琥珀調控頸總動脈結扎腦缺血大鼠海馬區(qū)神經元凋亡改善大鼠學習與記憶能力的效用部位與作用機制研究＊

魏翀琦，曹 程，劉夢秋，曲蘇晨，樓倩穎，段金廒，尚爾鑫，朱 悅

（南京中醫(yī)藥大學藥學院/江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協同創(chuàng)新中心 南京 210023）

琥珀是距今3 億年前的中生代白堊紀至距今0.2億年前的新生代第三紀的松柏科和豆科植物的樹脂經過復雜的地質作用在地殼表層所形成的有機礦物[1-2]，是重鎮(zhèn)安神的代表性中藥材，其入藥的最早記載見于南朝宋陶弘景所著《名醫(yī)別錄》。明李時珍《本草綱目》描述琥珀功效為“安五臟、定魂魄、消淤血、通五淋、壯心明目、止痛安神、破血生肌”[3]?！吨腥A本草》將琥珀功效總結為“鎮(zhèn)驚安神；散瘀止血；利水通淋；去翳明目”[4]?，F代琥珀常用于治療驚風癲癇、心神不寧、癡呆、失眠多夢、月經停閉、小便澀痛、瘀血等病。但是長久以來，琥珀的現代研究主要集中于寶石學領域，側重于理化性質研究與真?zhèn)舞b別探討居多，而對其鎮(zhèn)驚安神與活血化瘀的作用機制等報道偏少。這種現象直接導致了琥珀在被《中華人民共和國藥典》1963 版與1977 版收載后，便絕跡于之后歷版中國藥典。雖然各省市的中藥材地方標準仍有收載，僅有簡單的外觀描述，也無質量控制方法，不僅嚴重制約了琥珀的現代中醫(yī)臨床應用，還為現今藥典中含有琥珀藥材成方制劑的質控指標的進一步提升與臨床安全用藥埋下了隱患。

血管性癡呆（Vascular dementia, VD）是以腦血管疾病導致腦神經損傷為基礎的認知功能損害疾患?；颊叱Ｓ谀X血管疾病后出現記憶、認知和執(zhí)行功能下降等臨床表現，是繼阿爾茨海默病后發(fā)病率位列第二的癡呆癥[5-6]?；颊吣X部缺血時，腦內缺氧缺血會導致神經元凋亡，進而影響認知功能。琥珀是中醫(yī)臨床用治健忘的常用中藥材，清代沈金鰲內科名著《雜病源流犀燭》將其用于治療“痰迷心竅，言語如癡而多忘”[7]，而其“活血散瘀”的功效應對VD 更可謂合拍對癥。因此我們構建頸總動脈結扎腦缺血大鼠模型與糖氧剝奪神經元細胞模型，研究琥珀調控神經元細胞凋亡抗血管性癡呆的效用部位和作用機制，闡釋琥珀藥材“安神”與“散瘀”的傳統功效，為其臨床應用提供更多的現代科學依據。

本研究整體框架流程如圖1所示。

圖1 研究流程圖

1 材料

1.1 動物

SD 大鼠（雄性，280-300 g），購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2017-0005。動物常規(guī)飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心，SPF 級環(huán)境，12 h光照，溫度為22-25℃，濕度為40%-70%。

1.2 藥物

琥珀藥材飲片購自陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司（批號：20180101），藥材產地為廣西壯族自治區(qū)，經南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定為合格藥材。

1.3 試劑

TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（A112-01）購自Vazyme Biotech 公司。實驗所用抗體MAP2 Rabbit mAb（4542S）、Caspase 3 Rabbit mAb（9662S），Cleaved-Caspase 3 Rabbit mAb（9664S），Caspase 9 Rabbit mAb（9508S），Cleaved-Caspase 9 Rabbit mAb（7237S），Anti-rabbit IgG，Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody（BA1054,BA1050）購自Boster Biological Technology 公司?？贵wBcl-2 Mouse mAb（sc-7382）、Bax Mouse mAb（sc-7480）購自Santa Cruz Biotechnology 公司?？贵wβ-actin Rabbit mAb（bs0061R）購自北京博奧森生物技術有限公司。ECL 化學發(fā)光液購自上海天能公司。DMEM 培養(yǎng)基（4.5g·L-1D-Glucose，10-013-CVRC）購自Corning 公司。特級胎牛血清（04-001-1ACS）、胰酶（0.25%，03-046-5B）和青鏈霉素/制真菌素三抗（03-032-1B）購自Biological Industries 公司。PBS 緩沖液（MBL601A）購自南京邁博生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)相關耗材均購自Corning 與BIOSHARP 公司。其余試劑如未特殊標明均購自Sigma-Aldrich公司。

1.4 儀器

實驗動物行為測試與分析系統（上海吉量軟件科技有限公司）；生物安全柜（Thermo Fisher Scientific 公司）；恒溫細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific 公司）；凝膠成像系統儀（伯樂生命醫(yī)學產品公司）；多功能酶標儀（Perkin-Elmer 公司）；微孔板恒溫振蕩器（Thermo Fisher Scientific 公司）；AXIO Vert.A1 熒光倒置顯微鏡（Zeiss公司）。

2 方法

2.1 琥珀系列溶劑提取部位的制備

將琥珀藥材粉碎后，稱取50g，并采用10倍量石油醚溶劑每次8h，回流提取2 次，過濾后合并2 次濾液。向濾渣中加入10倍量乙酸乙酯溶劑，操作同上。如上所述依次制備正丁醇與70%乙醇提取部位。將以上各提取液減壓濃縮并將殘余有機試劑揮發(fā)干凈得到琥珀不同溶劑提取部位。使用前，按需復溶。按照圖2樣品制備流程圖制備琥珀各溶劑提取部位。

圖2 琥珀提取部位制備流程圖

2.2 血管性癡呆模型建立

所有大鼠適應環(huán)境一周后，參考文獻通過結扎大鼠頸總動脈建立VD模型[8]。隨機選擇8只大鼠作為假手術組動物，接受同樣手術操作，而不結扎頸總動脈。手術后采用Morris 水迷宮測試判斷模型是否建立成功。

2.3 動物給藥

待動物恢復2 周后，將80 只造模成功大鼠隨機分為10 組，具體分組與給藥如表1 所示，琥珀系列溶劑提取物給藥劑量均按照得率折算成相應生藥量。灌胃給藥周期為14天。

表1 動物實驗給藥劑量

2.4 行為學檢測

采用Morris水迷宮對大鼠的學習與記憶能力進行測評。于寬120 cm的圓柱形水池中放置一高60 cm跳臺。向水池中注入自來水并調整水溫至25℃，水中放入墨汁，以動物不能看到跳臺為宜。跳臺放入第IV象限，大鼠從第II 象限面朝水缸壁入水，若大鼠在120 s規(guī)定時間內不能尋找到平臺，則引導大鼠到平臺，站立30 s。大鼠每日訓練一次，每次按順時針方向訓練一個象限，連續(xù)訓練4 天。于第5 天開始進行行為學測試：第一次測試時，保留水下跳臺，將大鼠從第Ⅲ象限面朝缸壁放入水中，測試60 s，攝像機記錄大鼠的潛伏期和上臺前路程；第6天進行第二次測試，撤走水下跳臺，大鼠從第Ⅳ象限面朝缸壁放入水中，自由游泳探索60 s，攝像機記錄大鼠的跳臺穿越次數和跳臺所在象限停留時間。所有的行為數據通過ANY-maze軟件進行分析。

2.5 TUNEL染色法檢測海馬區(qū)細胞凋亡

行為學檢測結束后，解剖大鼠獲得全腦組織固定于4%PFA 固定液中，脫水處理后進行石蠟包埋切片。腦組織切片再進行二甲苯脫蠟處理，乙醇梯度脫水，加入不含DNase 的20 μg·mL-1蛋白酶K，室溫下孵育20 min。用50 μL TdT緩沖液處理切片，避光室溫下孵育1 h，然后用DAPI試劑進行細胞核染色，再用熒光封片劑進行封片處理。在熒光倒置顯微鏡下攝片，并運用ZEN軟件進行圖象處理與分析。

2.6 細胞培養(yǎng)與體外模型建立

小鼠海馬永生化細胞系（HT22）購自賽業(yè)生物科技有限公司。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。培養(yǎng)基組成包括DMEM（高糖，4.5 mg·L-1），10%胎牛血清和1%青鏈霉素/制真菌素三抗（PSN）。細胞每48h 進行換液，待融合密度為70%-80%即可進行傳代操作，傳3代穩(wěn)定后的細胞用于后續(xù)實驗。根據文獻[9-10]，將培養(yǎng)基更換為不含葡萄糖的DMEM，并將細胞在充滿95% (v/v)N2和5%(v/v)CO2的小型厭氧室中培養(yǎng)以建立體外糖氧剝奪模型。

2.7 MTT法

細胞給藥6 h 后，棄去原培養(yǎng)基并加入MTT 溶液（每孔終濃度為0.5 mg·mL-1），37℃培養(yǎng)箱中避光孵育。3 h 后棄去MTT 溶液并加入150 μL DMSO 溶液，37℃避光振蕩器上孵育30 min。采用多功能酶標儀在570 nm下檢測吸光度。

2.8 免疫蛋白印跡法

取解剖所得大鼠海馬組織或細胞末次給藥后，采用RIPA 蛋白裂解液提取細胞總蛋白，98℃高溫加熱15 min 使蛋白變性。按照免疫蛋白印跡法實驗步驟，首先制備10%聚丙烯酰胺凝膠，上樣5 μg 總蛋白后，90V 電泳2 h，300mA 轉膜2 h，5%BSA 封閉2 h 后加入一 抗（MAP2 Rabbit mAb、Caspase 3 Rabbit mAb、Cleaved-Caspase 3 Rabbit mAb、Caspase 9 Rabbit mAb、Cleaved-Caspase 9 Rabbit mAb、Bcl-2 Mouse mAb、Bax Mouse mAb、β-actin Rabbit mAb），抗體比例為1:2000，4℃過夜孵育，取出后常溫放置45 min，再加入二抗（Anti-rabbit IgG, Anti-mouse IgG， HRP-linked Antibody），比例為1:10000，置搖床上室溫孵育1 h 后以ECL 試劑盒顯色，采用凝膠成像系統（Bio-Rad）進行數據處理。

2.9 統計學分析與數據表示

采用SPSS 16.0軟件進行統計與分析，組間比較先采用T-test，后采用One-way ANOVA，數據以P＜0.05表示有顯著差異，以P＜0.01表示有極顯著差異。

3 結果

3.1 琥珀系列溶劑提取部位改善頸總動脈結扎腦缺血大鼠學習與記憶能力的效用評價

大鼠給以琥珀各溶劑提取部位14天后，進行定位航行實驗和空間探索實驗。結果表明，與假手術組相比，模型組潛伏期和上臺前路程顯著增加（P＜0.01），跳臺穿越次數和跳臺所在象限停留時間顯著降低（P＜0.01）；給藥組與模型組相比，琥珀各提取部位均有下調模型動物潛伏期和上臺前路程，并上調其跳臺穿越次數和跳臺所在象限停留時間的作用（P＜0.05）。其中乙酸乙酯提取部位與其他部位進行顯著性檢驗，發(fā)現乙酸乙酯提取部位效用最強，顯著降低模型動物潛伏期時間（P＜0.01），其高劑量組顯著增加模型動物跳臺穿越次數（P＜0.05），作用趨勢與陽性藥石杉堿甲相當（圖3）。

3.2 琥珀乙酸乙酯提取部位對頸總動脈結扎腦缺血大鼠大鼠海馬區(qū)細胞凋亡的影響

選取行為學測試中效應趨勢最強的乙酸乙酯提取部位組動物，分離并獲取受試動物全腦，利用TUNEL 染色技術標記凋亡細胞。實驗結果表明，模型組與假手術組相比，凋亡細胞數量顯著增加（凋亡細胞呈綠色熒光）。給以琥珀乙酸乙酯提取部位后，凋亡細胞顯著減少，提示琥珀給藥可以通過抑制細胞凋亡保護海馬區(qū)細胞（圖4）。

圖4 琥珀乙酸乙酯提取部位對大鼠海馬區(qū)細胞凋亡的影響（n=3）

3.3 琥珀乙酸乙酯提取部位對頸總動脈結扎腦缺血大鼠海馬區(qū)神經元細胞標記物的影響

利用免疫蛋白印跡法檢測海馬中神經元細胞生物標記物MAP2 的表達。實驗結果表明，模型動物海馬區(qū)MAP2的表達水平較假手術組顯著下調。與模型組相比，琥珀乙酸乙酯提取部位顯著上調模型動物海馬區(qū)的MAP2 的表達（P＜0.01），提示琥珀給藥對頸總動脈結扎致血管性癡呆大鼠海馬區(qū)神經元有保護作用（圖5）。

圖5 琥珀乙酸乙酯提取部位對大鼠海馬區(qū)神經元細胞的影響（n=3）

3.4 琥珀乙酸乙酯提取部位對頸總動脈結扎腦缺血大鼠海馬凋亡蛋白表達的影響

分離受試大鼠海馬組織，采用免疫蛋白印跡法檢測海馬中凋亡相關蛋白Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Caspase 9、Cleaved-Caspase 9 和Bcl-2/Bax 的相對表達水平。實驗結果表明，模型動物海馬區(qū)Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Caspase 9 和Cleaved-Caspase 9 的表達水平較假手術組顯著上調，而Bcl-2/Bax 較假手術組顯著下調（P＜0.05）。與模型組相比，琥珀乙酸乙酯提取部位顯著下調模型動物海馬區(qū)中Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Caspase 9 和Cleaved-Caspase 9 的表達，同時上調了Bcl-2/Bax 的表達（P＜0.05）（圖6）。上述實驗結果提示琥珀乙酸乙酯提取部位給藥可抑制頸總動脈結扎致腦缺血大鼠海馬區(qū)細胞凋亡（圖6）。

圖6 琥珀乙酸乙酯提取部位對頸總動脈結扎腦缺血大鼠海馬區(qū)凋亡蛋白表達的影響（n=3）

3.5 琥珀乙酸乙酯提取部位對OGD 損傷HT22 細胞的影響

為了進一步評價琥珀乙酸乙酯提取部位抗海馬區(qū)神經元凋亡效用，采用小鼠海馬神經元HT22 細胞株于無糖無氧條件下建立了OGD 損傷模型。在無氧環(huán)境下，采用無糖培養(yǎng)基與琥珀乙酸乙酯提取部位同時作用HT22 細胞6h。采用MTT 法檢測模型的存活率。實驗結果發(fā)現，與OGD 組相比，琥珀乙酸乙酯提取部位能提高HT22 細胞的存活率，對抗OGD 對于HT22細胞的損傷（P＜0.05），以琥珀乙酸乙酯提取部位高 濃 度（10 μg·mL-1）的 細 胞 保 護 作 用 趨 勢 最 強（圖7A）。

依據上述實驗結果，我們進一步對HT22 細胞給以琥珀乙酸乙酯提取部位后細胞凋亡信號通路相關蛋白表達情況進行評價。實驗結果顯示，OGD 模型組細胞Caspase 3、Caspase 9 的表達水平較空白組顯著上調，而Bcl-2/Bax 較空白組顯著下調，提示OGD 損傷促進細胞凋亡表達。而琥珀乙酸乙酯提取部位顯著逆轉上述表達趨勢，表現在下調細胞中Caspase 3 和Caspase 9 的表達，同時上調了Bcl-2/Bax 的表達（與OGD 組相比，P＜0.05）（圖7B 和圖7C）。上述實驗結果提示琥珀乙酸乙酯提取部位可抑制糖氧剝奪導致的海馬細胞凋亡。

圖7 琥珀乙酸乙酯提取部位對OGD損傷HT22細胞的影響

4 討論

為了闡釋琥珀“安神”與“散瘀”的傳統功效與改善學習記憶能力抗血管性癡呆的功效物質基礎，我們分別制備了琥珀的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇與70%乙醇提取部位，同時構建了常用于模擬VD 的大鼠頸總動脈結扎腦缺血動物模型，以評價提取部位作用趨勢。研究發(fā)現，頸總動脈結扎腦缺血大鼠海馬區(qū)發(fā)生了顯著的細胞凋亡，表現為Caspase 3 和Caspase 9 及相關cleave 活化狀態(tài)凋亡通路蛋白及表達上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下調[11-13]。同時發(fā)現海馬區(qū)神經元生物標志物微管相關蛋白2（MAP2）表達的顯著下調，提示海馬區(qū)有神經元凋亡情況發(fā)生。琥珀的四個提取部位均可有效改善模型動物學習與記憶能力，其中以乙酸乙酯部位效用最優(yōu)。該部位可以顯著抑制大鼠海馬區(qū)細胞凋亡，上調大鼠海馬內微管相關蛋白2（MAP2）表達，同時下調Caspase 3 和Caspase 9 及相關cleave 活化狀態(tài)凋亡蛋白的表達，上調Bcl-2/Bax 的表達。在OGD 損傷小鼠海馬神經元體外細胞模型中也發(fā)現，琥珀乙酸乙酯提取部位給藥能顯著提高HT22 細胞的存活率并呈劑量相關性。與空白組相比，OGD 模型組細胞Caspase 3、Caspase 9 的表達水平顯著上調，Bcl-2/Bax 顯著下調，提示OGD 損傷后HT22 細胞中確有凋亡過程發(fā)生。而琥珀乙酸乙酯提取部位給藥后通過下調細胞中Caspase 3 和Caspase 9的表達，上調Bcl-2/Bax 的表達，抑制凋亡繼而發(fā)揮細胞保護效果。這些研究結果提示，琥珀乙酸乙酯提取部位可能是其發(fā)揮“安神”與“散瘀”傳統功效與抗VD的功效物質基礎。

目前VD 是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默癥位列第二的癡呆癥。但是用于VD 治療的多為阿爾茨海默癥的治療藥物如多奈哌齊、加蘭他敏和卡巴拉汀等乙酰膽堿酯酶抑制劑和谷氨酸NMDA 受體拮抗劑美金剛、以及鈣拮抗劑尼莫地平與丁苯酞、腦活素等，缺乏專屬性[14-16]。臨床研究發(fā)現VD 患者腦部缺血缺氧時，中腦動脈供血腦區(qū)如皮質、海馬和紋狀體等部位會產生大量自由基、興奮性氨基酸，導致細胞內鈣超載，引起神經元凋亡進而導致神經元壞死是VD 重要的病理機制[17-19]。而本研究發(fā)現，琥珀的乙酸乙酯提取部位可以顯著抑制缺血缺氧導致的海馬區(qū)神經元凋亡，顯著改善模型動物的學習與記憶能力。琥珀是具有重鎮(zhèn)安神功效的代表性中藥材，中醫(yī)臨床常將其用于治療神志不安與血瘀證[20]，而其“安神”與“活血散瘀”的功效特點，更符合血管性癡呆的中醫(yī)藥治療。因此，本研究對于琥珀“安神”與“散瘀”的傳統功效的現代研究及對功效物質基礎的探索，對于VD 的中醫(yī)藥治療與相應的醫(yī)藥產品具有重要的意義。

以往針對琥珀“鎮(zhèn)驚安神”功效作用機制的研究主要集中于癲癇的研究。琥珀對中樞神經有一定的抑制作用，且與戊巴比妥鈉有協同作用[21]。本課題組前期研究亦發(fā)現，琥珀可明顯延長戊四氮致急性癲癇模型模型小鼠的癲癇潛伏期，縮短癲癇持續(xù)時間，降低模型小鼠的癲癇等級，其中乙酸乙酯部位為效用最強的部位[22]。在我們本次的血管性癡呆動物模型上，該部位亦表現出最強的增強模型動物學習記憶能力的效用。有關琥珀鎮(zhèn)驚安神效用成分研究中，琥珀酸的神經活性研究報道相對較多，其具有鎮(zhèn)靜與降低體溫的作用，對驚厥幼鼠小腦浦肯野細胞的電生理功能具有明顯保護作用[23]，可調節(jié)神經調質繼而影響突觸后興奮性活動[24]。但是我們研究發(fā)現，不同產地琥珀中琥珀酸含量差異較大，在本實驗中采用的琥珀藥材經過前期質譜鑒定亦僅含有微量琥珀酸。此外，從日本久慈琥珀（Kuji Amber）中分離得到的kujiol A 和kujigamberol B 被證明是Ca2+信號轉導抑制劑[25-26]。而Ca2+作為重要的第二信使，在癲癇等神經退行性疾病的病理生理過程中起著重要作用[27]。琥珀揮發(fā)油中的氧化石竹烯也具有良好的鎮(zhèn)靜作用[28]。從這些報道可以初步認為，琥珀鎮(zhèn)驚安神的效用可能是其多成分協同作用的結果。

本研究結合血管性癡呆動物與細胞模型，首次對琥珀藥材“安神”與“散瘀”的傳統功效進行了綜合闡釋，并對其改善血管性癡呆的作用機制與功效物質基礎進行了探討。在今后的研究中，我們將進一步采用活性跟蹤分離等手段，揭示琥珀乙酸乙酯提取部位中所含成分，進一步闡明物質基礎，以期為這一寶貴礦物藥材的臨床應用提供更多的現代科學依據，為資源易于枯竭的化石類中藥的可持續(xù)利用開發(fā)提供方法學借鑒，并助力于相關產品的現代開發(fā)與應用。