開心散與生脈散抗阿爾茨海默癥“同病異治”作用機制網絡藥理學分析與中樞神經免疫調控效用驗證＊

樓倩穎，曹 程，王青青，魏翀琦，佘雨巖，孟雪兒，鄭嘉妮，陸韞青，朱梓強，朱 悅

（南京中醫(yī)藥大學藥學院/江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210029）

1 引言

阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD），是老年人群高發(fā)疾病，又稱老年癡呆癥，臨床早期最顯著的癥狀為以記憶力受損的記憶障礙、掌握運用新知識與社交能力下降等認知障礙、并伴隨有抑郁、情感淡漠或焦躁不安、注意力渙散等精神障礙。AD 發(fā)病機制極為復雜，現(xiàn)今獲FDA 批準上市的AD 藥物主要為膽堿酯酶抑制劑與NMDA 受體阻斷劑，靶點單一且副作用大。而近20 年來，全球已有146 個AD 藥物在研發(fā)中遭遇失敗，成功率僅僅2.7%，新藥研發(fā)遭遇瓶頸。而中藥以其多成分、多途徑、多靶點的優(yōu)勢，可為AD 藥物研發(fā)提供全新治療思路和研究價值[1-2]。

中醫(yī)與神志有關的疾病多從“心”論治。AD 病位在腦，也與五臟之首的心密切相關。老年人日漸年老體衰，心氣渙散，心陰不濟，神無所依，是中醫(yī)認為AD的重要病機?！巴‘愔巍迸c“同病異治”是中醫(yī)辨證論治的精髓與特色。“同病異治”指即使是同一病癥，也會因人、因時、因地等實際情況采取不同的治療措施。而開心散與生脈散均為中醫(yī)臨床辨證論治AD 的高頻使用方劑[3]。開心散始載于唐代孫思邈《備急千金要方》，由人參、遠志、石菖蒲、茯苓組成，功能補益心氣、祛痰開竅[4]。生脈散源于張元素《醫(yī)學啟源》，由人參、麥冬、五味子組成，功能滋養(yǎng)心陰、益氣生津。臨床常用來治療心血管疾病，近年來生脈散在防治神經精神系統(tǒng)疾病方面的研究也不斷增多[5]。從方劑組成與功效不難發(fā)現(xiàn)，開心散偏補心氣而生脈散偏補心陰，開心散攻補兼施而生脈散偏于滋補濡潤[6]，充分體現(xiàn)了“同病異治”的特點，但是其現(xiàn)代科學內涵尚未得到闡釋。

網絡藥理學將中藥有效成分和靶點進行網絡化聯(lián)結與分析，預測藥物治療疾病潛在靶點及通路從而認識藥物作用機制，為闡釋中藥復方“同病異治”的科學內涵提供了有效途徑。

因此，我們參考《網絡藥理學評價方法指南》中網絡藥理學評價的主要策略[7]，擬通過網絡藥理學初步闡釋兩張方劑“同病異治”的現(xiàn)代科學內涵。同時結合整體動物與離體細胞實驗對所揭示的生物學機制進行驗證，為中藥復方抗AD“同病異治”的作用機制提供更多的現(xiàn)代科學依據(jù)，為臨床應用與相關產品開發(fā)提供更多的科學支持[8]。

2 研究思路與方法

通過構建開心散與生脈散復方成分潛在靶點網絡圖，尋找其抗AD 共性及優(yōu)勢調控靶點與通路，分析靶點與調控網絡的異同。同時，通過構建Aβ 海馬區(qū)注射誘導小鼠癡呆模型和LPS 誘導Bv2小膠質細胞炎性激活模型，從整體動物與離體細胞兩個方面驗證網絡藥理學分析結果，闡釋開心散與生脈散調控中樞神經炎癥抗AD“同病異治”的效用機制與內涵，如流程圖所示（圖1）。

圖1 研究流程圖

3 研究與分析

3.1 實驗藥材

五加科植物人參（Panax ginsengC.A.Mey.）干燥根和根莖、遠志科植物遠志（PolygalatenuifoliaWild.）干燥根、天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）干燥根莖、多孔菌科真菌茯苓（Poriacocos（Schw.）Wolf）的 干 燥 菌 核、百 合 科 植 物 麥 冬（Ophiopogon japonicus（L.f）Ker Gael）干燥塊根、木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）干燥成熟果實。上述藥材飲片均購自蘇州天靈中藥飲片公司，經我校嚴輝副教授鑒定。

3.2 實驗細胞及試劑

小鼠小膠質BV2 細胞購自ATCC。MEM EAGLE培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素/支原酶抑制劑（P/S/N）等培養(yǎng)試劑購自以色列Biological Industries公司，細胞培養(yǎng)相關耗材購自美國Corning 公司。Aβ1-42（20JW09891）購自上海諾優(yōu)生物科技有限公司。石杉堿甲（H107336）購自北京伊諾凱科技有限公司。TRIzol RNA（15596-026）購自美國Thermo Fisher 公司。逆轉錄試劑盒（AE311）和SYBR熒光定量qPCR檢測試劑盒（AQ132）購自北京全式金生物科技有限公司。小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（JEB-12474）、小鼠白介素6（IL-6）ELISA 試劑盒（JEB-12267）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（JEB-12787）購自南京金益柏生物科技有限公司。

3.3 實驗動物

ICR 小鼠，雄性，六月齡，體質量22-25 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級屏障設施中，常規(guī)飼養(yǎng)（12 h光照，溫度22-25℃，濕度40%-70%）。本實驗已獲得NJUCM 動物實驗倫理委員會的批準，許可證號：CSXK（滬）2017-0005。

3.4 實驗儀器

小鼠腦立體定位儀。Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)、Y 迷宮測試動物行為分析系統(tǒng)（Any -maze，USA）。實時定量PCR 儀（ABI 7500，USA）。超微量紫外分光光度計（DENOVIX DS-11，USA）。

3.5 實驗方法

3.5.1 化學成分的收集及篩選

通 過 TCMSP （https://tcmspw.com/） 、TCM database@Taiwan（http://tcm.cmu.edu.tw/）、TCMID（http://5th.tcmspw.com/tcmsp.php）、Chemistry Database（https://www.organchem.csdb.cn）等數(shù)據(jù)庫，結合文獻收集復方中單味中藥主要化學成分及相應CAS 號，通過化學結構數(shù)據(jù)庫Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載SDF 結構，上傳到SwissADME（http://www.swissadme.ch/）數(shù)據(jù)庫中篩選出滿足以下條件的活性成分：①胃腸道吸收GI 值high，藥物相似性五個指標中滿足兩個及以上YES[9]；②在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中“相關疾病”涉及“AD”。③文獻挖掘與AD 相關的中藥活性成分[10]。

3.5.2 活性成分潛在靶點預測

上傳活性成分SDF 結構至小分子靶點預測數(shù)據(jù)庫SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）[11]，限定物種為人源（Homo sapiens），選擇高可信度的蛋白作為靶點（Probability*＞0.65，不滿足該條件，則選取排名前15 的靶點）。去重后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）矯正得到靶點標準蛋白名稱和基因名稱，最終得到方劑潛在靶點信息[12]。

3.5.3 復方-中藥-成分-靶點網絡構建

歸納分組預測所得靶點信息，通過Cytoscape 3.6.0 軟件（http://www.cytoscape.org/），去除游離靶點，并通過Cytoscape3.2.0 進行拓撲學分析，計算所有節(jié)點Degree 中位值，篩選各類度值高于二倍中位值的節(jié)點，構建復方-中藥-成分-靶點關鍵網絡。其中節(jié)點（node）代表復方、中藥、成分、靶點，邊（edge）表示中藥-成分-疾病-靶點之間的相互聯(lián)系，節(jié)點大小和顏色深淺反映度值大小[13]。

3.5.4 抗阿爾茨海默癥靶點的篩選

通 過TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Gencards（http://www.genecards.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）等數(shù)據(jù)庫搜索獲取AD 相關疾病靶點，與開心散、生脈散復方篩選得到的靶點進行對比分析，歸納總結兩個復方中抗AD 潛在共性及優(yōu)勢調控靶點，利用VENNY 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es）在線繪制韋恩圖。

3.5.5 抗阿爾茨海默癥靶點互作網絡構建以及拓撲分析

通過STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫對上述靶點進行蛋白互作（PPI）分析[14]，限定物種為人源，選取交互分數(shù)高于0.9 的蛋白質互作關系數(shù)據(jù)，并通過Cytoscape3.2.0 進行拓撲學分析，計算所有節(jié)點Degree中位值，篩選節(jié)點度高于中位值的靶點，構建蛋白互作網。

3.5.6 KEGG通路富集分析和GO功能富集分析

利用Metascape（https://metascape.org/）對兩個復方抗AD 潛在共性及優(yōu)勢調控靶點進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析和GO（Gene ontology）功能富集分析，限定物種為人源，Pathway 選 擇 KEGG pathway、GO-BP（Biological Processes）進行富集分析[15-16]。

3.5.7 藥物制備

開心散提取物（KXS）的制備：按比例稱取人參、遠志、石菖蒲、茯苓藥材（3:2:2:3）共100 g，先后加8倍、六倍量的純水浸泡1 h，回流提取2 h，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至約1 mL藥液中含有1 g生藥的浸膏[17]。

生脈散提取物（SMS）的制備：按比例稱取人參、麥冬、五味子藥材（五分：五分：七粒）共100 g，先后加入10 倍、6 倍、四倍量體積的純水，浸泡1 h，回流提取1 h，過濾，最后合并三次過濾液，減壓濃縮同上[18]。

3.5.8 細胞培養(yǎng)

小鼠BV2 小膠質細胞用含有1% PSN、1%丙酮酸鈉、10%胎牛血清的MEM EAGLE 培養(yǎng)基，每48 h換液1 次。待細胞密度為70%即可傳代，培養(yǎng)三代穩(wěn)定后的細胞用于后續(xù)細胞實驗。

3.5.9 qPCR檢測炎癥因子表達水平

取BV2 細胞樣品，TransZol Up 提取RNA，逆轉錄試劑盒制備cDNA樣品，依照SYBR熒光實時定量試劑盒所列步驟，利用實時熒光定量PCR 儀測定各組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 基因轉錄水平表達，以GAPDH 為內參，計算各組相對于空白組的基因表達百分值。實驗中所用引物序列見表1。

表1 引物序列

3.5.10 Aβ海馬注射擬AD小鼠模型建立及給藥

將Aβ1-42溶于滅菌PBS 中，配置成1μg/μL 溶液，37℃恒溫孵育一周。選取健康雄性SPF 級ICR 小鼠，適應性飼養(yǎng)一周后隨機分組共8 組，每組8 只，分別是空白組、假手術組、模型組、KXS-L 組、KXS-H 組、SMS-L 組、SMS-H 組、石杉堿甲組。除空白組、假手術組外，小鼠異氟烷吸入麻醉，進行右側側腦室定位注射Aβ1-42（A：-2 mm；L：2 mm；H：-3 mm），以1 μL/1 min速度每只注射5 μL Aβ1-42，留針30s后緩慢撤針。假手術組以同樣方式注射等量生理鹽水。手術后小鼠常規(guī)飼養(yǎng)2 周給藥，空白組、假手術組、模型組小鼠每日灌胃生理鹽水（0.9% NaCl），陽性藥組給予石杉堿甲（0.05 mg/kg/天），KXS-L 組給予開心散提取物（3 g/kg/天），KXS-H組給予開心散提取物（10 g/kg/天），SMS-L組給予生脈散提取物（3 g/kg/天），SMS-H 組給予生脈散提取物（10 g/kg/天）。

3.5.11 行為學檢測

給藥7 d 后進行Morris 水迷宮實驗（Morris water maze，MWM），以評價小鼠空間學習記憶能力，水迷宮具體方法參照課題組已發(fā)表的研究文章進行[19]。MWM 結束后24 h后開始Y 迷宮實驗（Y maze），Y 迷宮由三個相鄰夾角為120°的相同臂（1：新臂，2：起始臂，3：其他臂）組成，各臂靠近中央處可裝置隔板。第一階段，隔開新臂，小鼠從起始臂進入，自由探索起始臂和其他臂，時間設置為5 min。1 h后測試階段，移走隔板，從同一位置進入自由探索三個臂，時間設置為3 min。記錄小鼠進入新臂的次數(shù)和停留時間。

3.5.12 ELISA檢測

行為學測試結束后，解剖獲得小鼠海馬組織，液氮速凍，用PBS制備勻漿。利用ELISA試劑盒，按照所列步驟，檢測海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNFα的水平。

3.5.13 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）分析，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05 表示有顯著差異，以P＜0.01 表示有極顯著差異。

3.6 結果

3.6.1 活性成分及潛在靶點的篩選與分析

通過TCMSP 等數(shù)據(jù)庫收載的藥材成分，并結合文獻進行成分復核，篩選獲得化學成分并獲得下列潛在靶點：開心散活性成分234 個，預測靶點614 個（去重）；生脈散活性成分215 個，預測靶點603 個（去重），兩方共有成分有109 個，共有靶點490 個。其中，屬于人參的活性成分有98 個，靶點425 個；非人參共有成分11 個，非人參共有靶點65 個。開心散優(yōu)勢活性成分136 個，優(yōu)勢靶點124 個；生脈散優(yōu)勢活性成分117個，優(yōu)勢靶點113 個（表2），繪制韋恩圖（圖2）。通過Cytoscape 3.6.0 拓撲學分析,篩選各類節(jié)點度值高于二倍中位值的關鍵節(jié)點，構建出的復方-中藥-成分-靶點關鍵網絡中包含256 個節(jié)點，2399 條相互作用關系（圖3）[20-21]。

圖2 開心散與生脈散活性成分靶點交集韋恩圖

圖3 復方-中藥-成分-靶點關鍵網絡

3.6.2 抗阿爾茨海默癥靶點的篩選分析

通過TTD、Gencards、Drugbank 等數(shù)據(jù)庫搜索獲取AD 的相關疾病靶點，與開心散、生脈散復方篩選得到的靶點進行對比分析獲得，開心散抗AD 潛在靶點467個，生脈散抗AD 潛在靶點465 個。兩方抗AD 潛在共性調控靶點375 個，開心散抗AD 潛在優(yōu)勢調控靶點92 個，生脈散抗AD 潛在優(yōu)勢調控靶點90 個，繪制韋恩圖（圖4）[22]。

圖4 開心散與生脈散抗AD靶點交集韋恩圖

3.6.3 抗阿爾茨海默癥靶點PPI網絡構建與分析

通過STRING 數(shù)據(jù)庫對上述滿足交互分數(shù)高于0.9 的靶點進行PPI 分析。按條件篩選關鍵節(jié)點進行作網絡圖。得到結果如下：

開心散與生脈散復方抗AD 潛在共性調控靶點PPI 網絡圖，包含305 個節(jié)點、1762 條相互作用關系，度值＞26（中位值）的關鍵節(jié)點有41 個（圖5、表3）。其中，度值最高的APP 能與64 個靶點發(fā)生相互作用（圖5A）[23]。

圖5 開心散與生脈散抗AD潛在共性及優(yōu)勢調控靶點的相互作用網絡

表3 開心散與生脈散抗AD潛在共性調控靶點（排列前10）

開心散抗AD潛在優(yōu)勢調控靶點PPI網絡圖，包含56 個節(jié)點、91 條相互作用關系，度值＞3（中位值）的關鍵節(jié)點有19 個（圖5、表4）。其中度值最高的PIK3R1能與15 個靶點發(fā)生相互作用（圖5B）。

表4 開心散抗AD潛在優(yōu)勢調控靶點（排列前10）

生脈散抗AD潛在優(yōu)勢調控靶點PPI網絡圖，包含50 個節(jié)點、62 條相互作用關系，度值＞2（中位值）的關鍵節(jié)點有24 個（表5）。其中，度值最高的SRC 能與7個靶點發(fā)生相互作用（圖5C）。

表5 生脈散抗AD潛在優(yōu)勢調控靶點（排列前10）

3.6.4 復方抗AD 潛在共性調控靶點KEGG 通路富集分析與GO功能富集分析

利用Matescape 數(shù)據(jù)庫對兩方抗AD 潛在共性調控靶點進行KEGG 通路富集分析和GO 功能富集分析，根據(jù)FDR 值，各篩選出排名前20 的信號通路。兩方抗AD 潛在共性調控靶點的KEGG 通路見圖6A。GO 富集分析顯示，生物進程（BP）涉及條目主要包含突觸信號傳導、神經遞質調控等（圖6B）。

圖6 開心散與生脈散抗AD潛在共性調控靶點富集分析

3.6.5 復方抗AD 潛在優(yōu)勢調控靶點KEGG 通路富集分析和GO功能富集分析

利用Matescape 數(shù)據(jù)庫對開心散與生脈散抗AD潛在優(yōu)勢調控靶點進行KEGG 富集分析和GO 功能富集分析。開心散抗AD 潛在優(yōu)勢調控靶點KEGG 通路主要涉及神經活性配體-受體相互作用、NF-κB 信號通路等（圖7A）。GO 富集分析顯示，生物進程（BP）涉及信號轉導、細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)等（圖7B）。

圖7 開心散抗AD潛在優(yōu)勢調控靶點富集分析

生脈散抗AD 潛在優(yōu)勢調控靶點KEGG 通路主要涉及鈣信號通路、神經活性配體-受體相互作用等（圖8A）。GO富集分析顯示，生物進程（BP）涉及條目主要包含鈣離子調控穩(wěn)態(tài)、化學突觸傳遞等（圖8B）。

圖8 生脈散抗AD潛在優(yōu)勢調控靶點富集分析

3.6.6 開心散與生脈散中樞神經炎癥調控效用驗證

基于網絡藥理學分析結果顯示，NF-κB 信號通路是開心散抗AD 的重要信號通路，趨化因子（Chemokine）信號通路是生脈散抗AD 的重要信號通路，均提示中樞神經免疫調控是開心散與生脈散抗AD 的重要機制。為驗證該效用，我們采用Aβ 海馬區(qū)注射擬AD 小鼠整體動物模型與小膠質細胞BV2 離體細胞模型對該效應進行驗證。

在整體動物模型上，模型組小鼠較空白組潛伏期、上臺前路程均有顯著增加（P＜0.01）而站臺穿越次數(shù)顯著減少（P＜0.01）（圖9A），對新臂的探索次數(shù)和探索時間均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）（圖9B），提示海馬區(qū)注射Aβ 誘導小鼠產生學習與記憶能力障礙，開心散與生脈散提取物均能提高小鼠學習和空間記憶能力。

圖9 開心散與生脈散對Aβ海馬區(qū)注射小鼠學習與記憶能力的影響（n=8）

Aβ 沉積會激活小膠質細胞誘發(fā)中樞神經免疫反應，表現(xiàn)為炎性細胞因子的大量表達。采用ELISA 方法檢測小鼠血清中炎性因子的水平。如圖10所示，模型組小鼠海馬組織炎性因子表達水平較空白組顯著上升（P＜0.05），開心散與生脈散提取物均能顯著逆轉炎性因子表達上升。

圖10 開心散與生脈散對Aβ海馬區(qū)注射小鼠海馬組織炎性因子水平表達的影響（n=8）

基于小膠質細胞是中樞神經免疫炎性反應最重要的效應細胞之一，構建LPS 刺激誘導BV2 細胞炎癥損傷模型，給以復方提取物，利用qPCR 方法檢測BV2細胞中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表達水平進行驗證分析。結果如圖11 所示，1 μg·mL-1LPS能夠顯著刺激BV2 細胞表達炎性因子（P＜0.01），開心散與生脈散均可顯著逆轉上升趨勢，以開心散提取物高劑量作用趨勢最強。

圖11 開心散與生脈散對LPS誘導損傷下BV2細胞炎性因子表達的影響

4 討論

AD 發(fā)病機制復雜，涉及Aβ 的級聯(lián)反應、tau 異常磷酸化、乙酰膽堿丟失、突觸功能失調、慢性炎癥、基因突變等。研究發(fā)現(xiàn)，開心散可顯著改善APP/PS1 模型小鼠學習和記憶能力，逆轉模型小鼠AchE 活性升高，對抗Aβ 誘導的神經元損傷，并具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎等作用[24]。臨床研究亦證實開心散是有效的治療AD 的方劑。林丹霞等人觀察口服開心聯(lián)合鹽酸多奈哌齊治療AD 實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)用效果顯著高于單一西藥治療；陳艷懂等人察發(fā)現(xiàn)調神益智針聯(lián)合開心散療法具有顯著改善認知功能的作用[25]。生脈散在防治神經精神系統(tǒng)疾病也具有良好療效，邱秉新等人臨床統(tǒng)計限制生脈散治療14 例老年性癡呆和17 例多發(fā)性梗塞性癡呆總有效率達74.2%[26]。實驗研究也證實其具有抗應激損傷、降脂、改善腦功能等作用[27-28]。因此，我們采用網絡藥理學研究方法，將這兩張已經臨床與實驗研究有效的抗AD 治療方劑中成分和靶點進行網絡化的聯(lián)結與分析，建立開心散與生脈散復方-有效成分-靶點網絡圖，分析兩個復方抗AD 潛在共性及優(yōu)勢調控靶點互作關系和潛在靶點作用通路，探索開心散與生脈散抗AD 的共性與個性調控機制，有利于闡明其對AD“同病異治”科學內涵。

分析發(fā)現(xiàn)，開心散與生脈散共有抗AD 靶點中很大部分來自與它們的共有藥味-人參，涉及細胞的信號傳導、存活與凋亡、炎癥反應、應激適應等。其核心靶點APP 異常水解形成的Aβ 沉積是AD 最大的病理特征之一。研究發(fā)現(xiàn)開心散能夠下調快速老化癡呆SAMP8小鼠腦內β-APP表達；生脈散能夠改善三氯化鋁聯(lián)合D-半乳糖制備AD 模型大鼠認知障礙，抑制Aβ 毒性保護神經元；人參中多種皂苷成分能夠顯著改善AD 患者中樞神經癥狀，可以增加α-分泌酶和sAPPα的表達，同時降低β-分泌酶和Aβ的表達，人參皂苷Rg1、Rb1、Rd、Re 等具有提高學習記憶能力等作用[29]。除APP 外，網絡藥理學預測分析的PIK3CA、AKT1參與的PI3K-AKT信號通路顯著影響細胞增殖、分化、凋亡。開心散能夠上調三氯化鋁聯(lián)合D-半乳糖制備AD模型小鼠PI3K、p-AKT蛋白表達，改善腦組織病理損傷，促進AD 腦內源神經再生[30]；生脈散中的五味子素也可轉錄STAT3 信號，激活PI3K-AKT 信號通路減輕小膠質細胞所致的炎癥損傷。共性調控靶點富集分析結果涉及AGE-RAGE 信號通路、AMPK 通路、tau 蛋白結合、氧化還原酶活性等作用機制。韓麗君等報道開心散含藥血清能夠降低模型小鼠AGEs 含量，抑制AGE 與RAGE 的結合，具有延緩衰老的作用[31]；石菖蒲所含的揮發(fā)油、茯苓所含的三萜酸等成分能調節(jié)氧化還原酶活性起到抗氧化的作用，增加SOD的活力等；生脈散能夠激活AMPK 信號通路改善線粒體脂質代謝紊亂和形態(tài)損傷，五味子中的五味子酚等活性成分能提高機體抗氧化能力，增加腦組織內SOD活力，抑制CAT 性，對抗機體氧化應激損傷[32-33]。上述報道均顯示，網絡藥理學的預測結果與實驗報道一致，因此該方法是探討復方功效物質基礎與作用機制的有效方法。

研究表明，AD 病人腦實質中小膠質細胞過度活化轉變成M1 型，趨化因子CXCL1、CXCL9、CXCL10 等表達上調，參與促炎反應，CX3CL1 則能抑制Tau 蛋白病變，具有神經信號傳導和神經保護作用。炎性細胞因子和趨化因子的水平升高，共同形成神經慢性炎癥反應，是AD 的重要病理機制[34,35]。本研究發(fā)現(xiàn)開心散抗AD 潛在核心靶點與調控網絡與中樞神經炎癥調控密切相關，例如RelA 是NF-κB家族的重要成員，TNF、CXCL8、CXCR2 等靶點均與炎癥的調節(jié)和細胞防御應答等密切相關。KEGG 通路富集分析結果也顯示NFκB 通路這一中樞神經免疫炎性反應的核心通路。曲蘇晨等人發(fā)現(xiàn)開心散能夠抑制NF-κB 入核和NF-κB磷酸化等環(huán)節(jié)發(fā)揮抗炎作用，顯著下調IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達水平，抑制炎癥反應[36,37]。生脈散亦可降低IL-6，TNF-α 表達，減輕炎癥反應及增強機體免疫力，通過應激活化蛋白激酶途徑減少自噬體形成[38]。生脈散的調控通路中也涉及趨化因子信號通路。本研究中驗證實驗結果也顯示，開心散與生脈散能夠有效改善Aβ 海馬區(qū)注射小鼠海馬區(qū)和小膠質細胞炎性因子表達，支持了中樞神經免疫調控是開心散與生脈散抗AD 共性的調控通路與生物學事件的網絡藥理學預測結果。

網絡藥理學為研究中藥復方的物質基礎與作用機制提供了有力的手段，但也存在顯而易見的局限性。例如，僅僅依據(jù)復方成分展開網絡化的靶點連結與機制的深入分析，忽視了活性成分在復方中含量，無法體現(xiàn)量效關系。同時，數(shù)據(jù)庫之間的算法差異也會干擾預測。因此，實驗驗證是保障網絡藥理學研究可靠性的重要手段。本研究中，我們采用整體動物與離體細胞實驗結合，對網絡預測的中樞神經炎癥調控環(huán)節(jié)加以驗證，發(fā)現(xiàn)開心散與生脈散確實具有改善Aβ 注入誘導癡呆模型小鼠的認知功能障礙，下調小鼠體內的炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α 水平，起到抗炎的作用，并在LPS 誘導炎癥細胞模型上也得到了抗炎效果的驗證。并且，從驗證性實驗中炎性因子的調控程度分析，開心散表現(xiàn)出較生脈散較強的作用趨勢，這也與網絡藥理學分析中炎性調控靶點與通路為開心散優(yōu)勢調控靶點與通路的分析結果一致。通過網絡藥理學，我們發(fā)現(xiàn)，開心散與生脈散因其有共同的組成藥味而有共性的抗AD 調控靶點與通路，也因配伍藥味的不同而擁有獨特的調控靶點。同時兩方雖然有各自優(yōu)勢靶點，但也可能歸結到相同的通路發(fā)揮調控作用，這可能是開心散與生脈散“同病異治”抗AD 的科學內涵。在今后的研究工作中，我們將繼續(xù)對兩張復方抗AD 的優(yōu)勢調控靶點與通路進行驗證與研究，更好闡釋“同病異治”這一中醫(yī)辨證論治方法的科學內涵，同時為開心散與生脈散的基礎研究與產品開發(fā)提供更多的現(xiàn)代科學證據(jù)。

5 結論

本研究通過網絡藥理學網絡化聯(lián)結與分析方法，構建了抗AD 常用中藥復方開心散與生脈散成分-靶點調控網絡圖，發(fā)現(xiàn)中樞神經炎癥調控是開心散與生脈散復方抗AD 的重要生物學機制。整體動物與離體細胞實驗也證實，開心散與生脈散復方能顯著降低小鼠海馬以及炎癥損傷Bv2細胞模型中的炎癥因子表達水平，改善AD 模型小鼠認知功能障礙，驗證了網絡藥理學的發(fā)現(xiàn)。研究結果有利于闡釋開心散與生脈散復方“同病異治”抗AD 的科學內涵和作用機制，也為開心散與生脈散抗AD 產品的開發(fā)提供了科學證據(jù)與思路拓展。