨素螯合鋅質(zhì)量損失率18.26%，原因可能是硫酸軟骨素與鋅離子形成了配位鍵，破壞化學(xué)鍵需要更多能量[45]。第三階段300～600 ℃，硫酸軟骨素質(zhì)量損失率15.59%，推測是多糖已經(jīng)碳化，從而導(dǎo)致失重緩慢[46]；相比之下，硫酸軟骨素螯合鋅質(zhì)量損失率20.68%，并在504.17 ℃時(shí)失重迅速，可能是由于硫酸軟骨素螯合鋅出現(xiàn)結(jié)晶度，熔點(diǎn)向更高溫度移動[47]。以上結(jié)果表明，硫酸軟骨素和硫酸軟骨素螯合鋅的熱力學(xué)性能有很大不同，與硫酸軟骨素相比，硫酸軟骨素螯合鋅是一種更穩(wěn)定的物質(zhì)，這與Zhang等[48]對多糖鋅螯合物的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果一致。

2.3.5 X射線衍射分析 通過X射線衍射分析反映物質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)信息，如圖9所示。硫酸鋅有明顯的結(jié)晶衍射峰，分別在17.92°、20.22°、22.09°等三處有強(qiáng)衍射峰，并且出現(xiàn)多個(gè)小峰。硫酸軟骨素為非晶態(tài)結(jié)構(gòu)，不具有周期性結(jié)構(gòu)，只能觀察到衍射值最大所對應(yīng)的漫反射區(qū)[49]，呈現(xiàn)“饅頭”狀。硫酸軟骨素螯合鋅與硫酸軟骨素有著顯著差別，在“饅頭”峰區(qū)域19.56°、27.11°等兩處出現(xiàn)明顯的尖峰，說明硫酸軟骨素與鋅螯合后，在空間結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生新的相互作用力，形成了有序晶體結(jié)構(gòu)[39]。硫酸軟骨素螯合鋅并不包含硫酸鋅的特征衍射峰，說明鋅與硫酸軟骨素螯合后廣泛分布于糖鏈中。

圖9 硫酸軟骨素、硫酸鋅及硫酸軟骨素螯合鋅的X射線衍射圖Fig.9 X-ray diffraction pattern of chondroitin sulfate，zinc sulfate and chondroitin sulfate chelated zinc

2.4 硫酸軟骨素螯合鋅生物利用率分析

以硫酸鋅作為參照，評價(jià)硫酸軟骨素螯合鋅在胃腸道環(huán)境中的生物利用率，如圖10所示。硫酸軟骨素螯合鋅和硫酸鋅在胃消化階段的鋅溶解率分別為（94.86%±1.02%）、（91.53%±0.87%）。當(dāng)轉(zhuǎn)移至腸消化階段時(shí)，二者的鋅溶解率分別為（63.01%±2.56%）、（39.83%±1.41%），鋅透過率分別為（33.86%±1.68%）、（16.39%±2.42%）。在胃消化階段，酸性環(huán)境有利于鋅離子的釋放和溶解[50]，硫酸軟骨素螯合鋅和硫酸鋅均有較好的溶解性。在腸消化階段，硫酸鋅的鋅溶解率及鋅透過率均不及硫酸軟骨素螯合鋅，這是由于在腸液較高的pH環(huán)境中，硫酸鋅易形成不溶性的鋅化合物[51]，而腸道無法吸收。硫酸軟骨素螯合鋅因其較穩(wěn)定的配位鍵，在胃腸環(huán)境中的溶解性和穩(wěn)定性比硫酸鋅有明顯優(yōu)勢，并能以螯合物分子的形式透過腸道屏障[13]，比硫酸鋅更易被胃腸消化吸收，生物利用率更高，與Yonekura等[52]研究殼聚糖可提高體內(nèi)鋅生物利用度的結(jié)果一致。

圖10 體外模擬實(shí)驗(yàn)中硫酸軟骨素螯合鋅與硫酸鋅的生物利用率Fig.10 Comparison of bioavailability between chondroitin sulfate chelated zinc and zinc sulfate in vitro simulation experiment

3 結(jié)論

本研究以硫酸軟骨素和硫酸鋅為原料，利用螯合反應(yīng)制備了一種新型補(bǔ)鋅劑硫酸軟骨素螯合鋅。通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定硫酸軟骨素螯合鋅的最佳制備條件為：pH4，反應(yīng)時(shí)間1 h，硫酸軟骨素與七水合硫酸鋅質(zhì)量比1:1，反應(yīng)溫度30 ℃，此條件下鋅螯合率為80.6%±1.31%，硫酸軟骨素表現(xiàn)出良好的鋅螯合能力。紫外光譜證實(shí)鋅離子可以有效地與硫酸軟骨素結(jié)合，紅外光譜進(jìn)一步證明鋅離子與硫酸軟骨素螯合形成了Zn-O，螯合位點(diǎn)為羥基氧、羧基氧、磺酸基氧。掃描電鏡、熱重分析及X射線衍射分析結(jié)果表明，與鋅離子螯合，導(dǎo)致硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成了更為穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)和微顆粒的聚集。體外模擬消化吸收實(shí)驗(yàn)證明，硫酸軟骨素螯合鋅在胃腸中的溶解率與透過率均優(yōu)于硫酸鋅，具有良好的生物利用率。硫酸軟骨素與鋅離子的有效結(jié)合，不僅保留了硫酸軟骨素所具有的生物學(xué)功能，又有補(bǔ)鋅功效，有望開發(fā)成一種具有多種保健功能的生物多糖型補(bǔ)鋅劑。