六味地黃丸含藥血清對β-淀粉樣蛋白損傷PC12細(xì)胞中FoxO3a/p-FoxO3a蛋白表達(dá)的影響＊

袁 永，宋軍營，王叢笑，賈亞泉，謝治深，蔡 菊，房紅鍇，張振強(qiáng)

（河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院 鄭州 450046）

阿爾茨海默病是一種發(fā)生于老年人中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年癡呆最常見的類型。多年來，該病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害老年人的身心健康和生活質(zhì)量[1,2]?！唉?淀粉樣蛋白級聯(lián)假說”是基于Aβ（amyloid β-protein，Aβ）異常沉積這一病理特征所建立的AD 病因假說，該假說認(rèn)為，腦內(nèi)Aβ 的積累具有神經(jīng)毒性，過量的Aβ 會造成神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激、突觸改變、Tau 蛋白磷酸化、神經(jīng)遞質(zhì)丟失等，以及膠質(zhì)細(xì)胞的增生和炎癥反應(yīng)[3-4]。這些改變能夠進(jìn)一步引起神經(jīng)系統(tǒng)的病理損傷，如老年斑塊形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)等，造成神經(jīng)元功能障礙甚至變性和死亡，進(jìn)而導(dǎo)致AD 的發(fā)生。根據(jù)AD 發(fā)生的過程，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，抑制神經(jīng)細(xì)胞變性、凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)等已成為研究熱點(diǎn)[5]。

FoxO3a作為一種重要的叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子，能夠通過與其所識別DNA元件相結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、活性氧清除、自噬、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[6-7]。有研究表明，血清中FoxO3a 水平的變化可用來區(qū)分AD與輕度認(rèn)知障礙（Mild Cognitive Impairment，MCI）以及AD 與正常衰老（geriatric control，GC），可能成為治療AD 的 潛 在 新 靶 點(diǎn)[8-9]。 FoxO3a 和 Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）在神經(jīng)細(xì)胞中過表達(dá)，會導(dǎo)致Aβ 的產(chǎn)生并過度積累，進(jìn)而引起神經(jīng)毒性，該過程是AD的病理發(fā)展重要因素[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2誘導(dǎo)的人神經(jīng)母瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)模型中，有多種藥物可通過SIRT/FoxO3a 通路提升超氧化物歧化 酶（superoxide dismutase，SOD）和 過 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）的酶活性,減少細(xì)胞內(nèi)的ROS,降低氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞死亡，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞不受氧化應(yīng)激損傷[11,12]。磷酸化是Forkhead 轉(zhuǎn)錄因子家族成員重要的上游修飾途徑，激活A(yù)KT（Protein Kinase B）可使FoxO3a 磷酸化，磷酸化的FoxO3a 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)過泛素化修飾而降解，失去其轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，反之亦然[13,14]。因此，通過FoxO3a與磷酸化FoxO3a(p-FoxO3a)的轉(zhuǎn)化，間接調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，是干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡的方式之一。

中醫(yī)認(rèn)為老年癡呆的病因多以內(nèi)因?yàn)橹?，或因腎精虧耗，氣血不足，痰瘀互阻，腦髓失養(yǎng)；或因七情內(nèi)傷，久病耗損，年邁體虛，致氣、血、痰、郁、瘀等病邪為患。在癡呆的辨證分型方面主要以腎虛和痰證為主，治療也多以補(bǔ)腎益髓、化瘀止痰、補(bǔ)腎活血等為主要方法[15,16]?，F(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合研究證實(shí)，大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞大量減少是其主要病理特征之一，而腦內(nèi)Aβ 不斷積累所造成的的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡等是造成這一特征的重要原因。

六味地黃丸是宋代錢仲陽依據(jù)《金匱要略》所載崔氏八味丸去桂枝、附子而成，是中醫(yī)填精、滋陰、補(bǔ)腎的經(jīng)典方劑。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、降壓降脂、降血糖等來防治癡呆、高血壓、糖尿病等老年疾病，在改善AD 患者的記憶、智力、精神和行為等方面具有較明顯的效果，其機(jī)理可能與改善腦內(nèi)代謝，抗氧化，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[17,18]。在減輕Aβ 的神經(jīng)細(xì)胞毒性方面，六味地黃丸也具有顯著效果[19]。有研究表明，六味地黃丸在改善AD 模型小鼠的記憶和認(rèn)知功能方面有明顯效果，可以不同程度地改善或延緩AD 病程的發(fā)展，甚至達(dá)到預(yù)防早期老年性癡呆的功效，但是其對AD 發(fā)揮作用的分子機(jī)理還不明確[20]。

本課題組綜合文獻(xiàn)資料，在前期應(yīng)用六味地黃丸對AD 的保護(hù)作用基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)FoxO3a/p-FoxO3a 的影響，探討應(yīng)用六味地黃丸預(yù)防和治療阿爾茨海默病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PC12細(xì)胞由昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)部白潔教授贈予。SPF 級雄性SD 大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司〔合格證編號：SCXK(京)2012-0001〕。六味地黃丸濃縮丸為河南省宛西制藥股份有限公司產(chǎn)品(批號：110316)。

1.2 主要試劑

FoxO3a/p-FoxO3a抗體（美國Epitomics 公司，貨號分別為3280-1，7205-1），Aβ25-35（美國SIGMA 公司，貨號：A4559），兔抗鼠β-actin 抗體（Abways 公司，貨號：P60709），山羊抗兔抗體（博士德生物工程有限公司，貨號：BA1055），MTT〔3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)〕、RIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer)、蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司，貨號分別為298-93-1，P0100，P1250），其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 主要儀器設(shè)備

多功能全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 公司，型號：MultiskanGO）；高速冷凍離心機(jī)（美國BeckmanCoulter 公司，型號：Microfuge?20R）；電泳儀(美國Bio-Rad 公司，型號：JY200C)；蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國BioRad 公司，型號：Mini-Protean）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司，型號：DFC450C）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 六味地黃丸含藥血清（MSLDP）制備

用純水將粉碎后的六味地黃丸濃縮丸溶解，制備混懸液，將SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，分為給藥組和對照組，給藥組以1.08 g·kg-1劑量進(jìn)行灌胃，對照組以等體積的生理鹽水灌胃，2 次/天，連續(xù)灌胃6 次。第7次灌胃1 h 后，以10%水合氯醛麻醉動物，打開大鼠腹腔，腹主動脈采血。所采全血在室溫下靜置2 h 后，3000 r·min-1離心10 min，取血清，56℃水浴滅活30 min，再用0.22 μm 無菌濾器過濾除菌，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 Aβ25-35配制

將Aβ25-35用超純水配制成1 mmoL·L-1的母液，吹打混勻后37℃靜置“老化”5 天，分裝成100 μL/管，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 MTT法檢測PC12細(xì)胞存活率

（1） 細(xì)胞培養(yǎng)將RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5%胎牛血清、10%馬血清及100 U·mL-1青/鏈霉素雙抗配制成完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12 細(xì)胞，每隔24 h 換液，3-4 天傳代1 次，實(shí)驗(yàn)中各組均取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

（2） MTT 法檢測細(xì)胞存活率以2×104個/孔的量將處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將3個96孔板按以下方法處理：第1 個先用RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再用含有0、10、20、40 μmol·L-1Aβ25-35的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；第2 個分別用含有0、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0% MSLDP 的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；第3 個分為正常對照組（不加Aβ25-35和MSLDP 培養(yǎng)48 h）、模型組（先常規(guī)培養(yǎng)24 h，再用含20 μmol·L-1Aβ25-35的培養(yǎng)基處理24h）、MSLDP 預(yù)處理組（先用含20%MSLDP 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再用含20 μmol·L-1Aβ25-35的培養(yǎng)基處理24 h）；每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后先在倒置顯微鏡下觀察各組PC12 細(xì)胞的形態(tài)，再向各孔加入5 mg·mL-1的MTT 20 μL，37℃靜置4 h。結(jié)束后1500 r·min-1離心5 min，吸出培養(yǎng)基，向各孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，用移液器輕輕吹打各孔使結(jié)晶紫完全溶解后，檢測各孔590 nm 波長處的吸光值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值×100%。

1.5 Western blot法檢測FoxO3a/p-FoxO3a表達(dá)水平

以5×104個/mL 的密度將處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入含有0、10、20、40 μmol·L-1Aβ25-35的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，同時，用含有0、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、30.0% MSLDP 的培養(yǎng)基培養(yǎng)另一組細(xì)胞48 h；另取一個六孔板分為正常對照組、模型組、MSLDP 預(yù)處理組按（2）方法處理細(xì)胞。收集細(xì)胞至1.5 mL 離心管內(nèi)，3000 r·min-1離心5 min，PBS 洗2 次，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液重懸細(xì)胞，置冰上裂解30 min 后，13000 r·min-1離心10 min，取上清即為總蛋白，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定總蛋白濃度。各組分別取10 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，300 mA轉(zhuǎn)膜70 min。用5%的脫脂奶4℃封膜過夜；PBST洗膜3 次，加入一抗（1：1000 稀釋）室溫?fù)u床上孵育2 h；PBST 洗膜3 次，再加入二抗（1：3000 稀釋）孵育1 h；PBST 洗膜5 次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影，上機(jī)檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別使用Image J1.8.0、GraghPad Prism 8.0 進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)處理。多組實(shí)驗(yàn)比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA），組內(nèi)較以最小顯著性差異法進(jìn)行比較。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Aβ25-35對PC12細(xì)胞存活率的影響

用MTT 法將采用不同濃度Aβ25-35處理的PC12 細(xì)胞的存活率進(jìn)行比較，結(jié)果表明，不添加Aβ25-35組的細(xì)胞存活率明顯高于10、20、40 μmol·L-1Aβ25-35處理組，且隨著Aβ25-35濃度的增高，細(xì)胞存活率逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。

圖1 Aβ25-35對PC12細(xì)胞存活率的影響

在倒置顯微鏡下觀察Aβ25-35處理后PC12 細(xì)胞的形態(tài)，各組處理后的細(xì)胞與不經(jīng)Aβ25-35處理細(xì)胞相比，隨著Aβ25-35濃度的增高，各孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞的形態(tài)也變得不規(guī)則，并伴隨有細(xì)胞碎片，凋亡/死亡細(xì)胞逐漸增多（圖2）。結(jié)果表明Aβ25-35對PC12細(xì)胞毒性損傷與劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。

圖2 Aβ25-35對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 Aβ25-35 對PC12 細(xì)胞FoxO3a/p-FoxO3a 蛋白表達(dá)的影響

將不同濃度Aβ25-35處理的PC12細(xì)胞中FoxO3a、p-FoxO3a 表達(dá)水平進(jìn)行比較，低濃度（0、10 μmol·L-1）處理組的p-FoxO3a 蛋白表達(dá)量明顯高于高濃度（20、40 μmol·L-1）處理組，F(xiàn)oxO3a 蛋白表達(dá)量則低于高濃度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p-FoxO3a 蛋白表達(dá)明顯呈劑量依賴降低，而FoxO3a的蛋白表達(dá)隨Aβ25-35濃度的增加而增加（圖3）。

圖3 Aβ25-35對PC12細(xì)胞FoxO3a/p-FoxO3a蛋白表達(dá)的影響

2.3 不同濃度MSLDP對PC12細(xì)胞存活率的影響

將不同濃度MSLDP 處理后的PC12細(xì)胞存活率進(jìn)行比較，未使用MSLDP 處理組的PC12 細(xì)胞存活率明顯低于各MSLDP 處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

圖4 MSLDP對PC12細(xì)胞活性的影響

倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞顯示：未使用MSLDP處理組的PC12 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有細(xì)胞碎片出現(xiàn)；采用2.5%、5% MSLDP 培養(yǎng)PC12 細(xì)胞后，各孔內(nèi)細(xì)胞量增多，細(xì)胞大小均一，形態(tài)規(guī)則；10%MSLDP組培養(yǎng)的細(xì)胞量進(jìn)一步增加，聚集成片狀生長，細(xì)胞形態(tài)有拉伸趨勢；20%、30%MSLDP 組的PC12 細(xì)胞形態(tài)拉伸更加明顯，并且細(xì)胞長出了小的棘突，明顯形成分化趨勢（圖5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MSLDP 具有明顯的促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖的作用

圖5 MSLDP對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

2.4 不同濃度MSLDP 處理對PC12 細(xì)胞FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表達(dá)影響

將采用不同濃度MSLDP 處理的PC12 細(xì)胞中FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，低濃度MSLDP 處理組細(xì)胞內(nèi)的p-FoxO3a 表達(dá)水平低于高濃度組，而FoxO3a 表達(dá)量則高于各高濃度MSLDP處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖6）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)oxO3a、p-FoxO3a 蛋白表達(dá)量均對MSLDP 濃度呈劑量依賴性。

圖6 不同濃度MSLDP對PC12細(xì)胞FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表達(dá)的影響

2.5 MSLDP對AD模型細(xì)胞存活率的影響

參考文獻(xiàn)資料，并綜合考慮Aβ25-35和MSLDP 對PC12 細(xì)胞存活率以及二者對FoxO3a、p-FoxO3a 蛋白表 達(dá) 量 影 響，本 課 題 組 選 用20 μmol·L-1Aβ25-35和20%MSLDP 來建立試驗(yàn)用細(xì)胞模型。將各組采用不同方法處理的PC12 細(xì)胞進(jìn)行MTT 法檢測，結(jié)果表明，正常組、MSLDP 干預(yù)組的PC12細(xì)胞存活率高于AD 模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖7）。

圖7 MSLDP預(yù)處理對PC12細(xì)胞活性的影響

倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，Aβ25-35處理的模型組細(xì)胞與正常對照組相比，細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜相對不完整，細(xì)胞碎片增多。MSLDP處理組細(xì)胞與模型對照組相比，凋亡、死亡的細(xì)胞數(shù)減少，活細(xì)胞增多（圖8），MSLDP 對AD 細(xì)胞模型的有明顯的保護(hù)作。

圖8 MSLDP預(yù)處理對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

2.6 MSLDP 對AD 細(xì)胞模型中FoxO3a、p-FoxO3a 蛋白表達(dá)影響

將三組采用不同方法處理的PC12 細(xì)胞中FoxO3a、p-FoxO3a 蛋白表達(dá)量進(jìn)行免疫印跡檢測，正常對照組細(xì)胞中p-FoxO3a 蛋白表達(dá)量高于模型組，F(xiàn)oxO3a蛋白表達(dá)量則低于模型組；MSLDP干預(yù)組細(xì)胞中的p-FoxO3a 蛋白表達(dá)量高于模型組細(xì)胞，而FoxO3a 蛋白表達(dá)水平低于模型組（圖9）。結(jié)果表明，MSLDP 對Aβ25-35所造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用。

圖9 MSLDP對AD細(xì)胞模型的FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

本課題組以Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷著手，通過觀察MSLDP 對細(xì)胞活力和形態(tài)及關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，來探討六味地黃丸對AD影響的分子機(jī)制。

3.1 六味地黃丸和Aβ25-35對神經(jīng)細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度Aβ25-35處理后細(xì)胞的存活率呈劑量依賴的形式降低。這表明Aβ25-35對PC12細(xì)胞毒性損傷在一定濃度范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)。同時觀察處理后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，隨著Aβ25-35濃度增高，各孔內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)改變也隨著Aβ25-35濃度增加而逐漸增多。這一結(jié)果與AD 患者腦內(nèi)Aβ 的不斷積累，毒性不斷增加一致，同時，也與之前的研究結(jié)果相互驗(yàn)證：使用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞后，會造成細(xì)胞活力下降，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，形態(tài)上出現(xiàn)典型的凋亡特征，在一定范圍內(nèi)具有時間和劑量依賴性[21]。

3.2 FoxO3a與Aβ的相互關(guān)系

FoxO3a 是細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)和增殖/凋亡的核心調(diào)控因子，控制著復(fù)雜的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。因此，它可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，整合來自能量、生長因子和應(yīng)激信號級聯(lián)的輸入，成為在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和抗衰老機(jī)制以及腫瘤等研究中較為新穎的研究熱點(diǎn)。六味地黃丸的抗衰老作用主要與抗氧化和抗凋亡有關(guān)，Aβ積累所表現(xiàn)出來的毒性會造成神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡，而體內(nèi)FoxO3a的改變能夠起下游基因產(chǎn)生抗氧化和抗凋亡的作用，本課題組結(jié)合三者的相關(guān)性，研究其發(fā)揮相互作用的具體方式。細(xì)胞內(nèi)的FoxO3a蛋白經(jīng)Aβ25-35的誘導(dǎo)后表達(dá)量升高，而p-FoxO3a 的蛋白表達(dá)量降低，這提示Aβ25-35可能通過對FoxO3a 的調(diào)節(jié)來激活細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。

3.3 MSLDP 對細(xì)胞內(nèi)FoxO3a的影響

因?yàn)榱姿峄荈orkhead 轉(zhuǎn)錄因子家族成員重要的上游修飾途徑，F(xiàn)oxO3a 是PI3K/AKT 信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子[22,23]，激活A(yù)KT 能夠?qū)е翭oxO3a 磷酸化，磷酸化的FoxO3a 被降解而失去其轉(zhuǎn)錄活性。MSLDP能夠進(jìn)細(xì)胞增殖，同時還能影響細(xì)胞內(nèi)FoxO3a與p-FoxO3a 的表達(dá)量，因此，其發(fā)揮作用的方式可能與AKT 激活所導(dǎo)致FoxO3a 磷酸化密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MSLDP 有明顯的促進(jìn)PC12 細(xì)胞增殖的作用，高濃度的MSLDP還能使細(xì)胞長出小突觸，形成分化趨勢。同時，MSLDP 預(yù)處理還能夠明顯降低Aβ25-35對細(xì)胞的毒性，減少細(xì)胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活子1α（PGC-1α）能夠通過下調(diào)FoxO3a 降低APP 代謝，減少Aβ 的積累，F(xiàn)oxO3a 對神經(jīng)細(xì)胞自身APP代謝為Aβ有直接干預(yù)作用[24]，這與本課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：MSLDP 干預(yù)后的PC12 細(xì)胞內(nèi)p-FoxO3a 蛋白表達(dá)量升高，而FoxO3a 的蛋白表達(dá)量則降低。

綜上所述，六味地黃丸對Aβ25-35所造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)FoxO3a 與p-FoxO3a 的表達(dá)量，影響其下游基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的抗氧化、抗凋亡因子，促進(jìn)細(xì)胞增值，從而實(shí)現(xiàn)其對AD 的預(yù)防及治療。本實(shí)驗(yàn)為AD 的預(yù)防和治療找出一個新思路，同時也為在臨床上應(yīng)用六味地黃丸改善AD 患者的病情和減緩AD病程發(fā)展提供了依據(jù)。