基于TGF-β1/Foxp3/RORγt通路探討清竅膠囊對分泌性中耳炎大鼠的作用機制＊

鐘倫坤，胡文健，周興瑋，何 嫻，朱佳麗，陳 龍，田 柳，邵建華，孫永東

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院 瀘州 646699）

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM）又稱粘液性中耳炎、滲出性中耳炎、卡他性中耳炎等，多發(fā)于2-7 歲兒童，是一種頑固性耳科疾病，病程長，是兒童聽力受損的最常見原因，主要以中耳積液、聽力下降、反復發(fā)作為表現(xiàn)特征，治療不徹底或遷延不愈可引發(fā)多種嚴重的并發(fā)癥，嚴重影響患兒的言語、學習和行為問題[1]。目前，SOM 的發(fā)病機制尚未完全明確，其病因機制仍然存在爭議，但目前認為中耳的液-氣平衡被打破繼而導致中耳積液是分泌性中耳炎疾病發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，中耳黏膜的免疫反應類似于鼻粘膜，其通過抗原抗體結(jié)合，免疫因子的釋放及下游信號一系列的瀑布級聯(lián)網(wǎng)絡效應，放大免疫反應，最終表現(xiàn)為中耳黏膜水腫、滲出，造成中耳積液[2]。但對于如何快速有效的治療SOM 尚無統(tǒng)一的治療方案，目前臨床主要以抗感染、抗變態(tài)反應及手術(shù)治療等為主要治療方式[3]。因此，尋找療效確切的藥物治療SOM尤為重要。

清竅膠囊是我科獨創(chuàng)治療SOM 的經(jīng)驗協(xié)定方藥，清竅膠囊主要成分包括玄參、生地、丹參、川牛膝等，具有清熱、活血化瘀及抑菌抗菌的作用，主要用于治療肝腎不足、脾氣虛弱型的SOM，2008 年清竅膠囊批準生產(chǎn)為院內(nèi)制劑，在臨床上應用于SOM 及咽喉炎的治療，效果顯著。SOM 主要病理因素鼓膜充血、光錐消失、鼓室混濁、鼓室積液征與SOM 的中醫(yī)病機咽鼓管閉塞不通、鼓室腔積液而發(fā)病、耳竅失聰、濕困耳竅相契合。現(xiàn)代藥理學研究表明清竅膠囊能改善機體免疫功能和中耳粘膜的排泄清理功能，可以達到標本兼治，減緩中耳分泌液的產(chǎn)生，最終吸收消失，使閉塞的咽鼓管逐漸通暢，同時改善耳蝸微循環(huán)[4]。但其治療SOM的具體機制及作用機理還有待進一步研究。

T細胞功能紊亂在SOM發(fā)病中起重要作用。最近的研究表明，調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Treg）和輔助性T 細胞（T helper cells-17，Th17）參與了SOM 的發(fā)病[5]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）是幼稚T 細胞發(fā)育為Treg 細胞或Th17細胞所必需的，而IL-6 將使幼稚T 細胞極化為Th17 細胞[6]。叉頭盒P3（Forkhead Box P3，F(xiàn)OXP3）是Treg 細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（Retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt）是Th17 細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[7]。針對SOM 中Th17/Treg細胞失衡的治療方法可能是一個突破。因此，本研究基于TGF-β1/Foxp3/RORγt 通路探討清竅膠囊對SOM大鼠的作用機制，為SOM 的治療提供依據(jù)，同時也為清竅膠囊的機制研究及今后基于網(wǎng)絡藥理學分析，系統(tǒng)綜合地觀察清竅膠囊對SOM 的干預與影響奠定基礎，為清竅膠囊未來的藥物開發(fā)及應用研究打下更加扎實的理論基礎。本文研究流程圖如圖1。

圖1 實驗流程圖

1 材料

1.1 實驗動物

雌性SD 大鼠36 只，體質(zhì)量240±10 g，購于成都達碩實驗動物有限公司，使用許可證號：SYXK（川）2019-189，生產(chǎn)許可證號：SCYK（川）2020-030。

1.2 藥物

清竅膠囊為醫(yī)院內(nèi)制劑，批準文號：川藥制字Z20080310，配方為：玄參9 g、生地9 g、丹參12 g、川牛膝6 g、僵蠶4 g、當歸9 g、薏苡仁18 g、豆蔻6 g、甘草9 g。強的松購自浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33021207。

1.3 實驗儀器和試劑

FACSCalibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；sigma 3K15 離心機（德國Sigma 公司產(chǎn)品）；BMJ-A 型包埋機（常州郊區(qū)中威電子儀器廠）；SpectraMAX Plus384 酶標儀（美谷分子儀器有限公司）；PIKORed 96實時熒光定量（RT-PCR）儀（美國ThermoFisher）；化學發(fā)光凝膠成像儀5200（上海天能科技有限公司）。

卵清蛋白（OVA）購自Sigma（美國）；IL-4（貨號：ZC-36402）、TGF-β（貨號：ZC-37644）、IL-6（貨號：ZC-36404）、IFN-γ（貨號：ZC-36294）、IL-10（貨號：ZC-36379）、IL-17（貨號：ZC-36386）ELISA 試劑盒（上海茁彩）；TRIzol 試劑RNA 提取試劑盒（批號：14105，Invitrogen 公司）；PCR 擴增試劑盒（批號：AK9906，TaKaRa）；Foxp3（批號：MD4713）和RORγT（批號：MD6907）相關(guān)抗體（Medical Discovery Leader（MDL）公司）。

2 實驗方法

2.1 分泌性中耳炎大鼠模型構(gòu)建

大鼠飼養(yǎng)于恒溫（20-25）℃、恒濕（50%±5%），自然采光，自由飲水條件下。隨機選取30只進行分泌性中耳炎造模[8]：將1.2 mg卵清蛋白溶于0.6 mL PBS緩沖液配置成溶液，同時使用5.14 mg 的氫氧化鋁作為免疫佐劑，腹腔注射，每周1 次，共2 周，此過程為全身致敏階段，2周后，用20%烏拉坦以5 mL·kg-1的劑量腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，將15 μL 配置的OVA/PBS 混合液經(jīng)鼓膜前下方注入鼓室，24h 后再次麻醉大鼠，觀察鼓膜狀態(tài)，注射第2次，此為耳內(nèi)激發(fā)階段。24 h 后用耳內(nèi)鏡觀察和記錄鼓膜形態(tài)和中耳腔積液情況，正常大鼠鼓膜無充血，光滑透亮，錘骨柄和光錐標志清晰，鼓室無積液。建模后可見大鼠鼓膜充血，光錐消失，鼓室混濁，鼓室積液征，建?；境晒?。

2.2 試驗分組及給藥方法

30 只分泌性中耳炎大鼠造模成功后，隨機分為模型組（SOM）、強的松治療組（PDN，0.003 g/100 mL）、清竅膠囊低劑量治療組（QQJN-L，0.36 g/100 mL）、清竅膠囊中劑量治療組（QQJN-M，0.54 g/100 mL）、清竅膠囊高劑量治療組（QQJN-H，0.72 g/100 mL），每組6 只，并設置健康空白對照組（Control，剩余未造模大鼠6只）。灌胃藥物容積均為0.2 mL/10 g 體質(zhì)量，清竅膠囊高劑量溶液配成濃度為0.72 g/100 mL，清竅膠囊中劑量溶液配成濃度為0.54 g/100 mL，清竅膠囊低劑量溶液濃度為0.36 g/100 mL，強的松配成0.003 g/100 mL溶液。模型組與空白對照組灌服相同容積的蒸餾水，1次/天給藥，連續(xù)給藥14天。

2.3 樣本采集

血樣采集：給藥結(jié)束后，抽取所有大鼠腹主動脈血液，3 000 r·min-1低溫離心15 min，分離血清，-80℃冰箱保存。組織樣本采集：脫頸處死大鼠，取出雙側(cè)聽泡，10%甲醛溶液固定；并立即分離出大鼠脾臟和胸腺，剪少量脾臟和胸腺組織，加入適量淋巴細胞分離液，充分碾磨胸腺組織至無塊狀物，過濾，加入1640培養(yǎng)基，15 000 r·min-1，20℃離心30 min，吸取淋巴細胞層，用于后續(xù)流式細胞檢測。另取部分脾臟和胸腺組織，放入DEPC 處理過的1.5 mL EP 管中，凍存于-80 ℃冰箱，留待做WB及qRT-PCR檢測。

2.4 檢測指標及方法

2.4.1 HE染色觀察組織病理變化

取固定的聽泡，脫鈣，脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟15 min（5 min/次），梯度乙醇水化，1%磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察中耳病理變化。

2.4.2 ELISA檢測血清因子

將離心采集的血清，按照ELISA 試劑盒說明操作檢測血清IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17 的濃度。

2.4.3 流式細胞檢測脾臟和胸腺Th17/Treg細胞

取分離好的脾臟和胸腺淋巴細胞，稀釋至1×108/mL，取100 μL 加入流式測定管中，分別加入5 μL FITC 標記的CD4 McAb、5 μL APC 標記的IL-17 McAb或5 μL FITC 標 記的CD4 McAb、5 μL APC 標記 的CD25 McAb 后 混 勻，避 光孵 育約20 min，F(xiàn)lowCytometry Staining Buffer 1mL 洗滌后，1400r·min-1離心5 min，棄上清液，加PBS洗2遍，棄上清液，加入PBS緩沖 液，調(diào) 整 細 胞 濃 度 至1×106個 細 胞/mL，于FACSCalibur 流式細胞儀檢測，CD4+IL-17+為Th17 含量，CD4+CD25+Treg細胞為Treg含量。

2.4.4 qRT-PCR 檢測脾臟和胸腺組織Foxp3、IL-17、RORγT mRNA表達

根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol?試劑從脾臟和胸腺組織樣本中提取總RNA，電泳確定RNA的完整性后，互補DNA 用RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green試劑進行RT-PCR，GAPDH 作為內(nèi)參。qPCR 引物序列為：Foxp3：上游5’-CACCTATGCCACCCTTATCCG-3’，下游5’-CATGCGAGTAAACCAATGGTAGA-3’，IL-17：上游5’-TGGAATCTCCACCGCAATG A-3’，下游5’-TGTGGTAGTCCACGTTCCCA-3’，RORγT：上游5’-CCGCTGAGAGGGCTTC A-3’，下 游 5’-TGCAGGAGTAGGCCACATTACA-3’，GAPDH：上 游5’-AGGTCGGTGAACG GATTTG-3’，下 游 5’-GGGGTCGTTGATG GCAACA-3’。PCR 循環(huán)條件為95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s；40 個循環(huán)。記錄CT值，并采用2-ΔΔCT法分析mRNA相對表達水平。

2.4.5 WB 檢測脾臟和胸腺組織Foxp3、RORγT 蛋白表達

采用RIPA 裂解液從脾臟和胸腺組織中提取總蛋白，應用BCA 檢測進行蛋白質(zhì)定量，使用50 μg蛋白在10%的SDS-PAGE 進行分離，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封閉結(jié)束后按照實驗目的結(jié)合一抗Foxp3（1:500）、RORγT（1:500）和β-catin（1:2000）4℃孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二級抗體孵育（1：3000）室溫孵育1h，TBST 清洗，ECL 暗室顯色。顯色后的蛋白使用Bio-Rad 全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus 分析光密度，以β-actin 為內(nèi)參，陰性對照組目標蛋白質(zhì)相對含量為1，計算各組蛋白質(zhì)的相對表達量，實驗重復3次。

2.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（±s），兩組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠中耳病理改變

對照組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，單層黏膜上皮細胞排列整齊，上皮下為薄層固有層，內(nèi)含豐富的血管及纖維細胞等，未見明顯炎性細胞浸潤或纖維組織增生。模型組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，黏膜上皮細胞嚴重壞死、缺失，上皮細胞基本不可見；黏膜層明顯增厚，大量炎性細胞浸潤，以核呈桿狀的中性粒細胞和核呈圓形深染的淋巴細胞為主，較多纖維組織增生，見核呈長梭形的纖維細胞，部分細胞壞死，見胞核崩解、碎裂，胞質(zhì)溶解。強的松治療組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，單層黏膜上皮細胞排列整齊；黏膜層明顯增厚，少量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，較多纖維組織增生，見較多核呈長橢圓形的成纖維細胞和少量纖維細胞，固有層略微水腫，見細胞之間距離顯著增寬。清竅膠囊低劑量治療組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，單層黏膜上皮細胞排列整齊；黏膜層略微增厚，少量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，少量纖維組織增生。清竅膠囊中劑量治療組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，少量炎性細胞浸潤以及極少量纖維組織增生。清竅膠囊高劑量治療組：中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，單層黏膜上皮細胞排列整齊；黏膜層極少量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，以及極少量纖維組織增生。提示清竅膠囊改善SOM 大鼠中耳組織病理形態(tài)變化（圖2）。

圖2 各組大鼠中耳病理改變（HE，400×）

3.2 各組大鼠血清中IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17水平

ELISA檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-17 水平明顯升高，IL-10、IL-4 水平明顯降低（P＜0.01）；經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊高劑量組可明顯降低模型大鼠TGF-β、IL-6、IFNγ、IL-17 水平，明顯升高IL-10、IL-4 水平（P＜0.05），提示清竅膠囊抑制促炎性細胞因子的分泌（表1）。

表1 各組大鼠血清中IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17水平（±s，n=6）

表1 各組大鼠血清中IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17水平（±s，n=6）

注：模型組與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；治療組與模型組比較，#P＜0.05。

組別Group對照組Control模型組SOM強的松組PDN QQJN低劑量QQJN-L QQJN中劑量QQJN-M QQJN高劑量QQJN-H IL-4（pg·mL-1）22.34±0.32 20.39±0.26*21.98±0.45#21.19±1.11 21.85±1.06 22.08±1.13#TGF-β（pg·mL-1）20.79±1.36 25.49±1.61**23.48±0.29 23.87±0.75 22.91±1.02 22.38±2.06#IL-6（pg·mL-1）10.94±1.24 13.80±0.80**11.85±0.72#12.43±0.69 12.34±0.64 12.22±0.97#IFN-γ（pg·mL-1）157.69±10.57 180.84±6.00**163.29±7.93#167.36±3.91 165.42±3.63 164.55±9.88#IL-17（pg·mL-1）4.47±0.43 5.59±0.45**4.91±0.20#5.05±0.18 4.86±0.16 4.69±0.51#IL-10（pg·mL-1）7.01±0.27 5.61±0.44**6.64±0.64#6.36±0.57 6.46±0.56 6.62±0.36#

3.3 各組大鼠胸腺、脾臟Th17、Treg細胞含量

流式細胞檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟Th17、Treg 細胞百分比明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊高劑量組可明顯降低模型大鼠胸腺、脾臟Treg 細胞（P＜0.05），治療組胸腺、脾臟中Th17細胞含量較模型組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示清竅膠囊可能對Th17/Treg細胞失衡起到積極作用（圖3-圖4）。

圖3 各組大鼠流式細胞檢測圖及結(jié)果比較

圖4 各組大鼠流式細胞檢測圖及結(jié)果比較

3.4 各組大鼠胸腺、脾臟Foxp3、IL-17、RORγT mRNA表達

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟組織中IL-17、RORγT mRNA 表達水平明顯升高，F(xiàn)oxp3 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01），經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊高劑量組可明顯降低模型大鼠胸腺、脾臟組織中IL-17、RORγT mRNA表達水平，明顯升高脾臟組織中Foxp3 mRNA表達（P＜0.05），對胸腺組織中Foxp3 mRNA 表達水平無統(tǒng)計意義（P＞0.05），提示清竅膠囊治療后Th17/Treg細胞失衡有所抑制（表2）。

表2 各組大鼠胸腺和脾臟Foxp3、IL-17、RORγT mRNA表達（±s，n=6）

表2 各組大鼠胸腺和脾臟Foxp3、IL-17、RORγT mRNA表達（±s，n=6）

注：模型組與空白組比較，**P＜0.01；治療組與模型組比較，#P＜0.05。

組別Group對照組Control模型組SOM強的松組PDN QQJN低劑量QQJN-L QQJN中劑量QQJN-M QQJN高劑量QQJN-H胸腺Thymus IL-17 1.01±0.17 1.63±0.13**1.33±0.37 1.59±0.12 1.31±0.25 1.22±0.16#RORγT 1.01±0.17 1.99±0.31**1.43±0.14#1.87±0.16 1.52±0.12 1.48±0.34#Foxp3 1.00±0.08 0.63±0.19**0.76±0.12 0.58±0.17 0.72±0.20 0.74±0.06脾臟spleen IL-17 1.00±0.07 2.35±0.38**1.48±0.14##2.13±0.51 1.63±0.31 1.56±0.30#RORγT 1.01±0.14 1.89±0.16**1.56±0.05##1.82±0.07 1.79±0.15 1.77±0.04#Foxp3 1.01±0.19 0.52±0.09**0.78±0.04#0.53±0.13 0.68±0.13 0.70±0.12#

3.5 各組大鼠胸腺、脾臟Foxp3、RORγT蛋白表達

與空白對照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟組織中RORγT 蛋白水平明顯升高，F(xiàn)oxp3 蛋白水平明顯降低（P＜0.01），經(jīng)不同處理治療后，強的松組、清竅膠囊高劑量組可明顯降低模型大鼠胸腺、脾臟組織中RORγT蛋白水平，明顯升高Foxp3蛋白水平（P＜0.05），提示清竅膠囊可調(diào)節(jié)TGF-β/Foxp3/RORγt 信號通路來調(diào)節(jié)Treg和Th17細胞介導的中耳炎（圖5）。

圖5 各組大鼠胸腺和脾臟Foxp3、RORγT蛋白表達

4 討論

針對SOM 的治療目前尚無統(tǒng)一有效的藥物，已有證據(jù)發(fā)現(xiàn)中藥具有副作用小，藥物作用靶點多等優(yōu)勢，對于SOM 治療中醫(yī)界目前也正在尋找療效確切并且對全身及局部均有效的中成藥來治療[9-10]。前期研究證實清竅膠囊可通過降低SOM 動物模型血清粘附分子表達水平來減輕大鼠聽泡粘膜炎癥反應，抑制大鼠聽泡粘膜細胞增生，從而治療分泌性中耳炎[11]。此外，清竅膠囊可抑制SOM 小鼠模型HIF-VEGF 信號通路因子缺氧誘導因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（Vascular endothelial cell growth factor，VEGF）濃 度[4]。由 此 看出，清竅膠囊是通過多個靶點起作用，但由于更進一步機制研究尚缺乏，故本研究基于TGF-β1/Foxp3/RORγt 通路探討清竅膠囊對分泌性中耳炎大鼠的作用機制，為SOM 的治療提供依據(jù)。首先從病理角度觀察發(fā)現(xiàn)分泌性中耳炎大鼠中耳內(nèi)有連續(xù)黏膜覆蓋，黏膜層明顯增厚，有大量炎性細胞浸潤，清竅膠囊高劑量治療后大鼠中耳內(nèi)單層黏膜上皮細胞排列較整齊，黏膜層極少量炎性細胞浸潤。提示清竅膠囊改善SOM病理變化，對SOM具有治療作用。

目前，SOM 的發(fā)病機制尚不清晰，然而研究顯示免疫因素在SOM 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但免疫反應的調(diào)控機制有待深入研究[12]。在自身抗原的刺激下，Treg 細胞和其他T 細胞亞群可以在胸腺中發(fā)育。胸腺Treg 細胞在維持免疫耐受中的關(guān)鍵作用已通過觀察3 日齡新生小鼠胸腺切除誘導T 細胞介導的自身免疫得到證實[13]。Treg 抑制功能的維持需要轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 的表達，其功能本身受多種翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。Treg細胞分泌抑制性細胞因子（TGF-β、IL-10）及通過CD39 胞核水解ATP 抑制免疫反應，而Foxp3 可在TGF-β 存在的情況下在體外誘導Treg[14]。輔助性T 細胞（Th17）由視黃醇相關(guān)孤兒受體γt（RORγT）誘導，在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15]。全基因組關(guān)聯(lián)研究強調(diào)了Th17 細胞在免疫性疾病中的中心作用，這些研究將Th17細胞中優(yōu)先表達的基因與多種疾病聯(lián)系起來，包括牛皮癬、炎癥性腸病和強直性脊柱炎[16-17]。此外，Th17 細胞可分泌IL-17，Treg 細胞是CD4+T細胞的一個亞型，具有維持免疫穩(wěn)態(tài)、降低炎癥強度和誘導免疫耐受的作用，細胞間相互作用和分泌IL-10 是Treg 細胞調(diào)節(jié)免疫的主要途徑[18]。與Treg細胞相反，Th17 細胞被指出具有促炎功能，Th17 細胞分泌過多的IL-17 會招募中性粒細胞和單核細胞，增加腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β 的產(chǎn)生，進而加重疾病[19]。RORγT 是治療Th17細胞介導的疾病的一個有吸引力的藥理靶點，盡管這些分子抑制了某些在Th17 細胞中優(yōu)先表達的基因的轉(zhuǎn)錄，但RORγT抑制劑的直接轉(zhuǎn)錄效應尚未被分析，也沒有全面研究這些分子對RORgt 靶點及其轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡的影響[20]。研究報道Klotho 蛋白可能通過調(diào)控TGF-β1/Foxp3/RORγt 信號通路抑制宮頸癌荷瘤小鼠體內(nèi)Treg 和Th7 細胞介導的免疫逃逸，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。本實驗研究清竅膠囊對分泌性中耳炎TGF-β1/Foxp3/RORγt 信號通路的調(diào)節(jié)作用結(jié)果顯示，與空白對照組比較，分泌性中耳炎模型大鼠TGFβ、IL-6、Th17 細胞、Treg 細胞、IL-17、RORγT、IFN-γ水平明顯升高，IL-10、IL-4、Foxp3 水平明顯降低，而清竅膠囊可明顯降低模型大鼠TGF-β、IL-6、Treg 細胞、IL-17、RORγT 水平，明顯升高IL-10、IL-4、Foxp3水平。表明清竅膠囊可有效地調(diào)節(jié)TGF-β/Foxp3/RORγt 信號通路來調(diào)節(jié)Treg 和Th17 細胞介導的中耳炎。

綜上所述，清竅膠囊可有效地調(diào)節(jié)TGF-β/Foxp3/RORγt信號通路，進而調(diào)節(jié)Treg和Th17細胞介導的中耳炎的發(fā)生及發(fā)展，調(diào)節(jié)免疫細胞因子分泌，調(diào)節(jié)Treg/Th17細胞失衡狀態(tài)，改善分泌性中耳炎。