治療血管性癡呆的中藥復(fù)方研究思路與方法
——參麻益智方防治血管性癡呆的開發(fā)研究＊

周麗娟，劉美霞，劉劍剛，孫成成，李南南，宋博策，暢蘇瑞，韋 云，3，石丹丹，李 浩，3

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 北京 100700；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 北京 100091；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院老年病研究所 北京 100091）

在形勢(shì)嚴(yán)峻的全世界人口老齡化大背景下，據(jù)報(bào)道全世界每年新增990多萬(wàn)癡呆患者，2019年止，世界上已有近5000萬(wàn)癡呆患者，估計(jì)2050年將增加至1.52億人[1]。且據(jù)推算，2030 年全球用于癡呆癥的費(fèi)用將達(dá)到2.54 萬(wàn)億美元，2050 年將達(dá)到9.12 萬(wàn)億美元[2]，這將給整個(gè)社會(huì)和患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)。而血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是全球僅次于阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）的第二大最常見的癡呆[3]。VaD 是一種由大腦血流量減少和神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）受損導(dǎo)致的進(jìn)行性神經(jīng)認(rèn)知功能障礙的臨床綜合征，主要癥狀包括記憶喪失、語(yǔ)言障礙和執(zhí)行功能障礙，病因繁雜，具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚[4-5]，臨床上治療也頗為棘手。

中醫(yī)認(rèn)為，VaD 的發(fā)病與中風(fēng)密切相關(guān)，氣虛血瘀、肝陽(yáng)上亢是其主要病機(jī)之一[6]。中醫(yī)中藥也因其自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)往往在VaD 等疑難疾病的診療過程中有著獨(dú)到的見解和奇特的療效，同時(shí)，中醫(yī)中藥這獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)也對(duì)推動(dòng)中藥現(xiàn)代化發(fā)展、新藥開發(fā)以及臨床應(yīng)用方面等有著重要意義[7]。但也存在一些問題，主要是中醫(yī)中藥發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)并不完全清楚，亦缺乏完備規(guī)范的針對(duì)中藥復(fù)方研發(fā)的有效性及安全性評(píng)價(jià)體系，這就限制了其開發(fā)及國(guó)際化進(jìn)程[8]。本文以臨床治療VaD 的經(jīng)驗(yàn)方參麻益智方為研究對(duì)象，從臨床療效、藥學(xué)研究、安全性評(píng)價(jià)、藥效機(jī)制四個(gè)方面，探討新藥開發(fā)的過程，希冀為中藥復(fù)方的研發(fā)提供一些思考，以及可供借鑒的思路與方法。

1 臨床療效是確定治療血管性癡呆的中藥復(fù)方是否具有研發(fā)價(jià)值的根本

中醫(yī)藥愈來愈受到國(guó)家重視。近年，國(guó)家把發(fā)展中醫(yī)藥納入國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略，《中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要（2016-2030年）》中明確指出，中醫(yī)藥作為我國(guó)獨(dú)特的衛(wèi)生資源，具有原創(chuàng)優(yōu)勢(shì)的科技資源，應(yīng)著力推進(jìn)中醫(yī)藥創(chuàng)新，加強(qiáng)中醫(yī)藥科學(xué)研究[9]。而確切的療效是中藥及天然植物藥研發(fā)的基礎(chǔ)，是中藥新藥開發(fā)的關(guān)鍵所在，也是中藥新藥研發(fā)的首要評(píng)價(jià)環(huán)節(jié)[10]。VaD 由于該疾病的復(fù)雜性目前西醫(yī)治療十分有限，主要從其進(jìn)展和行為的管理以及通過改變其危險(xiǎn)因素進(jìn)行預(yù)防這兩種途徑入手[11]。而中醫(yī)藥特點(diǎn)突出，本課題組在長(zhǎng)期臨證經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上總結(jié)出來的中藥復(fù)方參麻益智方防治VaD 臨床療效確切，亟待進(jìn)一步的研究。

1.1 參麻益智方的臨床神經(jīng)心理學(xué)量表評(píng)估

中藥復(fù)方參麻益智方，由人參、天麻、川芎及鬼箭羽組成，具有益氣活血化瘀，平肝潛陽(yáng)的功效，臨床應(yīng)用近20 年，臨床療效顯著。在臨證經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步明確參麻益智方的臨床療效及作用機(jī)制，本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了針對(duì)性的隨機(jī)對(duì)照臨床研究。共觀察了64 例氣虛血瘀、肝陽(yáng)上亢型輕中度VaD 患者，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組服用參麻益智免煎顆粒劑，對(duì)照組服用銀杏葉片，療程為3個(gè)月[12]。

研究結(jié)果顯示，在認(rèn)知功能方面，兩種藥物均可提高VaD 患者的簡(jiǎn)易智能狀態(tài)量表（mini mental state examination，MMSE）和蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）積分，顯著降低臨床神經(jīng)功能缺損量表（national institute of health stroke scale，NIHSS）積分，且參麻益智方療效優(yōu)于銀杏葉組，尤其是在患者延遲回憶、計(jì)算力與注意力以及視空間與執(zhí)行能力等方面。在日常生活能力方面，兩組患者日常生活能力量表（activity of daily living scale，ADL）評(píng)分均較治療前提高，但兩組之間差異不大。在臨床癥狀方面，兩種藥物均可改善VaD 患者智能減退、頭暈、肢麻、神疲乏力、口唇紫紺等癥狀，但參麻益智方療效更為突出（圖1）。

圖1 參麻益智方對(duì)VaD患者認(rèn)知功能的影響[12]

1.2 參麻益智方的臨床機(jī)理研究

在作用機(jī)制方面，兩組患者血清中樞膽堿能系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的指標(biāo)均有改善，參麻益智方調(diào)控膽堿能系統(tǒng)的作用更顯著（圖2）。此外，研究[6]還表明，參麻益智方可提高VaD 患者的紅細(xì)胞變形能力、抑制血小板的聚集和黏附性、降低血液黏度，改善患者血液的流變性（圖3）。提示參麻益智方能夠明顯改善VaD 患者的認(rèn)知功能，其臨床作用機(jī)制可能涉及提高乙酰膽堿含量，改善機(jī)體的細(xì)胞代謝能力，降低炎癥因子含量等方面。

圖2 參麻益智方改善VaD患者認(rèn)知功能的機(jī)制[12]

圖3 參麻益智方對(duì)VaD患者認(rèn)知功能血液流變性的影響[6]

2 制備工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控是治療血管性癡呆的中藥復(fù)方研發(fā)的前提

中藥復(fù)方制劑工藝研究應(yīng)基于“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）”的理念，遵循最大程度保留其原有臨床療效的基本思路，在保證制劑療效、安全性、質(zhì)量可控的前提下，一方面尊重傳統(tǒng)，另一方面運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，力保明確藥物基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出最優(yōu)工藝路線[13-14]。研究表明，參麻益智方中人參主要活性成分人參皂苷，其具有清除氧化自由基、抗氧化、抗衰老，抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、神經(jīng)損傷修復(fù)、改善記憶力等作用[15]。天麻主要活性成分天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷提供保護(hù)，通過減輕神經(jīng)毒性，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化等作用[16]。川芎主要活性成分阿魏酸有較強(qiáng)的抗氧化性，可以有效清除羥自由基、超氧自由基等，還有降血脂、神經(jīng)保護(hù)等作用[17]。鬼箭羽的主要化學(xué)成分，包括葉含衛(wèi)矛堿、槲皮素等，具有降血糖、降血脂，抗炎、抗氧化，以及血管保護(hù)等作用[18]。

本課題組根據(jù)每味中藥各自的特點(diǎn)，傳統(tǒng)工藝聯(lián)合現(xiàn)代技術(shù)，采用了參麻益智方全方醇提、全方水提及人參、天麻醇提+川芎、鬼箭羽水提三種提取工藝明確了藥物有效物質(zhì)成分，并采用高效液相色譜法對(duì)以上三種參麻益智方提取物進(jìn)行主要有效成分及入腦成分含量的測(cè)定，最終確定人參、天麻醇提+川芎、鬼箭羽水提工藝為最佳提取工藝，并獲得國(guó)家發(fā)明專利（ZL 201610565191.5），該制備工藝共明確11種有效成分，分別為人參的有效成分人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd，天麻的有效成分天麻素、天麻苷元，鬼箭羽的有效成分槲皮素、香草醛，川芎的有效成分阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H；其中人參皂苷Rg1、Rb1、Re、天麻素、槲皮素、阿魏酸6種為主要入腦成分（圖4）。

圖4 參麻益智方提取物主要入腦成分的液相色譜圖[6]

同時(shí)并對(duì)該方進(jìn)行了四種不同制備方法初步的藥效學(xué)驗(yàn)證（圖5）。1號(hào)方全成分入藥，較好地保留了中藥的全部化學(xué)成分，但服用量較大，制劑成型較為困難；2 號(hào)方保持了湯劑處方及群藥共煎煮的特點(diǎn)，具有湯劑療效穩(wěn)定、易于吸收的優(yōu)點(diǎn)，但人參作為貴細(xì)藥材，與他藥群煎有所浪費(fèi)；3 號(hào)方中人參采用現(xiàn)代提取工藝，雖然提高了人參有效成分的含量，但與傳統(tǒng)服法差別較大；4 號(hào)方中人參單煎既能溶出最大有效量，又與其他三味藥保持了一致的傳統(tǒng)水煎工藝。藥效學(xué)結(jié)果顯示1 號(hào)方的藥效略優(yōu)，但綜合考慮各自制備工藝的優(yōu)劣及臨床常用方法，最終確定4 號(hào)方即人參加水單煎，天麻等其他三味藥加水群煎為最優(yōu)制備工藝[19]。并采用高效液相色譜法對(duì)該制備工藝獲得的參麻益智方提取物中有效成分人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rb1、天麻素、阿魏酸、槲皮素進(jìn)行了標(biāo)定（圖6）。

圖5 參麻益智方的制備工藝研究

圖6 參麻益智方主要成分混標(biāo)的離子流色譜圖

3 安全性是治療血管性癡呆的中藥復(fù)方研發(fā)的必要條件

安全且無(wú)明顯毒副作用是所有中西藥物研發(fā)所必須具備的要素，中藥復(fù)方也不例外。安全性評(píng)價(jià)主要采用急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。通過觀察動(dòng)物急性中毒表現(xiàn)，以提供受試藥物的急性毒性資料，確定毒作用方式、中毒反應(yīng)，并為慢性毒性試驗(yàn)的觀察指標(biāo)及劑量分組提供參考。并進(jìn)一步通過慢性毒性試驗(yàn)來研究重復(fù)接觸受試藥物毒性作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而確定未觀察到有害效應(yīng)的水平和觀察到有害效應(yīng)的最低水平，為進(jìn)行危險(xiǎn)度評(píng)定和制定人類接觸的安全限量提供參考[20]。課題組對(duì)參麻益智方進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，以明確其安全性。

3.1 中藥復(fù)方參麻益智方的急性毒性試驗(yàn)

按照常規(guī)方法對(duì)參麻益智方進(jìn)行小鼠的急性毒性試驗(yàn)[21]，預(yù)實(shí)驗(yàn)中無(wú)法測(cè)出半數(shù)致死量（lethal dose 50，LD50），故進(jìn)行了最大給藥量測(cè)定。試驗(yàn)分為對(duì)照組和給藥組，給藥組24 h 內(nèi)按最大體積及最大藥物濃度一次灌胃給藥，對(duì)照組灌服同體積蒸餾水，每日觀察動(dòng)物狀況。結(jié)果顯示小鼠無(wú)明顯不良反應(yīng)及死亡情況，且體質(zhì)量正常增長(zhǎng)，精神狀態(tài)佳，毛色白而有光澤，二便正常，解剖后大體觀察各主要臟器亦未見異常。最終確定參麻益智方對(duì)小鼠灌胃的最大給藥量為97.6 g 生藥/kg，為臨床用量的207 倍（臨床用量0.47 g生藥/kg），可見在常規(guī)劑量下服用是安全的。

3.2 中藥復(fù)方參麻益智方的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

在急性毒性試驗(yàn)證明參麻益智方初步安全性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行了參麻益智方對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)分為四組：對(duì)照組（灌服同體積蒸餾水），參麻益智方5.875 g、11.75 g、23.5 g生藥/kg（體質(zhì)量）劑量組(分別為臨床用量的12.5、25、50 倍，臨床用量為0.47 g 生藥/kg/日)，連續(xù)給藥26 周。觀察藥物對(duì)大鼠機(jī)體是否產(chǎn)生蓄積性及遲緩性中毒反應(yīng)，提供毒性反應(yīng)的靶器官及損害的可逆性，從而為臨床的安全用藥提供參考，以確保臨床用藥安全。試驗(yàn)結(jié)果表明不同劑量參麻益智方連續(xù)灌胃給藥26周后，各組大鼠活動(dòng)及精神狀態(tài)良好，給藥期間大鼠二便正常，毛色白且有光澤，均未出現(xiàn)中毒性死亡。個(gè)別劑量組大鼠攝食量及體質(zhì)量與對(duì)照組比較有差異，可能與灌藥影響大鼠食欲，進(jìn)而影響體質(zhì)量增長(zhǎng)有關(guān)。血液學(xué)、血清生化、心電圖等各項(xiàng)檢查指標(biāo)均在生理范圍內(nèi)波動(dòng)，未見不良反應(yīng)。解剖大體及鏡下觀察各組動(dòng)物臟器均未發(fā)現(xiàn)異常改變，亦未見中毒性病理改變，為臨床長(zhǎng)期安全用藥提供了可靠保障。

4 藥物作用機(jī)制明確為治療血管性癡呆的中藥復(fù)方走向國(guó)際化提供了可能

中藥復(fù)方因成分復(fù)雜，作用機(jī)制不夠明確，限制了其與國(guó)際接軌或被國(guó)際范圍內(nèi)認(rèn)可，因此在中藥復(fù)方的研發(fā)上要尤其注重明確藥物作用機(jī)制。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)有助于明確藥效及探討藥物作用機(jī)制。但目前尚無(wú)一種能夠完全模擬人類VaD 病理及行為改變的動(dòng)物模型，最常見的有2 血管閉塞（2 vessel occlusion，2VO）VaD 模型等血管閉塞模型，微球誘導(dǎo)多發(fā)性梗死VaD 模型等多發(fā)性梗死和血栓栓塞模型[22]。此外，國(guó)內(nèi)外科研人員還常選用東莨菪堿等抗中樞乙酰膽堿藥物制造記憶障礙模型，對(duì)記憶影響的機(jī)制研究較為明確，結(jié)果重現(xiàn)性較好[23]。同時(shí)選用不同類型的VaD 動(dòng)物模型觀察復(fù)方防治VaD 的藥理作用，能夠從多個(gè)靶點(diǎn)較全面地評(píng)價(jià)復(fù)方防治VaD 的療效及作用機(jī)制。

4.1 基于雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎致VaD 模型的參麻益智方的藥效學(xué)研究

研究表明，慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）與VaD 和AD 的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，且最廣泛應(yīng)用的CCH 和VaD 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪谴笫笥谰眯噪p側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞，即2VO 模型[24]。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎致2VO 模型可以影響腦血流，誘發(fā)以腦組織慢性廣泛的低氧、低灌注狀態(tài)為主要病變特點(diǎn)，慢性腦缺血為主要病理特征的大鼠VaD模型。

4.1.1 參麻益智方對(duì)大鼠行為學(xué)的影響

水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，模型組逃避潛伏期顯著增加，尋臺(tái)次數(shù)均顯著減少；參麻益智方三劑量組逃避潛伏期均顯著減少，尋臺(tái)次數(shù)均顯著增加。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖7）。

圖7 大鼠水迷宮逃避潛伏期及尋臺(tái)次數(shù)比較

水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)，模型組穿越原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比均顯著減少；參麻益智方三劑量組穿越原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比均顯著增加。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖8）。

圖8 大鼠水迷宮穿越原平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間比較

4.1.2 參麻益智方對(duì)大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下海馬組織顯示，假手術(shù)組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元排列整齊緊密，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜清晰，胞質(zhì)豐富，核膜、核仁較明顯，未見神經(jīng)元變性或壞死。模型組大鼠的海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元排列散亂稀疏，細(xì)胞層次和數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞有核固縮現(xiàn)象，可見細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，甚至壞死。鹽酸多奈哌齊組、參麻益智方三劑量組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元排列有一定的改善，細(xì)胞數(shù)量較模型組有明顯增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞膜大致清晰，偶見細(xì)胞空泡變性，少有細(xì)胞壞死（圖9）。

圖9 光鏡下觀察參麻益智方對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)的影響（HE×100）

電鏡下海馬組織顯示，假手術(shù)組大鼠海馬線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，排列整齊，膜外形基本完整，線粒體嵴密集，沒有見到明顯的腫脹及空泡形成。模型組大鼠的海馬線粒體腫脹明顯，膜模糊不清，部分膜發(fā)生破裂，線粒體嵴斷裂疏松溶解，少數(shù)線粒體內(nèi)可見空泡形成。鹽酸多奈哌齊組、參麻益智方三劑量組海馬線粒體排列有一定的改善，結(jié)構(gòu)較為完整，線粒體膜大致清晰，稍有腫脹，偶見空泡變性（圖10）。

圖10 電鏡下觀察參麻益智方對(duì)大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響（×20000）

4.1.3 參麻益智方對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)Ach、AchE含量的影響

模型組Ach 含量顯著減少，AchE 含量顯著增加；參麻益智方高劑量組Ach 含量顯著增加，參麻益智方三劑量組AchE 含量均顯著減少。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖11）。

圖11 各組大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)AchE、Ach含量

4.1.4 參麻益智方對(duì)大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α含量的影響

模型組IL-1β、TNF-α 含量均顯著增加；參麻益智方三劑量組IL-1β、TNF-α 含量均顯著減少。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖12）。

圖12 各組大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α含量

4.1.5 參麻益智方對(duì)大鼠血清GSH、GSH-PX、MDA、SOD含量的影響

模型組谷胱甘肽（GSH）、GSH-PX 含量均顯著減少，MDA 含量均顯著增加；參麻益智方中、高劑量組GSH、SOD 含量均顯著增加，參麻益智方高劑量組GSH-PX 含量顯著增加，參麻益智方三劑量組MDA 含量均顯著減少。鹽酸多奈哌齊組GSH、含量顯著增加（圖13）。

圖13 各組大鼠血清GSH、GSH-PX、MDA、SOD含量

綜上所述，雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎是致慢性腦缺血較為經(jīng)典的模型。大鼠施行永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)后，出現(xiàn)腦血流量減少，學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，腦內(nèi)神經(jīng)元損傷及死亡，突觸及樹突損傷，以及神經(jīng)炎癥反應(yīng)等的時(shí)程變化，能復(fù)制人類VaD 的病理改變和臨床癥狀，為VaD 的病理機(jī)制和防治藥物研究提供幫助[25]?；诖四Ｐ瓦M(jìn)行的參麻益智方藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：給予藥物治療后，參麻益智方組大鼠逃避潛伏期、AchE、IL-1β、TNF-α、MDA 含量均顯著減少，尋臺(tái)次數(shù)、穿越原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比、Ach、GSH、GSH-PX、SOD 含量均顯著增加。說明參麻益智方可以提高模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，改善海馬的病理形態(tài)，保護(hù)神經(jīng)元，增強(qiáng)膽堿能系統(tǒng)功能，抑制海馬CA1 區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增生，抑制炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力[26]。

4.2 基于多發(fā)性腦梗死致VaD 模型的參麻益智方的藥效學(xué)研究

多發(fā)性梗死和血栓栓塞模型是VaD 臨床上最相關(guān)的模型。采用微球栓塞劑或者大鼠自體血栓致多發(fā)性腦梗死VaD 模型，使栓子從頸動(dòng)脈進(jìn)入腦內(nèi)廣泛不均勻分布，誘發(fā)以腦組織中廣泛小血管病變?yōu)橹饕∽兲攸c(diǎn)，小缺血灶或微梗死灶和缺血性白質(zhì)病變?yōu)橹饕±硖卣鞯拇笫骎aD模型[27]。

4.2.1 參麻益智方對(duì)大鼠行為學(xué)的影響

水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，模型組逃避潛伏期顯著增加，尋臺(tái)次數(shù)顯著減少；參麻益智方三劑量組逃避潛伏期均顯著減少，參麻益智方中、高劑量組尋臺(tái)次數(shù)均顯著增加。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖14）。

圖14 大鼠水迷宮逃避潛伏期及尋臺(tái)次數(shù)比較[32]

水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)，模型組穿越原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比均顯著減少；參麻益智方中、高劑量組穿越原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比均顯著增加。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖15）。

圖15 大鼠水迷宮穿越原平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間比較[32]

4.2.2 參麻益智方對(duì)大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)Ach、AchE 含量的影響

模型組Ach 含量顯著減少，AchE 含量顯著增加；參麻益智方中、高劑量組Ach 含量均顯著增加，AchE含量均顯著減少。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖16）。

圖16 各組大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)AchE、Ach含量

4.2.3 參麻益智方對(duì)大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α含量的影響

模型組IL-1β、TNF-α含量均顯著增加；參麻益智方三劑量組IL-1β含量均顯著減少，參麻益智方中、高劑量組TNF-α 含量均顯著減少。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖17）。

圖17 各組大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α含量[32]

4.2.4 參麻益智方對(duì)大鼠血清GSH、GSH-PX、MDA、SOD的影響

模型組GSH、GSH-PX、SOD 含量均顯著減少，MDA 含量均顯著增加；參麻益智方中、高劑量組GSH、GSH-PX 含量均顯著增加，MDA 含量均顯著減少，參麻益智方三劑量組SOD 含量均顯著增加。鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖18）。

圖18 各組大鼠血清GSH、GSH-PX、MDA、SOD含量[32]

腦能量不足或腦局部供能不足是多發(fā)性腦梗死導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能低下的關(guān)鍵微環(huán)境改變[28]。而腦白質(zhì)作為大腦皮質(zhì)處理信息的補(bǔ)充，對(duì)人的認(rèn)知功能亦十分重要，腦白質(zhì)損傷是VaD 的常見病理表現(xiàn)之一[29-31]?；诖四Ｐ瓦M(jìn)行的參麻益智方藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：給予藥物治療后，參麻益智方能夠明顯減少大鼠逃避潛伏期、AchE、IL-1β、TNF-α、MDA 含量，增加大鼠尋臺(tái)次數(shù)、穿越原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比、Ach、GSH、GSH-PX、SOD 含量，說明參麻益智方對(duì)多發(fā)腦梗死性VaD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用，通過改善大鼠海馬病理形態(tài)，減輕腦白質(zhì)損傷，增強(qiáng)膽堿能系統(tǒng)功能，抑制炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力，以及對(duì)NVU 的各個(gè)組成部分包括血腦屏障、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞間聯(lián)絡(luò)通道的神經(jīng)保護(hù)作用[32-34]。

4.3 基于獲得性記憶障礙VaD 模型的參麻益智方的藥效學(xué)研究

學(xué)習(xí)和記憶是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過程，主要包括記憶獲得、記憶鞏固和記憶再現(xiàn)三個(gè)重要過程，不同的影響因素由于作用途徑和靶點(diǎn)不同，所產(chǎn)生的記憶障礙類型也不同[35]。本課題組主要從東莨菪堿、氯丙嗪和乙醇分別誘導(dǎo)的三種經(jīng)典記憶障礙模型入手，探討參麻益智方的藥效機(jī)制。研究表明東莨菪堿主要是通過阻斷腦皮層和海馬膽堿能系統(tǒng)突觸后膜的受體，進(jìn)而改變受體蛋白的構(gòu)型，造成記憶損傷[36]。而氯丙嗪主要是通過阻斷多巴胺受體、5-羥色胺受體、α-腎上腺素受體、M-型乙酰膽堿受體，進(jìn)而特異性阻滯第一級(jí)記憶向第二級(jí)記憶轉(zhuǎn)移的過程，造成記憶獲得障礙[37-38]。而乙醇主要是一方面通過抑制中樞神經(jīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)，另一方面通過使脂質(zhì)過氧化，造成活性氧大量累積氧化應(yīng)激效應(yīng)，最終損害膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)[39]。

本課題組研究結(jié)果顯示，與東莨菪堿模型組比較，鹽酸多奈哌齊組、參麻益智方中、高劑量組小鼠潛伏期顯著延長(zhǎng)，參麻益智方三劑量組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（圖19）；與氯丙嗪模型組比較，參麻益智方中、高劑量組小鼠潛伏期顯著延長(zhǎng)，參麻益智方高劑量組錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少，鹽酸多奈哌齊組表現(xiàn)出相同的作用（圖20）；與乙醇模型組比較，參麻益智方中、高劑量組潛伏期顯著延長(zhǎng)，鹽酸多奈哌齊組、參麻益智方中、高劑量組錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（圖21）。表明參麻益智方對(duì)東莨菪堿、氯丙嗪和乙醇致記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能具有改善作用，其機(jī)制可能與保護(hù)膽堿能系統(tǒng)，提高中樞神經(jīng)興奮性，改善神經(jīng)遞質(zhì)活性，以及保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用有關(guān)。

圖19 小鼠跳臺(tái)逃避潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)比較（東莨菪堿模型）

圖20 小鼠跳臺(tái)逃避潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)比較（氯丙嗪模型）

圖21 小鼠跳臺(tái)逃避潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)比較（乙醇模型）

5 討論

VaD 的發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷增加，導(dǎo)致全球老年人口中癡呆癥日益加劇[40]。針對(duì)VaD這一老年重大疑難慢性疾病，本研究團(tuán)隊(duì)首先提出“氣虛血瘀，肝陽(yáng)上亢”為VaD 的主要中醫(yī)病因病機(jī)理論，基于這一理論基礎(chǔ)，結(jié)合多年的臨證實(shí)踐，確定由“人參、天麻、鬼箭羽、川芎”組成的中藥復(fù)方參麻益智方，體現(xiàn)了中醫(yī)藥特色和優(yōu)勢(shì)。在臨床研究證實(shí)其療效的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從藥學(xué)、毒理學(xué)及藥效學(xué)等方面對(duì)其進(jìn)行探討和研究，參麻益智方目前已獲得了北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑備案（京藥制備字Z20200005000），并在國(guó)家科技重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目的支持下，參麻益智顆粒正在開展進(jìn)一步新藥的研發(fā)。

中藥復(fù)方的藥學(xué)研究是藥品質(zhì)量可控的保證，也是安全性和有效性實(shí)驗(yàn)的前提，主要包括藥材提取、制備、質(zhì)量控制研究等[41]。本研究團(tuán)隊(duì)按照藥典及相應(yīng)規(guī)范，結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，進(jìn)行了提取制備工藝的篩選及優(yōu)化，并明確參麻益智方的主要有效成分，最終確定其最佳提取工藝，為治療VaD 的中藥復(fù)方的藥學(xué)研究模式提供借鑒。藥物安全關(guān)乎全人類的健康與生存，藥物安全性評(píng)價(jià)是保證藥物安全的第一道關(guān)口[42]。按照現(xiàn)代毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，選用常規(guī)經(jīng)典的急性毒性實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)，探索參麻益智方對(duì)小鼠的急性毒性作用及大鼠的長(zhǎng)期毒性作用，為參麻益智方的安全性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

中藥復(fù)方的藥效機(jī)制研究是中藥復(fù)方研發(fā)中至關(guān)重要的一環(huán)，也是目前中藥復(fù)方研究中難度較大的一環(huán)，需要不斷豐富和發(fā)展符合中醫(yī)藥臨床特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)體系來揭示中藥復(fù)方功能主治和證的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。VaD 是一組復(fù)雜的癥狀群，涵蓋了腦血管疾病致癡呆癥的一系列臨床和神經(jīng)病理表現(xiàn)，病因及病理機(jī)制不明，進(jìn)展困難[43]。然而目前尚無(wú)與之完全匹配相吻合的動(dòng)物模型，本研究團(tuán)隊(duì)綜合不同模型的特點(diǎn)，選用了多種VaD 動(dòng)物模型，從多個(gè)角度較為全面的評(píng)價(jià)了中藥復(fù)方治療VaD 的療效及作用機(jī)制。但仍然存在諸多不足，藥效學(xué)設(shè)計(jì)方案仍不夠完善，未能從腦微血管方面進(jìn)行機(jī)制探討，也未從腦組織直觀檢測(cè)炎癥因子、氧化應(yīng)激水平及更多機(jī)制評(píng)價(jià)指標(biāo)，并且也未建立中醫(yī)證型動(dòng)物模型等等，應(yīng)在今后的研究中予以補(bǔ)足。

中藥復(fù)方是中醫(yī)藥文化的精髓，是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，是中藥新藥研發(fā)的主要類別，是中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新的重要載體[44]。中醫(yī)藥現(xiàn)代化創(chuàng)新的來源是中醫(yī)藥理論和臨床實(shí)踐及現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，將傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代科學(xué)體系，技術(shù)的結(jié)合、整合、融合，可以上升到新的發(fā)展高度[45]。本研究團(tuán)隊(duì)遵循源于臨床-證于實(shí)驗(yàn)-回歸臨床的研發(fā)路徑，雖然研究方案仍有待進(jìn)一步改進(jìn)，但是基本思路尚清，一方面為課題組今后開展的研究提供了重要支撐及基本研究方案，同時(shí)另一方面也為中藥復(fù)方新藥的研發(fā)提供一些參考。