藏藥二十五味珊瑚丸對阿爾茨海默癥小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)＊

角加才仁，仲格嘉，李宏紅，胡賢達(dá)，韓亞南，陳茜茜，吳金鵬＊＊，陰慧娟

（1.中國藏學(xué)研究中心北京藏醫(yī)院 北京 100029；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所激光醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 天津 300192）

1 引言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease,AD），俗稱老年癡呆（占所有癡呆患者的60%-80%），是一種典型的中樞神經(jīng)退行性病變，患者主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、記憶力逐漸衰退、行為異常及社交障礙等，直至癡呆[1]?！?018年全球阿爾茨海默病報(bào)告》指出AD 是人類的問題，也是一個(gè)全球性的問題。全球每3 秒鐘就將有1 例癡呆患者產(chǎn)生。AD 病理特征是患者大腦中出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β, Aβ）聚集形成的老年斑、tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元及突觸的功能失調(diào)以及大腦中的長期慢性炎癥，最終發(fā)生退行性病變等。目前除傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)類藥物如美金剛等有限改善一些表面癥狀外，其他藥物開發(fā)無一成功，AD的治療陷入困境。

近年來的研究表明，腸道菌群通過多種途徑參與AD 的發(fā)生和發(fā)展，被認(rèn)為是AD 治療的新靶點(diǎn)[2]。腸道菌群主要通過神經(jīng)、內(nèi)分泌、代謝和免疫等途徑影響AD 的發(fā)生[2-3]。老年患者腸壁變薄，腸道菌群多樣性發(fā)生變化，有益菌群和有害菌群比例失調(diào)，產(chǎn)生諸如細(xì)菌Aβ、脂多糖、乙酰膽堿、5-羥色胺、短鏈脂肪酸等物質(zhì)，不僅激活免疫細(xì)胞，加重神經(jīng)炎癥，還使腸道屏障和血腦屏障功能進(jìn)一步受損[4]。研究表明腸道菌群調(diào)節(jié)（益生元、益生菌、糞菌移植等方法）對阿爾茲海默癥認(rèn)知能力和Aβ 淀粉樣沉積有改善作用[5-7]。Wang 等發(fā)現(xiàn)糞菌移植可使3 月齡APPSWE/PS1ΔE9小鼠Aβ 斑塊周圍由小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥活動(dòng)增強(qiáng)，而小膠質(zhì)細(xì)胞是Aβ斑塊清除的主要細(xì)胞[8]。伊朗的1項(xiàng)隨機(jī)雙盲對照實(shí)驗(yàn)表明AD患者服用12周益生菌和硒補(bǔ)充劑能有效提高患者認(rèn)知能力和包括抗氧化能力等在內(nèi)的代謝水平[9]。

二十五味珊瑚丸（ershiwuwei coral pill,CP25）有活血化瘀、消炎止痛、安神鎮(zhèn)靜等療效，在藏藥中被用于治療“白脈病”，也就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10]，如頭痛、癲癇、中風(fēng)等[11-13]。CP25 含有25 種植物藥材和礦物質(zhì)成分，Ying等的論文中給出了CP25的配方[14]。研究發(fā)現(xiàn)25 種成分中，訶子（Terminalia chebula Retz）提取物具有抗氧化作用[15]；紅花（Carthamus tinctorius）提取物具有改善血液循環(huán)和抗血栓形成作用，同時(shí)還具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用[16]；甘草（glycyrrhiza）代謝物具有抗炎、抗菌和降血脂作用，對神經(jīng)[10]細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用[17]；獐牙菜（Swertia bimaculata(sieb.Et zucc.)hook.f.et thoms）能顯著抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還具有保護(hù)胃腸道、抗炎和抗菌等作用[18]；沉香具有明顯的降血壓作用[19]；藏菖蒲（Acorus calamus L.）對中樞神經(jīng)有雙向調(diào)節(jié)作用，既有興奮也有抑制作用[20]；紅珊瑚、珍珠等礦物質(zhì)含有磷酸鈣，對治療腦缺血有明顯作用[21]；其他礦物質(zhì)含有人體必需的常量元素和微量元素，對神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)和抗炎鎮(zhèn)痛都有積極的作用[22-23]。

為了探索CP25 在治療阿爾茲海默癥上的可能性，本團(tuán)隊(duì)在前期不但對二十五味珊瑚丸的毒理學(xué)及主要指標(biāo)成分的含量進(jìn)行了詳細(xì)的分析[24]，而且對其中的神經(jīng)保護(hù)作用物質(zhì)進(jìn)行了分析[25]，同時(shí)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對前期鑒別出的35種入血成分進(jìn)行了潛在靶點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示CP25 可通過多組分和多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，共同干預(yù)阿爾茲海默癥的進(jìn)程[26]。雖然這些研究都表明CP25 可能是一種潛在的治療阿爾茲海默癥的良藥，但還缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。通過上述研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂通過神經(jīng)、內(nèi)分泌、代謝和免疫影響AD 的進(jìn)展，而CP 25 具有明確的抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[14-23]，因此口服CP25 有可能通過改善腸道菌群紊亂造成的炎癥、神經(jīng)損傷和免疫異常而促進(jìn)AD的恢復(fù)。為了探索該問題，本研究通過APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠和A?1-42誘導(dǎo)的AD 小鼠兩種動(dòng)物模型，觀察口服CP25 對AD 小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)，及對阿爾茲海默癥的治療作用，為民族醫(yī)藥對AD 的治療提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究是北京藏醫(yī)院承擔(dān)的國家財(cái)政部專項(xiàng)撥款的十三五項(xiàng)目-心腦血管臨床和民族醫(yī)技醫(yī)法傳承及新藥研究的重要組成部分，AD 作為心腦血管疾病的一種老年慢性疾病，已經(jīng)嚴(yán)重影響國民的健康，在目前無有效治療藥物的困境下，二十五味珊瑚丸作為藏醫(yī)治療白脈病的一線藥物，而上述分析提示二十五味珊瑚丸可能具有干預(yù)AD 的潛能。為此，本研究采用兩種經(jīng)典的AD 模型小鼠探索二十五味珊瑚丸是否具有干預(yù)AD 的作用，同時(shí)研究腸道菌群在這個(gè)過程中可能的作用機(jī)制。以期通過該研究，為推進(jìn)CP25用于干預(yù)AD的臨床進(jìn)程提供數(shù)據(jù)支撐。。

2 材料與方法

2.1 材料

二十五味珊瑚丸（CP25）（金訶藏藥股份有限公司生產(chǎn)，每丸重0.25 g，每盒兩版，共24 丸，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z63020059，生產(chǎn)批號：01180510），Amyloid Beta-Peptide (1-42) (human) 蛋 白（Sigma，0.1mg,A9810），Rabbit-anti-beta Amyloid1-42（英國Abcam 公司，批號ab224025），羊抗兔IgG-TRITC（美國Jackson Immuno Research 公司，批號111-025-003），Morris 水迷宮（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，ZS-001 moriss）。

2.2 方法

2.2.1 AD動(dòng)物模型

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠（Mt）：60只雄性6月齡的APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司（生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2014-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：11401300093230）。雙轉(zhuǎn)基因APP/PS1 小鼠AD 小鼠可表達(dá)突變的人類早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉樣前蛋白（APPswe）融合體，雙轉(zhuǎn)基因APP/PS1小鼠這兩個(gè)基因的表達(dá)都由小鼠朊病毒蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)。人類早老素基因的DeltaE9 突變是該基因的第九個(gè)外顯子缺失產(chǎn)生的，此突變會(huì)導(dǎo)致早發(fā)性老年癡呆癥。試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4 組，每組15只。

A?1-42誘導(dǎo)AD 小鼠（Mi）：85 只雄性12 周齡的C57BL/6N 野生型正常小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：1100111911000703）。C57BL/6N 小鼠 由C.C.Little 對Miss Abby Lathrop 品 系交配繁育而成，維通利華從Charles River 引入第83 代核心群，對該品系進(jìn)行Cloneback，毛發(fā)為黑色（MHC單體型H2b,品系代碼213）。其中70只用于A?1-42誘導(dǎo)AD小鼠造模。方法：1 mg A?1-42蛋白先用20 μL DMSO充分溶解后，用PBS 稀釋10 倍，濃度為5 g·L-1，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4天，使其變?yōu)槟蹜B(tài)，用于誘導(dǎo)AD 小鼠模型。小鼠麻醉后，固定于腦立體定向儀，暴露Bregrna（前囟）點(diǎn)，以雙側(cè)海馬CA1 區(qū)為給藥點(diǎn)，在前囟后2.3 mm，矢狀縫兩側(cè)旁開1.8 mm 處，注射1 μL A?1-42溶液（濃度5 g·L-1）。進(jìn)針深度2.0 mm，速度1 mm·min-1，注射速度為0.2 μL·min-1，留針5 min。術(shù)后第8 天進(jìn)行行為學(xué)檢測，造模成功的A?1-42誘導(dǎo)AD 小鼠隨機(jī)分為4組，每組平均15只。另有15只C57BL/6J野生型正常小鼠作為空白對照組（Ctrl-B）。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心P2級動(dòng)物飼養(yǎng)室進(jìn)行，飼料和飲水均為清潔級。實(shí)驗(yàn)方法和操作符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過（倫理審批編號：IRM-DWLL-2019127）。

2.2.2 CP25給藥

CP25 在熱水中浸泡過夜，充分?jǐn)嚢柚粱鞈揖鶆?，配置成濃度?0 g·L-1的母液備用。兩種AD 模型小鼠（Mt 和Mi）都分為4 組，模型對照組和3 組不同劑量的CP25 給藥組。CP25 給藥劑量分別為每天100 mg·kg-1體重（分別為tCP25-100 和iCP25-100 組）、200 mg· kg-1體重（分別為tCP25-200 和iCP25-200 組）、400 mg· kg-1體重（分別為tCP25-400 和iCP25-400組），灌胃給藥，每天1 次，每周給藥5 天，間歇2 天，連續(xù)8周。對照組給予同樣體積的生理鹽水灌胃。

2.2.3 模型驗(yàn)證與行為學(xué)檢測

CP25 給藥前將Mt 和Mi 模型小鼠與正常小鼠各隨機(jī)抽取6 只進(jìn)行模型驗(yàn)證，采用Morris 水迷宮分別進(jìn)行定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)檢測AD 小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力等行為學(xué)表現(xiàn)。在定位航行前對AD 小鼠進(jìn)行3 天的訓(xùn)練，幫助小鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)停留120 s 以上。定位航行：在水迷宮4 個(gè)象限中的其中一個(gè)放入平臺(tái)，將小鼠從對面象限放入水中，采用數(shù)字追蹤系統(tǒng)記錄小鼠爬上平臺(tái)前的潛伏期、游泳速度和游泳軌跡，軟件分析搜索策略并計(jì)算評分。每天2次，連續(xù)記錄6天?？臻g探索：將平臺(tái)從水迷宮中拿走，小鼠從任意象限放入水中，記錄2 min 內(nèi)小鼠穿越平臺(tái)象限的次數(shù)、在平臺(tái)象限游泳的時(shí)間以及游泳軌跡。進(jìn)行模型驗(yàn)證的小鼠不再納入實(shí)驗(yàn)，避免因訓(xùn)練造成對后續(xù)效果測試的影響。以與對照組相比潛伏期有明顯差異（P＜0.05）為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。CP25 給藥8 周結(jié)束后采用同樣的方法進(jìn)行AD 小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力等行為學(xué)檢測。

2.2.4 病理檢測

水迷宮檢測結(jié)束后，小鼠在深度麻醉（按0.5 mL/100 g 劑量腹腔注射5%水合氯酸溶液）下，心腔灌注冷生理鹽水20 mL，10 min 內(nèi)取全腦和糞便組織等樣品。腦組織用于冷凍切片制備，快速取全腦，梯度蔗糖脫水，OCT 包埋，快速冷凍，沿冠狀面切片（厚度5 μm）備用。后者小心剝離海馬組織，-80℃保存?zhèn)溆?。采用制備的冷凍切片進(jìn)行A?1-42、免疫熒光染色以觀察AD 小鼠在給藥后淀粉樣斑塊的改善。Rabbit-antibeta Amyloid 1-42 稀釋比例為1:100，二抗羊抗兔IgGTRITC 稀釋比例為1:100,Ex/Em=550/570 nm。采用全自動(dòng)掃片系統(tǒng)（C13210-01，日本濱松光子學(xué)株式會(huì)社）獲取免疫熒光圖像，采用ImageJ 軟件對A? 斑塊數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.2.5 腸道菌群檢測

糞便組織取自結(jié)腸，小心分離結(jié)腸全段，一端切口，從另一端開始向下擠出糞便樣品，-80℃保存?zhèn)溆?。采?6S RNA 測序法進(jìn)行AD 小鼠腸道菌群多樣性檢測。冷凍保存的新鮮糞便采用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，每組5 個(gè)糞便樣品。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度。取適量的樣品到離心管中，在無菌水中稀釋至1 ng·μL-1，以稀釋后的基因組DNA 為模板，以16S V3-V4 區(qū)為測序區(qū)域，使用帶Barcode 的特異引物，引物343F(5’- tacggraggcagcg -3’) 和798R(5’- AGGGTATCTAATCCT-3’)，采 用Takara Ex Taq 高保真酶進(jìn)行PCR（Bio-rad,CA,USA）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，磁珠純化，并以此為模板進(jìn)行二輪PCR 擴(kuò)增。再次檢測純化，Qubit 定量。最后，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，并在Illumina-MiSeq（Cal.，USA）機(jī)上測序。使用Trimmomatic 軟件對原始雙端序列（FASTQ格式）進(jìn)行去雜。當(dāng)質(zhì)量低于20時(shí)，截獲前面高質(zhì)序列。生成優(yōu)質(zhì)序列后，使用Vsearch軟件根據(jù)序列的相似性將序列歸為為多個(gè)OTUs。序列相似度大于或等于97%被歸為1 個(gè)OTU 單元。使用QIIME 軟件包挑選出每個(gè)OTU 的代表性序列，將所有的代表性序列與Silva（version132）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋，保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結(jié)果。

2.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有計(jì)量均用xˉ±S表示，兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)，兩組以上比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Originlab2018被用于進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)改善與A?斑塊

我們采用水迷宮法檢測了兩種AD 小鼠（APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠Mt 和A?1-40 誘導(dǎo)的AD 小鼠Mi）在CP25 給藥后的行為學(xué)改變。定位航行實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的學(xué)習(xí)能力，如圖1A 所示，在連續(xù)6 天的定位航行實(shí)驗(yàn)中，兩種不同AD 模型小鼠—Ctrl-Mt 和Ctrl-Mi 的潛伏期（找到平臺(tái)所用時(shí)間）均較高于對照組Ctrl-B（P＜0.05），說明AD 小鼠的學(xué)習(xí)能力顯著低于正常小鼠。給予8 周的CP25 治療后，Mt 和Mi 小鼠的學(xué)習(xí)能力均得到明顯的提升。以第6天為例，Mt小鼠CP25給藥組中低劑量組（tCP25-100 and-200）的潛伏期恢復(fù)到正常小鼠水平（P＜0.05），高劑量組效果不明顯（P＞0.05）。而Mi 小鼠中，3 個(gè)劑量組均顯著改善，組間無顯著差異（P＞0.05）。同時(shí)我們還采用空間探索實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的記憶能力，Mi模型給藥組中行跡路線圖有明顯的平臺(tái)趨向性，如圖1B、表1所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果也表明CP25給藥可明顯改善Mi 小鼠的記憶能力，但對Mt 小鼠無顯著影響。

圖1 CP25給藥對兩種AD小鼠行為學(xué)和病理學(xué)的改變

表1 兩種模型小鼠空間探索能力（n=15）

Aβ 斑塊是AD 重要的病理表現(xiàn)之一。如圖1C 所示，對于基因型小鼠，與對照組相比，tCP25-200 組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的Aβ 斑塊無顯著差異（P＞0.05），說明CP25 給藥不能消除或減輕APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠即Mt 小鼠的Aβ 蛋白沉積。而對于誘導(dǎo)型AD 模型（Ctrl Mi），Aβ 斑塊密集分布于誘導(dǎo)給藥針頭位置，如圖1C 左下圖所示；CP25 給藥組（iCP25-200）未發(fā)現(xiàn)Aβ 斑塊，分析可能CP25 治療起作用，也可能是腦片未切到合適位置。

3.2 腸道菌群

本實(shí)驗(yàn)通過檢測CP25 口服給藥對腸道菌群多樣性的影響，嘗試解釋CP25 改善AD 小鼠行為學(xué)和病理學(xué)的效應(yīng)機(jī)制。為避免環(huán)境和飲食因素對腸道菌群的影響，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在同一飼養(yǎng)室進(jìn)行相同食水飼養(yǎng)。結(jié)果如圖2 所示，CP25 給藥對腸道菌群門類別上的豐度有明顯的影響。與正常小鼠相比（Ctrl B，圖2A），兩種AD模型小鼠腸道菌群在門類別上的豐度變化明顯不同（圖2C-J）?；蚰Ｐ停–trl Mt，圖2C 第一個(gè)餅圖）小鼠厚壁菌門豐度下降，而擬桿菌門豐度上升；誘導(dǎo)模型（Ctrl Mi，圖2G）正好相反，且變化幅度顯著。CP25給藥可糾正兩種AD模型腸道菌群在門類別豐度上的異常。對于基因模型（Ctrl Mt）小鼠，中高濃度給藥逆轉(zhuǎn)厚壁菌門和擬桿菌門的相對比例效果更加明顯（圖2 E-F））；對于誘導(dǎo)模型（Ctrl Mi），3 種濃度CP25 給藥都顯著逆轉(zhuǎn)了異常的厚壁菌門和擬桿菌門比例（圖2 H-J）。這些結(jié)果表明CP25 給藥對腸道菌群有顯著影響。一般認(rèn)為厚壁菌門多為有益菌，擬桿菌門多為有害菌。CP25 給藥能夠顯著提高基因型小鼠厚壁菌門和擬桿菌門比例，促進(jìn)有益菌增加，提示可能CP25可糾正腸道菌群的紊亂。

圖2 CP25給藥對腸道菌群在門類別上豐度的影響

采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)分析組間Alpha 多樣性指數(shù)差異是否顯著。以O(shè)bserve、Chao1、Shannon 和Simpson's 指數(shù)為例，組間差異分析的箱形圖如圖3A所示。對于基因模型小鼠，Observe、Chao1 指數(shù)顯示，其與對照組有明顯的差異，說明基因模型小鼠腸道菌群有明顯紊亂。CP25 給藥后，3 個(gè)濃度間，CP25-100與CP25-400 間差異最為顯著。而誘導(dǎo)模型小鼠與正常小鼠腸道菌群無明顯的改變，表明急性誘導(dǎo)AD 模型小鼠的腸道菌群沒有受到顯著影響，AD 患者的腸道菌群紊亂是一個(gè)長期的過程。然而，CP25-100給藥對這種模型小鼠的正常腸道菌群仍然有顯著的影響。

圖3 CP25給藥對于組間腸道菌群多樣性分析

為了進(jìn)行多樣本間的比較，本研究進(jìn)行了PCoA分析，即主坐標(biāo)分析，并基于Bray-Curtis 距離矩陣進(jìn)行PCoA 作圖，如圖3B 所示?；蚰Ｐ托∈笈c正常小鼠分為兩個(gè)明顯的分離的群，CP25-200 和CP25-400的群與正常小鼠重合，CP25-100位于基因模型小鼠與正常小鼠的群之間。表明CP25 給藥，特別是中高劑量給藥，能顯著地糾正基因模型小鼠的腸道菌群紊亂。而誘導(dǎo)模型小鼠和正常小鼠的群部分重疊，表明誘導(dǎo)模型小鼠的腸道菌群沒有受到明顯的影響，CP25給藥的3個(gè)劑量組的群與誘導(dǎo)模型小鼠和正常小鼠的群重疊，表明CP25給藥對正常菌群沒有負(fù)向影響。

使用R 軟件DESeq2 程序包，基于wald 檢驗(yàn)方法，進(jìn)行差異菌群篩選，并以屬類別P＜005的前10個(gè)細(xì)菌屬別進(jìn)行作圖，如圖4 所示。對于基因模型小鼠，CP25 給藥不同劑量分別對脫硫弧菌屬Desulfovibrio（上調(diào)）、乳桿菌屬Lactobacillus（下調(diào)）、普雷沃氏菌科PrevotellaceaeGa6A1_group（上調(diào)）、瘤胃梭菌屬Ruminiclostridium_9（下調(diào)）和不可培養(yǎng)擬桿菌屬uncultured_Bacteroidales_bacterium（下調(diào)）有糾正性調(diào)節(jié)，其中CP25-200 調(diào)節(jié)作用作為最為顯著，CP25-400次之，CP25-100 作用最弱。而對于誘導(dǎo)模型小鼠，CP25 給藥下調(diào)Acetatifactor和腸桿菌屬Enterorhabdus，上調(diào)醋香腸菌屬Acetitom aculum、梭菌ASF356、毛螺菌屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、脫鐵桿菌屬M(fèi)ucispirillum、毛螺旋菌屬Parasutterella、普雷沃菌屬Prevotella_1、普雷沃菌屬Prevotella_9、普雷沃氏菌科PrevotellaceaeGa6A1_group 等。 其 中 腸 桿 菌 屬Enterorhabdus為糾正性調(diào)節(jié)。在兩種模型鼠中，CP25給藥均對脫鐵桿菌屬M(fèi)ucispirillum有上調(diào)作用。

圖4 兩種不同AD模型中以屬為類別的前10差異菌群

4 討論

為了探索藏藥CP25 對阿爾茲海默癥患者腸道菌群的影響，本實(shí)驗(yàn)采用了兩種AD 小鼠模型，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠（Mt）和A?1-40 誘導(dǎo)的AD 小鼠（Mi）。Aβ1-40 誘導(dǎo)的AD 小鼠（Mi）是由海馬CA1 區(qū)直接注射Aβ1-40蛋白，短期內(nèi)形成的AD 模型。這種模型是由單一因素-beta 淀粉樣斑塊造成的，且成模時(shí)間短，不足以對腸道菌群形成逆向影響。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠（Mt）可表達(dá)突變的人類早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉樣前蛋白（APPswe）融合體[27]，6-7 月齡即可在小鼠腦內(nèi)形成Aβ 淀粉樣斑塊，如我們在實(shí)驗(yàn)中檢測到的一樣（圖1），Aβ 淀粉樣斑塊在小鼠海馬和皮層無規(guī)則散在分布。同時(shí)由于成模時(shí)間長，Mt小鼠的腸道菌群多樣性與正常小鼠呈現(xiàn)明顯的不同。本實(shí)驗(yàn)采用誘導(dǎo)性和基因型AD 小鼠模型來觀察CP25 給藥對腸道菌群的影響，對比分析腸道菌群在CP25 治療AD 過程中的影響，從兩個(gè)角度來驗(yàn)證CP25 對腸道菌群的改變與AD改善之間的關(guān)系。

通過對兩種模型小鼠進(jìn)行長達(dá)8 周的CP25 口服給藥，我們發(fā)現(xiàn)CP25 能有效改善Mt 和Mi 小鼠的學(xué)習(xí)能力，但對A?斑塊無明顯的清除作用，提示A?蛋白的清除不是CP25的直接靶點(diǎn)。目前臨床上尚無針對A?蛋白的藥物面市，但是處于研發(fā)階段的作用于A? 蛋白的藥物很多，主要分為三類：抑制Aβ 蛋白合成（如verubecestat[28]、lanabecestat[29]和E-2609[30]等）、抑制A?蛋 白 聚 集（ 如 PBT2[31]）、抗 Aβ 抗 體（ 如Bapineuzumab[32]）。其中抑制A? 蛋白聚集主要應(yīng)用金白的聚集[33]。CP25 含有多種礦物質(zhì)，我們預(yù)期CP25可能會(huì)通過金屬螯合劑清除A? 蛋白，然而結(jié)果顯示并不能有效清除Aβ 淀粉斑塊，分析其原因可能是CP25 中的礦物質(zhì)不能有效通過血腦屏障達(dá)到病變部位屬合劑干擾Aβ 與金屬離子的相互作用，從而減少毒性Aβ 蛋白的聚集[33]。CP25 含有多種礦物質(zhì)，我們CP25可能會(huì)通過金屬螯合劑清除Aβ蛋白，然而Aβ淀粉斑塊，分析其原因CP25 中的礦物質(zhì)不能有效通過血腦屏障達(dá)到病變部位。

我們在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)對分析出的CP2535 個(gè)入血成分采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析法進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了針對AD可能有78個(gè)潛在靶點(diǎn)，對應(yīng)的生物學(xué)功能主要有3類，包括Aβ 淀粉樣斑塊的清除、炎癥與免疫、凋亡與自噬[26]。通過Mt和Mi模型小鼠行為學(xué)和病理學(xué)結(jié)果，我們推測CP25 的入血成分很少能通過血腦屏障進(jìn)入腦區(qū)，腸腦軸可能是其作用路徑。

CP25為口服給藥，胃腸道是其藥物吸收的第一道屏障。腸道菌群通過多種途徑參與AD 的發(fā)生和發(fā)展，被認(rèn)為是AD 治療的新靶點(diǎn)[34]。CP25 具有活血化瘀、消炎止痛的作用，對于炎癥有正向調(diào)節(jié)作用，AD患者腸道菌群失調(diào)也和炎癥密切相關(guān)。在長期CP25給藥過程中，腸道菌群是否受到有益調(diào)節(jié)是值得關(guān)注的問題。研究表明，AD 患者的腸道菌群多樣性明顯下降，厚壁菌門和雙歧桿菌屬豐度降低，擬桿菌門豐度升高[35]。Cattaneo 等則發(fā)現(xiàn)，腸道促炎性大腸埃希菌/志賀氏菌豐度增加，抗炎分類菌群豐度明顯減少[36]。值得注意的是，幽門螺桿菌可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗炎癥因子IL-10加重AD 的病理過程[37]。1項(xiàng)針對美國成人的回顧性隊(duì)列研究也證實(shí)男性幽門螺桿菌血清陽性與AD 死亡率呈正相關(guān)[38]。有效的藥物治療應(yīng)糾正腸道菌群的這種異常。我們的研究發(fā)現(xiàn)CP25 給藥對這些菌群有糾正性調(diào)節(jié)，Mt模型小鼠中脫乳桿菌屬和不可培養(yǎng)擬桿菌屬等擬桿菌門明顯下降。而在誘導(dǎo)模型中，由于AD 小鼠和正常小鼠的腸道菌群無明顯組間差異，CP25給藥造成的腸道菌群上調(diào)或下調(diào)則主要由藥物成分決定。比如CP25 可明顯上調(diào)梭菌ASF356、毛 螺 菌 屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、脫鐵桿菌屬M(fèi)ucispirillum、毛螺旋菌屬Parasutterella、普雷沃菌屬Prevotella_1、普雷沃菌屬Prevotella_9、普雷沃氏菌科PrevotellaceaeGa6A1_group 等菌群，我們認(rèn)為CP25 藥物成分中有類似益生元的組分。值得一提的是，在兩種模型中，CP25 均顯著上調(diào)Mucispirillum，但該菌屬在AD 模型屬中的豐度并無明顯差異。CP25 對Mucispirillum的調(diào)節(jié)作用是否有利于AD 改善尚需要進(jìn)一步研究。有研究表明Mucispirillum schaedleri幫助宿主抵御鼠傷寒沙門氏菌（S.Tm）引 發(fā) 的 腸 道 炎 癥[39]。 同 時(shí) 本 文 發(fā) 現(xiàn)uncultured_Bacterodales_bacterium在AD 小鼠中的豐度明 顯 高 于 正 常 小 鼠 ，ruminococcus-1 和Ruminiclostridium-9 的豐度低于正常小鼠，這些結(jié)果與Zhang等對AD小鼠腸道菌群的研究一致[40]，CP25治療可糾正這種由AD 疾病導(dǎo)致的腸道菌群的異常升高。這些結(jié)果提示腸道菌群Muribaculum的調(diào)節(jié)是CP25治療AD的途徑之一。目前的研究認(rèn)為腸道菌群通過腦腸軸、分內(nèi)泌、代謝和免疫等多種途徑影響AD的發(fā)生和發(fā)展[34]。CP25 對AD 小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)可能通過復(fù)雜的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)來改善AD 的認(rèn)知功能和病理表現(xiàn)，比如抑菌、消炎、提高免疫等，這些都有賴于進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，通過對兩種AD 模型小鼠的比較研究，我們發(fā)現(xiàn)CP25 口服給藥可正向調(diào)節(jié)腸道菌群，提示腸道菌群可能是CP25 的潛在作用靶點(diǎn)。本文結(jié)論將對CP25 用于阿爾茲海默癥這種多病因的疾病的治療提供理論依據(jù)和機(jī)理支持，為阿爾茲海默癥的治療提供另外一種干預(yù)手段。