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    響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取冬凌草甲素工藝及其抗腫瘤活性研究

    2022-04-26 10:34:26王吉鴻陳彥亮王廣宇
    食品工業(yè)科技 2022年9期
    關(guān)鍵詞:冬凌草甲素存活率

    郭 杰 ,郝 楠,陶 蕾,王吉鴻,陳彥亮,王廣宇

    (1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系,甘肅 蘭州 730070;2.河南省中藥材生產(chǎn)技術(shù)推廣中心,河南 鄭州 450000)

    當(dāng)今,惡性腫瘤因其高死亡率、低治愈率,嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),世界范圍內(nèi)僅2020年新出現(xiàn)的惡性腫瘤患者便高達(dá)1929萬例,其中,我國占23.69%(457萬例),位居全球第一,其治療已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域面對(duì)的重大難題之一[1?3]。由于現(xiàn)階段的治療手段存在損傷正常的機(jī)體組織,導(dǎo)致患者出現(xiàn)免疫力降低、肝腎功能受損或骨髓抑制等不良反應(yīng)[4?6]。所以尋找一種高效、綠色、安全的腫瘤治療藥物已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。冬凌草(Rabdosia rubescens)為唇形科香茶菜屬碎米椏的干燥地上部分,資源在我國甘肅、陜西、河南等黃河流域均有廣泛分布,最早收載于《救荒本草》,現(xiàn)被收載于《中國藥典》[7]。中醫(yī)認(rèn)為冬凌草味苦、甘,性微寒,具有清熱解毒、活血止痛、消炎抑菌和抑制腫瘤等功效,用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎、蛇蟲咬傷等病癥,并對(duì)食管癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、膀耽癌等多種癌癥療效顯著[8]。現(xiàn)代臨床實(shí)驗(yàn)證明,冬凌草通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控癌細(xì)胞周期、改變生物膜的通透性等方式實(shí)現(xiàn)腫瘤抑制的效果[9]。

    冬凌草作為中醫(yī)傳統(tǒng)治療腫瘤的藥物,其有效成分的開發(fā)利用有望為現(xiàn)有的天然活性抗腫瘤藥物研究提供方向,近來年的研究發(fā)現(xiàn),冬凌草中的有效成分——冬凌草甲素,因其具有抗腫瘤、抗菌抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用成為當(dāng)今抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)[10]。目前,冬凌草甲素的提取方法主要為索氏提取法、熱回流提取法和溶液浸提法等,這些方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低、能耗大等缺點(diǎn)[11?12]。超聲輔助提取法因其具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉且能有效提高提取效率、縮短提取時(shí)間、降低能耗等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)的提取純化[13?14]。近期針對(duì)冬凌草甲素的研究集中于冬凌草甲素的藥理作用,對(duì)其高效提取方法鮮有研究[15?16]。

    本研究立足于冬凌草,采用超聲波法輔助提取冬凌草甲素,以克服傳統(tǒng)浸提法成本高、分離時(shí)間長(zhǎng)、能耗大等缺點(diǎn)。通過單因素確定工藝參數(shù)范圍,經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝研究冬凌草甲素高效綠色提取體系,并經(jīng)過對(duì)HepG2細(xì)胞存活率和凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的研究,初步研究冬凌草甲素的體外抗腫瘤活性,以期為天然抗癌物質(zhì)的研發(fā)提取提供理論技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    冬凌草 由三門峽廣宇生物制藥有限公司提供,由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材系高致明教授鑒定為正品,自然晾干,干燥密封保存;人肝癌細(xì)胞系HepG2 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(Chian Center for Type Cuture Collection, CCTCC);冬凌草甲素對(duì)照品(批號(hào) E1526003,純度≥98%) 上海阿拉丁生物科技股份有限公司;Cell counting Kit-8 (CCK-8)試劑盒(批號(hào)202001003)、總蛋白提取試劑盒(批號(hào)201908002)、Caspase-3(批號(hào)202005007)和Caspase-9檢測(cè)試劑盒(批號(hào)202002010) 北京索萊寶科技有限公司;多克隆抗體Caspase-3(批號(hào)2019012006)、β-actin(批號(hào)201806015) 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;甲醇 色譜純,天京永大化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    KQ-250DE超聲波清洗機(jī) 昆山超聲波儀器有限公司;GL21M離心機(jī) 凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 南北儀器有限公司;TY-100L中藥粉碎機(jī) 濟(jì)南天宇專用設(shè)備有限公司;Agilent 1290高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;X-mark酶標(biāo)儀 美國BioRad公司;二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Shellab公司;HX-ZD-100A振蕩儀 華熙昕瑞分析儀器有限公司;DYCZ-24DN電泳儀 北京六一儀器廠。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 冬凌草甲素的提取 將冬凌草粉碎,過40目篩,根據(jù)冬凌草甲素的性質(zhì),依照“相似相容”原理,選擇有機(jī)溶劑乙醇作為萃取劑,結(jié)合以往文獻(xiàn)采用95%的乙醇作為冬凌草甲素的萃取劑[17?18]。稱取1.0 g冬凌草粉末與95%乙醇混合后在超聲作用下提取冬凌草甲素。在一定的超聲條件下處理一定的時(shí)間,離心,收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,揮發(fā)多余乙醇,吸取1 mL用甲醇定容至100 mL,用0.22 μm濾膜過濾,高效液相測(cè)定峰面積。

    1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

    1.2.2.1 料液比對(duì)冬凌草甲素得率的影響 按1.2.1的實(shí)驗(yàn)步驟,設(shè)置不同的料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL)在超聲功率為200 W,超聲時(shí)間1 h條件下萃取冬凌草甲素,每次試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值計(jì)算冬凌草甲素得率。

    1.2.2.2 超聲功率對(duì)冬凌草甲素得率的影響 按1.2.1的實(shí)驗(yàn)步驟,設(shè)置不同的超聲功率(80、120、160、200、240 W),在料液比為1:20 g/mL,超聲時(shí)間1 h條件下萃取冬凌草甲素,每次試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值計(jì)算冬凌草甲素得率。

    1.2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)冬凌草甲素得率的影響 按1.2.1的實(shí)驗(yàn)步驟,設(shè)置不同的超聲時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h),在料液比為1:20 g/mL,超聲功率200 W條件下萃取冬凌草甲素,每次試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值計(jì)算冬凌草甲素得率。

    1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定參數(shù)范圍,以冬凌草甲素得率為指標(biāo),利用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化料液比、超聲功率及超聲時(shí)間的工藝參數(shù),評(píng)價(jià)影響冬凌草甲素得率因素的主效應(yīng)、相互效應(yīng)及因素的二次效應(yīng)關(guān)系,試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

    表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)變量水平Table 1 The levels of variables for the construction of Box-Behnken design (BBD)

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用完全二次多項(xiàng)式方程進(jìn)行多元線性回歸擬合,計(jì)算冬凌草甲素得率和各實(shí)驗(yàn)因素之間的函數(shù)關(guān)系。

    式中,Y為預(yù)測(cè)的響應(yīng)值,即冬凌草甲素得率;A0是常數(shù),Ai是線性系數(shù),Aii是二次方系數(shù),Aij是交互作用回歸系數(shù);Xi是自變量。

    1.2.4 冬凌草甲素含量測(cè)定

    1.2.4.1 色譜條件 Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流動(dòng)相:甲醇-水(50:50),流速:1.0 mL/min,柱溫:35 ℃,進(jìn)樣體積:10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm,冬凌草甲素保留時(shí)間14.76 min。

    1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)品,95%乙醇溶解,分別配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.4.1的色譜條件,經(jīng)高效液相測(cè)定冬凌草甲素的色譜峰面積。標(biāo)準(zhǔn)曲線的X軸與Y軸分別為對(duì)照品質(zhì)量濃度及峰面積,得回歸式:Y=23.153X?31.569。其中,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996,表明該曲線在0.1~0.8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,適用于冬凌草提取液中冬凌草甲素質(zhì)量濃度的計(jì)算。

    1.2.4.3 冬凌草甲素得率測(cè)定 將1.2.2和1.2.3中制備的冬凌草甲素提取液體,經(jīng)高效液相測(cè)定峰面積,并按如下公式計(jì)算冬凌草甲素的得率。

    式中,Y表示冬凌草甲素得率(%);C為冬凌草甲素濃度(mg/mL);N為測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù);V為提取液母液體積(mL);W為冬凌草原料質(zhì)量(g)。

    1.2.5 冬凌草甲素抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

    1.2.5.1 冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞存活率的影響 將長(zhǎng)勢(shì)良好的人肝癌細(xì)胞系HepG2以104個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于96孔板,適應(yīng)生長(zhǎng)12 h后,棄去原培養(yǎng)基,加入無血清培養(yǎng)基0.9 mL,分別加入40、80、120、160、200 μmol/L冬凌草甲素溶液0.1 mL,配成終濃度為4、8、12、16、20 μmol/L冬凌草甲素溶液(冬凌草甲素分子量為364.44,HPLC測(cè)定的提取液中冬凌草甲素量0.412 mg/mL,將提取液稀釋56.5倍配置20 μmol/L冬凌草甲素母液),作用24 h后,將10 μL CCK-8檢測(cè)液逐一加入各孔,1 h后酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)其OD值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

    式中,S表示細(xì)胞存活率(%);As為試驗(yàn)孔的吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8和藥物溶液);Ac為對(duì)照孔的吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基和CCK-8溶液);Ab為空白孔的吸光度(含培養(yǎng)基和CCK-8溶液)。

    1.2.5.2 冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞胞內(nèi)凋亡蛋白的影響 5×105/mL HepG2細(xì)胞 接種于6孔板,貼壁培養(yǎng)12 h,棄去原培養(yǎng)基,加入無血清培養(yǎng)基2.7 mL,分別加入40、80、120、160、200 μmol/L冬凌草甲素溶液0.3 mL,配成終濃度為4、8、12、16、20 μmol/L冬凌草甲素溶液。37 °C含5% CO2濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞刮板刮下,離心收集細(xì)胞,使用細(xì)胞裂解液在冰浴條件振蕩裂解,細(xì)胞裂解液使用總蛋白提取試劑盒測(cè)定蛋白含量,Capase-3和Capase-9活性嚴(yán)格按照Capase-3和Capase-9活性測(cè)定試劑盒執(zhí)行。

    Western blotting檢測(cè)Capase-3凋亡蛋白表達(dá)水平,取長(zhǎng)勢(shì)良好的HepG2細(xì)胞,D-hank`s清洗后加入細(xì)胞裂解液,依總蛋白提取試劑盒操作指導(dǎo)提取總蛋白。蛋白變性后取等量各組總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。待電泳前端溴酚藍(lán)至分離膠下緣時(shí)停止電泳,進(jìn)行1 h轉(zhuǎn)膜。將完成轉(zhuǎn)膜的PVDF膜以含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫下封閉2 h。將封閉好的PVDF膜與一抗(Caspase-3,1:1000;βactin,1:1000)于4 ℃孵育過夜。次日取出后用TBST洗膜3次,加入二抗(1:1000)室溫下置于搖床平緩晃動(dòng),孵育1 h。結(jié)束后以TBST洗膜3次后加入顯色液覆蓋整張膜,進(jìn)行顯色反應(yīng)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,運(yùn)用Origin 9.0繪制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相關(guān)圖片,采用SPSS 18.0和Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 料液比對(duì)冬凌草甲素得率的影響 如圖1所示,在1:10~1:20 g/mL的料液比范圍內(nèi),冬凌草甲素得率逐漸升高,在料液比為1:20 g/mL時(shí)冬凌草甲素得率達(dá)到最高,之后得率不再隨料液比的增加而增加。此現(xiàn)象可能是由于溶質(zhì)和萃取劑的接觸面積隨著液料比的增加而擴(kuò)大,更有利于冬凌草甲素的萃取[19?20];但料液比超過1:20 g/mL后,溶質(zhì)已經(jīng)達(dá)到了溶解平衡,所以得率不再增加,考慮到提取成本,液料比選擇1:20 g/mL作為冬凌草甲素提取的最佳提取參數(shù)。

    圖1 料液比對(duì)冬凌草甲素得率的影響Fig.1 Effect of liquid to solid ratio on yield of oridonin

    2.1.2 超聲功率對(duì)冬凌草甲素得率的影響 如圖2所示。超聲功率在80~200 W范圍內(nèi),冬凌草甲素得率隨超聲功率的升高而增加,此后繼續(xù)增加超聲功率,冬凌草甲素得率增高不明顯,考慮到提取成本,超聲功率為200 W作為冬凌草甲素提取的最佳提取參數(shù)。

    圖2 超聲功率對(duì)冬凌草甲素得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of oridonin

    2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)冬凌草甲素得率的影響 超聲時(shí)間對(duì)冬凌草甲素得率的影響見圖3,提取時(shí)間在1.0 h以內(nèi),冬凌草甲素得率隨提取時(shí)間的增長(zhǎng)急速增加;在提取時(shí)間1.0~1.5 h范圍內(nèi),冬凌草甲素得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢增加;提取時(shí)間超過1.5 h以后增加趨勢(shì)不明顯。其原因可能是冬凌草甲素隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),部分冬凌草甲素氧化分解[21],所以在時(shí)間超過1.5 h后冬凌草甲素得率會(huì)略有所下降。因此,選擇1.5 h為冬凌草甲素最佳的超聲時(shí)間。

    圖3 超聲時(shí)間對(duì)冬凌草甲素得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of oridonin

    2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 表2顯示了Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)17個(gè)3因素和3水平的結(jié)果。使用SAS數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,冬凌草甲素得率和試驗(yàn)變量采用以下二次多項(xiàng)式方程得出:

    表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

    式中,Y為冬凌草甲素得率,A為料液比,B為超聲時(shí)間,C為超聲功率。

    經(jīng)Design-Expert 8.0軟件ANOVA法分析響應(yīng)表面二次多項(xiàng)式模型的顯著性。實(shí)驗(yàn)方差結(jié)果分析如表3所示,回歸模型的擬合極顯著(P<0.01),實(shí)驗(yàn)復(fù)相關(guān)系數(shù)(R2)是0.9329和校正測(cè)定系數(shù)(R2adj)是0.8467,失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),以上結(jié)果均表明模型擬合程度高可靠性強(qiáng),觀察值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性良好,在實(shí)驗(yàn)變量范圍內(nèi)具有很高的顯著性,可用該模型來分析和預(yù)測(cè)冬凌草甲素的提取條件,此外,低變異系數(shù)(CV)為4.23%表示模型的精度高。以上結(jié)果證實(shí)選用試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性,可以用此回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。表3結(jié)果顯示,所選各因素水平范圍內(nèi),一次項(xiàng)A達(dá)到極顯著水平(P<0.01),C達(dá)到了顯著水平(P<0.05),表明料液比對(duì)冬凌草甲素得率的影響最大,要得到良好的響應(yīng)值必須嚴(yán)格控制好料液比。各項(xiàng)因素對(duì)冬凌草甲素的影響大小順序是:料液比(A)>超聲功率(C)>超聲時(shí)間(B)。

    表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of regression model

    根據(jù)多元回歸方程做出不同處理因素對(duì)冬凌草甲素得率影響相應(yīng)三維響應(yīng)面和二維等高線如圖4所示。三維響應(yīng)面闡釋了當(dāng)其他因素保持在零水平不變時(shí),因變量之間的關(guān)系和兩個(gè)測(cè)試變量之間的相互作用[22?23],二維等值線圖的形狀反映了變量之間的交互效應(yīng),圓圖表示試驗(yàn)參數(shù)相互作用影響不顯著,而橢圓輪廓圖表示試驗(yàn)參數(shù)相互作用影響顯著[24?25]。圖4B呈現(xiàn)出料液比和超聲功率間顯著的交互作用,由此可知,冬凌草甲素得率與料液比、超聲功率密切相關(guān);圖4C顯示,等高線在超聲功率軸向分布密集且呈陡然變化趨勢(shì),但其在超聲時(shí)間軸向分布稀疏且變化趨勢(shì)較為緩和,該結(jié)果提示,冬凌草甲素得率受超聲功率的影響大于超聲時(shí)間的影響。以上結(jié)果均可支持方差分析結(jié)果。

    圖4 不同處理因素交互作用對(duì)冬凌草甲素得率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour plots of the interactive effects on the yield of oridonin

    2.2.2 最優(yōu)工藝條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0軟件分析優(yōu)化冬凌草甲素提取的最佳條件:料液比為1:17.73 g/mL,超聲時(shí)間為1.51 h,超聲功率為189.06 W。最佳條件下,冬凌草甲素預(yù)測(cè)最高得率為4.154%。為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性,兼顧實(shí)際操作的便利性,將上述最佳提取條件修正為,料液比為1:18 g/mL,超聲時(shí)間為1.5 h,超聲功率為190 W進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。3次平行實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)得冬凌草甲素得率為(4.122%±0.102%),證實(shí)了預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的良好相關(guān)性,表明該模型適用于冬凌草甲素的提取。

    2.3 冬凌草甲素抗腫瘤作用

    2.3.1 冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞存活率的影響 冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞存活率的影響如圖5所示。冬凌草甲素處理組HepG2細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組明顯下降,其中,當(dāng)冬凌草甲素濃度超過8 μmol/L之后,對(duì)肝癌細(xì)胞的存活率抑制與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),在4~20 μmol/L的范圍內(nèi)具有劑量依賴性,當(dāng)濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí),HepG2細(xì)胞存活率低至60.72%。

    圖5 冬凌草甲素對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effect of oridonin on HepG2 cells viability

    2.3.2 凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞胞內(nèi)凋亡蛋白的影響冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 Caspase-3和Caspase-9活性的影響如圖6所示。與空白對(duì)照組相比,冬凌草甲素組細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性明顯上升,說明冬凌草甲素通過激活Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá),啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。其中,冬凌草甲素濃度達(dá)到8 μmol/L以后肝癌細(xì)胞HepG2的Caspase-3和Caspase-9活性顯著上升(P<0.05),且表現(xiàn)出良好的劑量依賴性。

    圖6 冬凌草甲素對(duì)HepG2細(xì)胞Caspase-3(A)和Caspase-9(B)活性的影響Fig.6 Effect of oridonin on Caspase-3(A) and Caspase-9(B) activity

    應(yīng)用Western-Blot技術(shù)分析檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(如圖7)?;叶葤呙瓒糠治鼋Y(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理后Caspase-3蛋白表達(dá)的變化。不同濃度冬凌草甲素處理24 h后,與對(duì)照組相比,加入冬凌草甲素處理后,Caspase-3的表達(dá)量隨冬凌草甲素濃度的增加顯著增加,呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性;當(dāng)冬凌草甲素濃度大于8 μmol/L后,Caspase-3的表達(dá)較對(duì)照組極顯著升高(P<0.01),說明冬凌草甲素作用24 h在一定濃度時(shí)可以激活Caspase-3的表達(dá)。

    圖7 冬凌草甲素對(duì)HepG2細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of oridonin on Caspase-3 expression in HepG2 cells

    上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,冬凌草甲素作用于HepG2細(xì)胞后,通過增加Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá),啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序,降低細(xì)胞存活率,暗示此時(shí)HepG2細(xì)胞因細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)引起細(xì)胞數(shù)目的下降,說明冬凌草甲素能通過促進(jìn)線粒體途徑介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞存活率,從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞的目的。

    3 討論與結(jié)論

    冬凌草甲素是中草藥植物冬凌草的主要有效成分,現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí),冬凌草甲素因具有多種生物活性而受到廣泛關(guān)注。冬凌草甲素常用的提取方法研究集中于熱回流提取法、滲漉法、索氏提取法等,由于冬凌草甲素為熱敏成分,這些提取方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低,降低生物活性等缺點(diǎn)。所以積極尋找更加適合提取冬凌草甲素的方法,可以更好地促進(jìn)我國冬凌草植物資源的高值化利用。超聲輔助提取法因其具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉并且能有效提高提取效率、縮短提取時(shí)間、降低能耗等優(yōu)點(diǎn)[26],可克服傳統(tǒng)浸提法分離時(shí)間長(zhǎng)、易失活、能耗大等缺點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的提取。本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取冬凌草甲素的工藝參數(shù),料液比為1:18 g/mL,超聲時(shí)間為1.5 h,超聲功率為190 W的條件下,冬凌草甲素得率達(dá)到4.122%。

    冬凌草甲素的抗腫瘤活性是通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、調(diào)整細(xì)胞周期、改變生物膜的通透性等方面實(shí)現(xiàn)的?,F(xiàn)已證實(shí)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中起著十分重要的作用[27]。其中,Capase-3是觸發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的核心蛋白酶,是所有細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路蛋白,其過量表達(dá)就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28?29]。許多的細(xì)胞凋亡通路都是經(jīng)過線粒體完成的,所以線粒體也稱之為“自殺武器儲(chǔ)存庫”[30?31]。大量文獻(xiàn)報(bào)道在線粒體凋亡途徑中,首先破壞了線粒體的氧化呼吸鏈,繼而引起電子解偶聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生大量的自由基,最終觸發(fā)ATP損失和細(xì)胞色素C釋放,最終激活凋亡蛋白Caspase-9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[30,32?34]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),冬凌草甲素可以大幅降低HepG2細(xì)胞的存活率,增加Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá),通過促進(jìn)線粒體途徑介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞數(shù)目的目的。

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