麋角丸改善Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的作用機(jī)制研究＊

孟雪兒，樓倩穎，曹 程，王青青，佘雨巖，白加德，丁玉華，段金廒，朱 悅＊＊，趙 明＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210029；2.北京麋鹿生態(tài)實(shí)驗(yàn)中心 北京 100076；3.江蘇大豐麋鹿國家級(jí)自然保護(hù)區(qū) 大豐 224136）

阿爾茨海默癥（Alzheimer 's disease, AD）是老齡化社會(huì)備受關(guān)注的神經(jīng)退行性疾病，以認(rèn)知功能的進(jìn)行性下降和神經(jīng)元的不可逆損失為重要特征[1]。隨著全球老齡化人口急劇增加，中國的人口老齡化率和老年人口數(shù)量居世界第一。根據(jù)《2018 年世界老年癡呆癥報(bào)告》顯示，全球約有5000萬人患有癡呆癥，預(yù)計(jì)到2050 年，這一數(shù)字將增加兩倍，達(dá)到1.52 億人，而阿爾茨海默病(AD)占所有癡呆癥病例的50-75%[2]。中國AD 的患病率較高，然而就診率、診斷率和治療率普遍較低，預(yù)計(jì)未來30年中國的AD患者數(shù)量將顯著增加，給社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

AD 患者大腦最主要的病理學(xué)特征是β 淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成老年斑和tau蛋白異常磷酸化為主要成分的神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）[3]。目前認(rèn)為AD 的病理機(jī)制與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡高度相關(guān)。氧化應(yīng)激反應(yīng)中的自由基可促進(jìn)產(chǎn)生Aβ 聚集，小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活和大量釋放的促炎細(xì)胞因子均會(huì)產(chǎn)生顯著的神經(jīng)元毒性，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[4]。臨床上治療AD 的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑，但此類藥物會(huì)導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)等副作用，前者還禁用于心功能不全患者，從使其臨床應(yīng)用受到了一定的限制。

到目前為止，全球還沒有藥物可以有效的延緩AD的進(jìn)展，而中醫(yī)藥對AD的防治有著豐富經(jīng)驗(yàn)。AD在中醫(yī)上屬于“好忘”“癡呆”“呆病”等范疇，并認(rèn)為髓?？仗摚铚p腦消為癡呆的根本病機(jī)[5]。中藥復(fù)方麋角丸出自唐代孫思邈《備急千金要方》[6]，由麋鹿角、秦艽、人參、甘草、肉蓯蓉、檳榔、通草、菟絲子組成，是補(bǔ)腎名方，原書描述其具有“補(bǔ)心神、安臟腑、填骨髓”之功效。根據(jù)中醫(yī)學(xué)“腎通髓?！钡膫鹘y(tǒng)理論及其麋鹿角“補(bǔ)心神”的傳統(tǒng)功效，本研究建立海馬區(qū)注射Aβ1-42擬阿爾茨海默癥小鼠模型，評(píng)價(jià)中藥復(fù)方麋角丸對模型動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用與二次開發(fā)提供更多的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)，并為AD 的防治提供更多的可能性。本研究的詳細(xì)流程圖如圖1。

圖1 研究流程圖

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF 級(jí)ICR 小鼠，雄性，體質(zhì)量20-23 g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場，動(dòng)物申請?jiān)S可證號(hào)為：SCXK（滬）2018-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 環(huán)境中，常規(guī)飼養(yǎng)，溫度22-25℃，濕度40%-70%。本實(shí)驗(yàn)獲得NJUCM 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

麋鹿角Elaphurus davidianusMillne-Edwards 采集于江蘇大豐濕地公園6 歲齡麋鹿，秦艽（Gentiana macrophyllaPall.，批號(hào)：201205）、人參（Panax ginsengC.A.Mey.，批號(hào)：190615）、甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.，批號(hào)：200128）、肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma.，批號(hào)：190808）、檳榔（Areca catechuL.，批號(hào)：210118）、木通（Akebia tri foliata（Thunb.）Koidz.，批號(hào)：201116）、酒菟絲子（Cuscuta chinensisLam.，批號(hào)：202022）采購于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室劉圣金教授鑒定為合格藥材。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Aβ1-42（20JW09891）合成多肽購自上海諾優(yōu)生物科技有限公司；石杉?jí)A甲（H107336）購自北京伊諾凱科技有限公司；雙色預(yù)染蛋白Marker 購自南京麥高德生物科技有限公司；10、12.5%凝膠試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；RIPA 裂解液購自碧云天公司；BCA 試劑盒（P0009）購自南京何苗生物技術(shù)有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（JEB-12474-1）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（JEB-12787-1）、小鼠白介素6（IL-6）ELISA 試劑盒（JEB-12267-1）均購自南京金益柏生物技術(shù)有限公司；小鼠超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（A001-3-2）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（A020-202）、丙二醛（MDA）試劑盒（A003-4-1）均購自南京建成生物公司研究所；通用型抗體稀釋液，購自南京迅貝生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液，購自上海天能科技有限公司；Nrf2 Rabbit mAb（12721T）、Caspase-9 Mouse mAb（9508S），均購自CST 公司；HO-1 Rabbit antibody（10701-1-lg）、Caspase-3 Rabbit antibody（66470-2-lg）、β -actin Mouse antibody（66009-1-lg）均購自proteintech 公司；Bax（F2816）、Bcl-2（G2915）抗 體，購 自Santa Cruz Biotechnology 公司；二抗HRP-Linked Anti-Mouse IgG（BA1050），HRP-Linked Anti-Rabbit IgG（BA1054），購自BOSTER公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)（美國BECKMAN 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI 公司）；動(dòng)物行為測試系統(tǒng)（上海吉量軟件公司）；全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈業(yè)信發(fā)展有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國PE Enspire 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；AXIOVert.A1熒光倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）。

2 方法

2.1 麋角丸提取物的制備

取麋鹿角切割，搗碎，打粉，稱取34 g 麋鹿角粉，加8 倍水提取8 h，回流提取三次，過濾，合并濾液。稱取秦艽、人參、肉蓯蓉、檳榔、木通、酒菟絲子各31.25 g，提取時(shí)間2 h，加8 倍80%醇回流提取2 h，提取兩次，收集濾液，與麋鹿角水提液合并濾液，減壓濃縮至麋角丸提取物濃縮液濃度為1 g·mL-1（按生藥量折算）。

2.2 AD動(dòng)物模型建立及給藥

健康ICR 小鼠90 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為6組，每組15只。分為空白組、假手術(shù)組、模型組、陽性藥組、麋角丸低劑量組、麋角丸高劑量組。取小鼠稱重，1%戊巴比妥鈉腹腔注射小鼠（40 mg·kg-1），麻醉后剃除頭頂局部毛發(fā)，進(jìn)行海馬區(qū)注射Aβ1-42擬AD 小鼠模型手術(shù)，手術(shù)的具體方法參考文獻(xiàn)[7]。小鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，傷口基本愈合后進(jìn)行灌胃給藥，動(dòng)物的分組和給藥情況見表1。除上述分組給藥外，另取健康ICR小鼠30 只，隨機(jī)分為3 組，分別為空白組、麋角丸低劑量組、麋角丸高劑量組，適應(yīng)環(huán)境后灌胃麋角丸低、高劑量10天后進(jìn)行正常小鼠自發(fā)活動(dòng)的評(píng)估。

表1 動(dòng)物分組和給藥劑量

2.3 行為學(xué)測試

2.3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

小鼠灌胃10 天后進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris water maze，MWM），評(píng)價(jià)小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。水迷宮具體方法參照課題組已發(fā)表的研究文章進(jìn)行[8]。

2.3.2 曠場實(shí)驗(yàn)

小鼠灌胃10 天后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)（open field test，OPT），評(píng)價(jià)麋角丸對正常小鼠自主活動(dòng)的影響。曠場實(shí)驗(yàn)的敞箱裝置為長寬40 cm，高25 cm 的塑料箱，箱的四周底部均為黑色。正式實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將小鼠由邊緣放入敞箱內(nèi)，通過動(dòng)物行為測試系統(tǒng)記錄小鼠在曠場5 min 內(nèi)的運(yùn)動(dòng)總路程和探索曠場中心停留的時(shí)間。每只小鼠測試完之后用75%乙醇擦拭敞箱，防止遺留的氣味對下一只小鼠的影響，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持外部環(huán)境安靜[9]。

2.4 海馬區(qū)腦片尼氏體染色

小鼠行為學(xué)測試后解剖，斷頭，取出大腦，置于4%的多聚甲醛中固定。梯度乙醇脫水，二甲苯脫蠟，將固定的腦組織常規(guī)處理石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），尼氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元損傷情況，200倍鏡下拍照。

2.5 炎癥因子含量測定

行為學(xué)測試結(jié)束后，處死小鼠，解剖獲得海馬組織。稱取相應(yīng)質(zhì)量的組織，加入10 倍量的PBS，低溫研磨，離心20 min（2000 轉(zhuǎn)/分），取上清液待測。按照ELISA 試劑盒所列步驟，測定小鼠海馬中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

2.6 氧化應(yīng)激因子SOD、LDH、MDA測定

行為學(xué)測試結(jié)束后，處死小鼠，解剖獲得海馬組織。稱取相應(yīng)質(zhì)量的組織，加入10 倍量的PBS，低溫研磨，制成10%的組織勻漿。離心10 min（3000 轉(zhuǎn)/分），取上清待測，按南京生物建成試劑盒說明書測定SOD和LDH的活力以及MDA的含量。

2.7 Nrf2、HO-1及凋亡蛋白表達(dá)測定

每組稱取海馬組織，記錄重量，加入10 倍量的RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑cocktail（50:1），研磨后置于冰上裂解30 min，離心10 min 取上清。按照BCA試劑盒的操作步驟測定總蛋白含量，98℃加熱15 min，使蛋白變性。用上海雅酶公司的10%和12.5%的蛋白凝膠試劑盒制備凝膠，120V 電泳2 h，Nrf2 轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2 h，Caspase-9、β-Actin 轉(zhuǎn)膜時(shí)間為1h，Caspase-3、HO-1、Bax、Bcl-2 轉(zhuǎn)膜時(shí)間為50 min，5%脫脂牛奶封閉2 h。結(jié)束后加入一抗（Nrf2 Rabbit mAb、HO-1 Rabbit antibody、Caspase-3 Rabbit antibody、Caspase-9 Mouse mAb、Bax antibody、Bcl-2 antibody，抗體比例均為1:2000；β-Actin Mouse antibody，抗體比 例為1:10000），4℃搖床過夜，二抗孵育（Anti-Mouse IgG，Anti-Rabbit IgG，HRP-linked Antibody，抗體比 例1:10000），室溫孵育1h，洗膜后使用凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），單因素方差分析處理前數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)分布檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以P＜0.05 為有差異，P＜0.01有極顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 麋角丸對小鼠行為學(xué)的影響

3.1.1 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠學(xué)習(xí)與記憶行為的影響

Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠給藥10 天后，進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測試。結(jié)果顯示，與空白組小鼠比較，模型組小鼠潛伏期和上臺(tái)前路程顯著增加（P＜0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.01）。與模型組相比，麋角丸組小鼠潛伏期和上臺(tái)前路程明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多（P＜0.05）（圖2）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麋角丸可明顯改善Aβ 誘導(dǎo)小鼠受損的學(xué)習(xí)和記憶能力，高劑量組作用趨勢優(yōu)于低劑量組。

圖2 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠水迷宮行為學(xué)的影響（n=11）

3.1.2 麋角丸對正常小鼠自發(fā)活動(dòng)影響

正常小鼠給藥10天后，進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)測試。結(jié)果顯示，與空白組小鼠比較，麋角丸高低劑量組小鼠在5 min 內(nèi)的總運(yùn)動(dòng)距離和曠場中心停留時(shí)間無顯著性差異（圖3）。結(jié)果表明，麋角丸對正常小鼠的自發(fā)活動(dòng)無明顯影響。

圖3 麋角丸對正常小鼠自發(fā)活動(dòng)影響（n=10）

3.2 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠海馬DG 區(qū)腦片尼氏體染色的影響

對小鼠海馬區(qū)腦片尼氏體染色發(fā)現(xiàn)，空白組海馬DG 區(qū)細(xì)胞內(nèi)尼氏體豐富，排列整齊緊密；而模型組小鼠海馬齒狀回區(qū)尼氏體減少，排列紊亂，細(xì)胞空泡化明顯（P＜0.01）；與模型組相比，給藥麋角丸組中，尼氏體數(shù)量增多，排列趨于整齊，細(xì)胞空泡化不明顯（P＜0.05，P＜0.01）（圖4）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麋角丸對模型小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。

圖4 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠海馬區(qū)腦片DG區(qū)尼氏體染色的影響（×200）（n=3）

3.3 麋角丸提取物對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠海馬組織炎癥因子表達(dá)水平的影響

ELISA 檢測小鼠海馬組織炎癥因子表達(dá)水平結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬中的TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量較空白組相比明顯上調(diào)（P＜0.01），給予麋角丸提取物后，能明顯下調(diào)模型組小鼠海馬中炎癥因子的表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。麋角丸高劑量顯示出較強(qiáng)的作用趨勢。

圖5 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠海馬組織炎癥因子表達(dá)水平的影響（n=8）

3.4 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠海馬組織氧化應(yīng)激因子的影響

小鼠海馬組織氧化應(yīng)激因子表達(dá)檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠海馬組織中SOD 活性顯著降低（P＜0.01），LDH 活性和MDA 含量顯著提高（P＜0.01）。與模型組相比，麋角丸高、低劑量組均可提高小鼠海馬中SOD 的含量（P＜0.01），降低小鼠海馬組織中LDH 活性和MDA 的含量（P＜0.01）（圖6）。因此，麋角丸提取物可減輕模型小鼠神經(jīng)元的氧化損傷。

圖6 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠海馬組織氧化應(yīng)激因子表達(dá)的影響（n=5）

3.5 麋角丸對Aβ1-42 海馬區(qū)注射小鼠海馬區(qū)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blotting 評(píng)價(jià)小鼠海馬區(qū)Nrf2 與HO-1 蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠海馬組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01），經(jīng)過高低劑量的麋角丸作用后，小鼠海馬中的Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01）（圖7）。提示麋角丸提取物可能通過Nrf2/HO-1 通路發(fā)揮抗氧化作用保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受損傷。

圖7 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠海馬組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平的影響（n=5）

3.6 麋角丸對Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠海馬組織凋亡通路蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blotting 法測試小鼠海馬組織凋亡通路蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組小鼠海馬Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。高、低劑量麋角丸不僅可以逆轉(zhuǎn)小鼠海馬中Bcl-2/Bax 蛋白的表達(dá)水平，而且可以顯著降低模型組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01）（圖8）。這些結(jié)果表明，麋角丸提取物可減少模型小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡。

圖8 麋角丸對Aβ 海馬區(qū)注射小鼠海馬組織凋亡通路蛋白表達(dá)水平的影響（n=4）

4 討論

AD的病理特征包括Aβ過度積累、tau蛋白過度磷酸化及氧化應(yīng)激與中樞炎癥等[10]。一般認(rèn)為，Aβ 沉積和清除不平衡是引起AD 的源頭，進(jìn)而誘發(fā)記憶喪失和認(rèn)知受損。Aβ 過度沉積會(huì)加快AD 患者體內(nèi)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[11]。因此Aβ是AD發(fā)生與發(fā)展中的關(guān)鍵致病因素。

研究表明，AD 患者大腦都存在著海馬神經(jīng)元受損現(xiàn)象[12]，海馬可被分為海馬角（cornuammonis，CA）和齒狀回（dentate gyrus，DG），這些區(qū)域都與學(xué)習(xí)記憶和空間認(rèn)知功能相關(guān)。DG 區(qū)是海馬信息的傳入點(diǎn)，并且作為神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵區(qū)域，可終生形成新神經(jīng)元，在空間信息編碼以及學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用[13]。Okada等人發(fā)現(xiàn)CA3病變并不影響實(shí)驗(yàn)鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的表現(xiàn)，而DG 區(qū)病變導(dǎo)致的水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶障礙最為嚴(yán)重[14]。這與Kesner 等人發(fā)現(xiàn)DG 損傷導(dǎo)致的缺陷與完全海馬損傷相似[15]。同時(shí)羅財(cái)妹等人發(fā)現(xiàn)AD 患者DG 區(qū)體積隨著疾病的進(jìn)程顯著下降，猜測海馬齒狀回可能是AD 發(fā)病的重要位點(diǎn)[16]。尼氏體可反應(yīng)神經(jīng)元的功能情況，在正常狀態(tài)下有固定的形態(tài)，而當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏體會(huì)變得模糊或消失，因此可通過尼氏體的變化反映神經(jīng)元的功能狀態(tài)[17]。因此在本研究中選用了DG 區(qū)作為觀察Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠腦片尼氏體染色的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)麋角丸作用后可增加DG 區(qū)尼氏體的數(shù)量，表明麋角丸對模型小鼠海馬DG 區(qū)神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用。同時(shí)本研究考察了麋角丸對正常小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥后與空白組小鼠相比總運(yùn)動(dòng)距離和曠場中心停留時(shí)間無明顯差異，因此麋角丸改善Aβ 誘導(dǎo)小鼠受損的學(xué)習(xí)和記憶能力并非麋角丸引起的神經(jīng)興奮作用。

臨床發(fā)現(xiàn)，AD 患者血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯升高。Aβ 沉積可激活A(yù)D 患者腦部小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α），從而引發(fā)炎癥與免疫反應(yīng)產(chǎn)生神經(jīng)毒性[18]。同時(shí)Aβ 引起的炎性因子會(huì)加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，惡化AD 患者大腦神經(jīng)元的氧化損傷[19]。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)腦組織中核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶-1（HO-1）通路被激活，細(xì)胞內(nèi)Nrf2 可產(chǎn)生明顯的抗氧化作用，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[20]。HO-1 是Nrf2 調(diào)控的最重要的抗氧化保護(hù)蛋白，Nrf2/HO-1 通路的激活可抑制氧化應(yīng)激及淀粉樣蛋白沉積，并導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能的改善[21]。Aβ 誘發(fā)的氧化應(yīng)激會(huì)在腦中產(chǎn)生過量活性氧（ROS），從而抑制抗凋亡因子2 型B 淋巴細(xì)胞（Bcl-2），并刺激促凋亡因子如Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[22]。因此，降低AD患者體內(nèi)Aβ含量、減少患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激可能是治療AD 的有效手段。

中醫(yī)雖無AD 病名的記載，但其核心癥狀記憶障礙與認(rèn)知損傷，可歸為“好忘”“呆病”“癡證”等證[23]，中醫(yī)認(rèn)為AD 的病機(jī)在腦，但與腎的臟腑機(jī)能高度相關(guān)。中醫(yī)理論主“腎藏志”，“志”是對神志活動(dòng)的高概括，也是精神活動(dòng)的集中體現(xiàn)?！澳I藏精”，腎精是人生命的本原物質(zhì)。老年人群年事日高，腎精虧虛，髓海失養(yǎng)，易出現(xiàn)認(rèn)知障礙等神志活動(dòng)異常現(xiàn)象[24]。因此補(bǔ)腎填精是中醫(yī)用治AD 的重要治則治法。麋角丸出自唐代孫思邈《備急千金要方·卷十九腎臟·補(bǔ)腎第八》，是中醫(yī)補(bǔ)腎著名方劑，原書用于治療“五勞六極七傷虛損”。方中麋鹿角、肉蓯蓉、菟絲子溫腎陽，益精血；人參、甘草益氣；秦艽，檳榔，木通祛風(fēng)通絡(luò)利濕。通補(bǔ)結(jié)合，補(bǔ)而不滯，功可“補(bǔ)心神、安臟腑、填骨髓”[25]。但是其現(xiàn)代研究未見報(bào)道，影響了該方的臨床應(yīng)用與現(xiàn)代開發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠存在嚴(yán)重的記憶障礙，通過尼氏體染色發(fā)現(xiàn)模型小鼠海馬DG 區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，而麋角丸對其神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用。麋角丸可能通過下調(diào)海馬區(qū)中樞炎癥因子表達(dá)，調(diào)控氧化應(yīng)激因子和Nrf2/HO-1 信號(hào)通路緩解海馬組織氧化應(yīng)激損傷，降低凋亡相關(guān)因子Caspase-3 和Caspase-9，提高Bcl-2/Bax 水平從而抑制小鼠海馬神經(jīng)元凋亡等途徑改善模型小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力。已有報(bào)道顯示，麋鹿角粉具有抗衰老、提高學(xué)習(xí)記憶等作用[26]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麋鹿角水提物具有顯著抗抑郁效用，并可以下調(diào)抑郁模型動(dòng)物血清和海馬中壓力因子和促炎物質(zhì)的表達(dá)，上調(diào)模型動(dòng)物腦中神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的水平[27]。其他藥味的有效成分如人參皂苷、甘草素均可改善阿爾茨海默癥模型動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力[28,29]。秦艽堿、檳榔堿、以及木通三萜皂苷也有抗炎、抗氧化等作用[30-32]。因此麋角丸改善Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的效用應(yīng)是方中藥味所含成分共同作用的結(jié)果。

中國是世界上阿爾茨海默病患者最多的國家，該病的社會(huì)成本構(gòu)成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。制定切實(shí)有效的防治策略，并從傳統(tǒng)藥物中尋找治療AD 的新藥，將減輕AD 對家庭和社會(huì)造成的負(fù)擔(dān)，有助于提高老年人的生活質(zhì)量，形成一個(gè)健康的老齡化社會(huì)。本次研究中，首次發(fā)現(xiàn)麋角丸具有改善Aβ1-42海馬區(qū)注射小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力，在后續(xù)研究中，我們將深入探索麋角丸改善學(xué)習(xí)與記憶能力的作用機(jī)制與功效物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為麋角丸的臨床應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)提供更多的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)支持。