基于止血作用的三七粉質(zhì)量標志物研究＊

李 新，徐 旭，許 浚，郭海彪，李曉霞，林 娟，張鐵軍＊＊，劉 旻＊＊

（1.天津藥物研究院/天津市中藥質(zhì)量標志物重點實驗室 天津 300301；2.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室 天津 300301；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510515；4.華北理工大學(xué)研究生院 唐山 063200）

中藥材是生產(chǎn)中藥飲片和中成藥的基本原料，其質(zhì)量是保證中藥飲片和中成藥質(zhì)量的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。因此，中藥材質(zhì)量的規(guī)范化是保證中藥材質(zhì)量的重要措施和重要前提[1]。中藥質(zhì)量評價模式目前呈現(xiàn)多元化發(fā)展趨勢，相關(guān)質(zhì)量評價技術(shù)涵蓋多個領(lǐng)域的先進技術(shù)，如光譜、色譜、生物評價、多組學(xué)分析等。雖然中藥檢測與質(zhì)量評價的指標較多，但呈現(xiàn)碎片化的狀態(tài)，與藥效的關(guān)聯(lián)不明確[2]。2016 年劉昌孝院士創(chuàng)造性地提出了中藥質(zhì)量標志物（quality marker，QMarker）這一核心質(zhì)量概念。該概念關(guān)聯(lián)安全性和有效性，著眼于中藥全過程的物質(zhì)基礎(chǔ)的特有、差異、動態(tài)變化和質(zhì)量的傳遞性、溯源性，并且具有整體、多元質(zhì)控的特點[3-4]。

隨著中藥質(zhì)量標志物研究的進展，近年來我國在中藥監(jiān)管方面取得了一定的成效，為了更好地篩選中藥質(zhì)量標志物，反映中藥的整體功效，張鐵軍等[5]對延胡索進行了示范性研究，通過初步探索建立一條比較完整的中藥質(zhì)量標志物研究思路。研究發(fā)現(xiàn)延胡索植物成分中的生物堿主要由氨基酸途徑合成，特異性較強的成分在生源途徑下游的位置，再結(jié)合含量篩選出潛在的中藥質(zhì)量標志物。中藥功效以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測活性成分，從整體動物、器官、細胞、受體等多層面研究其信號通路，以仿生學(xué)和功能受體相結(jié)合進行物質(zhì)篩選，再結(jié)合入血成分研究，最終確定7個延胡索的質(zhì)量標志物。許多學(xué)者對諸多藥材做了較為全面的中藥質(zhì)量標志物的預(yù)測研究，但飲片的質(zhì)量標志物研究較少，沒有系統(tǒng)地進行探索[6],中藥飲片的不合格率仍然占有一定比例。

中藥三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根莖，產(chǎn)地為云南、廣西等地區(qū)，性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經(jīng)，功效為散瘀止血、消腫定痛，主要用于治療外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等[7-8]，其主要特點為即有活血作用又有止血作用。三七的止血作用被廣泛應(yīng)用在臨床中，主要應(yīng)用于急性軟組織損傷、消化道出血、術(shù)后出血、婦科出血、腦出血等領(lǐng)域。宋振華等對60例急性軟組織損傷患者采用三七散治療可以快速改善臨床癥狀,急性期效果顯著[9]。趙巖等采用大黃三七粉治療消化道出血的病人，經(jīng)過一個周期的治療后實驗組的有效率（96.00%）遠高于對照組（76.00%）[10]。鄭丹丹等觀察三七重樓生化湯聯(lián)合二次剖宮產(chǎn)術(shù)中子宮瘢痕切除對預(yù)防子宮切口憩室（PCSD）形成的作用，發(fā)現(xiàn)治療后血性惡露持續(xù)時間和子宮收縮痛評分減低[11]。彭皇青等采用白及三七散治療先兆流產(chǎn)中陰道出血100 例，陰道出血停止時間、腰痛緩解時間及腹痛緩解時間均短于對照組[12]。隆康健等采用三七白及散治療丘腦出血41 例，總有效率（87.8%）明顯高于對照組（62.5%）,出血持續(xù)時間短于對照組,應(yīng)激性潰瘍發(fā)生率、神經(jīng)功能評分、血漿皮質(zhì)醇、ACTH 水平較對照組顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）[13]。

三七藥材經(jīng)分離鑒定，其主要化學(xué)成分為皂苷類，化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同時含有黃酮、甾醇、糖、揮發(fā)油、聚炔醇、氨基酸和有機酸等類化學(xué)成分[14-15]。2020 年版《中華人民共和國藥典》記載三七含量測定以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1為指標[16]。本課題組前期研究三七成分對凝血指標TT、APTT、PT、FIB，以及血小板聚集率、血管動脈條收縮功能等的影響，研究發(fā)現(xiàn)三七中人參皂苷F2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rk1、槲皮素等，包括《中華人民共和國藥典》記載的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1等均具有抗凝活血作用，表明《中華人民共和國藥典》標準中沒有明確止血成分。本研究在前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、入血成分研究及基于活血作用質(zhì)量標志物研究基礎(chǔ)上，對三七超微粉中單體成分的止血作用進行考察，探索三七超微粉基于止血作用的質(zhì)量標志物。

1 實驗材料

三七素（批號：R05N10F102244）和人參皂苷Rb2（批號：P15O10F94983）購自上海源葉生物科技有限公司，用于縮血管研究。三七素以磷酸緩沖液（PBS）配制成儲備液，人參皂苷Rb2以二甲基亞砜（DMSO）配制成儲備液。

試劑盒：凝血酶時間（TT）（批號：031906A）、活化部分凝血酶原時間（APTT）（批號：021908A）、凝血酶原時間（PT）（批號：011710A）、纖維蛋白原（FIB）（批號：041904B）試劑盒均購自美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司。試劑：二磷酸腺苷（ADP）（批號：SLCB5611）購自Sigma 公司；去氧腎上腺素（苯腎上腺素，PE）（批 號：MTBXK-CP）購 自Tokyo chemical industry公司。

儀器：凝血因子分析儀（LG-Paker 1），北京普利生儀器有限公司；血小板聚集儀（型號：540VS），美國Chrono-log 公司；JZ301 型微張力換能器，北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司；MP-150 多導(dǎo)生理信號記錄儀、DA100C 通用放大器，Biopac 公司；HSS-1B 型離體器官恒溫裝置，成都儀器廠。

動物：家兔，北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK（京）2019-0009。

2 實驗方法

2.1 對凝血指標的影響

家兔6 只，雄性，適應(yīng)性喂養(yǎng)一段時間后，禁食過夜，頸總動脈取血，枸櫞酸鈉抗凝，在3000 rpm 離心10 min 制備血漿，在兔血漿中加入三七素樣品（以DMSO配制），濃度分別為0.05、0.5、5、50、100、500、1000 μM；分別設(shè)空白對照組和DMSO 對照組。采用凝血記錄儀，依據(jù)試劑盒說明書操作，測定TT、APTT、PT、FIB。

2.2 對血小板聚集率的影響

家兔6 只，雄性，適應(yīng)性喂養(yǎng)一段時間后，禁食過夜，頸總動脈取血，枸櫞酸鈉抗凝，在1000 rpm 離心10 min 制備富含血小板血漿；在3000 rpm 離心10 min 制備貧血小板血漿。在兔血漿中加入三七素藥物樣品（以雙蒸水配制），濃度分別為0.05、0.5、5、50、100、500、1000、2000 μM，預(yù)孵10 min 后加入ADP，終濃度為6 μM；溶劑對照組加入等體積雙蒸水。采用比濁法，測定血小板聚集率。

2.3 對血管平滑肌的影響

藥物配制：人參皂苷Rb2以DMSO 配制成50 mM儲備液，隨后分別用DMSO 稀釋為所需濃度。三七素以雙蒸水配制為50 mM 儲備液，隨后分別用雙蒸水稀釋為所需濃度。

營養(yǎng)液（Krebs-Henseleit 液）組成：NaCl 119 mM、KCl 4.7 mM、MgCl21.2 mM、NaHCO312.0 mM、NaH2PO41.2 mM、葡萄糖11 mM和CaCl22.5 mM。

動脈條制備：家兔6 只，雄性，適應(yīng)性喂養(yǎng)一段時間后，禁食過夜，戊巴比妥鈉麻醉，頸總動脈放血后，迅速開胸取胸主動脈，置于預(yù)冷生理鹽水中剝離血管表面筋膜，用小眼科剪將主動脈剪成若干螺旋條。

血管反應(yīng)性檢測：將動脈條置于組織灌流系統(tǒng)37℃恒溫水浴槽中，營養(yǎng)液完全浸沒，給予混合氣體；動脈條下端固定，上端鏈接張力換能器，計算機采集張力變化數(shù)據(jù)。營養(yǎng)液中加入去氧腎上腺素，終濃度為0.5 mg·L-1，使動脈條發(fā)生收縮反應(yīng)，待張力達到最大并穩(wěn)定至一平臺后，用營養(yǎng)液洗凈，待血管環(huán)張力恢復(fù)到基線，準備進行下一步實驗。

藥物作用檢測：組織灌流系統(tǒng)穩(wěn)定后，營養(yǎng)液中再加入去氧腎上腺素，終濃度為0.5 mg·L-1，血管條收縮，張力增加，張力曲線上升，待曲線上升平穩(wěn)后加入待測樣品，終濃度分別為1、5、25 μM；另設(shè)蒸餾水對照組和DMSO對照組；待曲線穩(wěn)定后，測量加藥前后曲線變化值，即張力變化值。

數(shù)據(jù)分析：以去氧腎上腺素誘導(dǎo)的血管收縮平穩(wěn)時的數(shù)值為基準，正數(shù)代表血管繼續(xù)收縮，而負數(shù)代表血管舒張。

3 實驗結(jié)果

3.1 對凝血指標的影響

3.1.1 對TT的影響

首先考察了同等體積的DMSO 對體系的影響，發(fā)現(xiàn)DMSO 對本體系中TT 有顯著延長作用（P＜0.01）；與DMSO 溶劑對照組比較，三七素可劑量依賴性降低血漿TT，500-1000 μM內(nèi)效果顯著（P＜0.01）（圖1）。

圖1 三七素對TT的影響

3.1.2 對APTT的影響

首先考察了同等體積的DMSO 對體系的影響，發(fā)現(xiàn)DMSO對本體系中APTT有顯著延長作用（P＜0.01）；與DMSO 溶劑對照組比較，三七素500 和1000 μM 可顯著縮短血漿APTT（P＜0.01）（圖2）。

圖2 三七素對APTT的影響

3.1.3 對PT的影響

首先考察了同等體積的DMSO 對體系的影響，發(fā)現(xiàn)DMSO 對本體系中PT有延長的趨勢，但統(tǒng)計上無顯著性差異（P＞0.05）；與DMSO 溶劑對照組比較，三七素100-1000 μM 可劑量依賴性的縮短血漿PT（P＜0.05，P＜0.01）（圖3）。

圖3 三七素對PT的影響

3.1.4 對FIB的影響

首先考察了同等體積的DMSO 對體系的影響，發(fā)現(xiàn)DMSO 對本體系中FIB 含量有顯著降低作用（P＜0.01）；與DMSO 溶劑對照組比較，三七素50-2000 μM以 上 可 劑量 依 賴性 的 增 加FIB 含 量（P＜0.05，P＜0.01）（圖4）。

圖4 三七素對FIB的影響

3.2 對血小板聚集率的影響

家兔富含血小板血漿中加入三七素可不同程度地誘導(dǎo)血小板聚集。與溶劑對照組比較，三七素1000-2000 μM時可顯著增加血小板聚集率（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。

圖5 三七素對ADP誘導(dǎo)家兔血小板聚集的影響

3.3 對血管平滑肌的影響

與對應(yīng)的溶劑對照組比較，三七素1 μM 濃度時可顯著收縮血管動脈條（P＜0.01），人參皂苷Rb2在5 μM濃度時可顯著收縮血管動脈條（P＜0.05），在25 μM時則具有擴張血管的趨勢（P＞0.05）（圖6）。

圖6 人參皂苷Rb2、三七素對PE誘導(dǎo)離體家兔主動脈環(huán)收縮的影響

4 討論

質(zhì)量是中藥產(chǎn)業(yè)的生命線，近年來由于中藥材品質(zhì)的影響，國內(nèi)外業(yè)界對中醫(yī)藥的安全性和有效性提出諸多質(zhì)疑，中藥質(zhì)量成為行業(yè)關(guān)注的焦點，嚴重影響了中醫(yī)藥的聲譽。中藥質(zhì)量標志物是中藥質(zhì)量標準中的核心要素，是控制中藥材、飲片、提取物及制劑內(nèi)在質(zhì)量的關(guān)鍵，是中藥現(xiàn)代化、國際化的瓶頸之一。劉昌孝院士提出的中藥質(zhì)量標志物是質(zhì)量評價的核心概念，是以藥材基原為研究基礎(chǔ)、以物質(zhì)基礎(chǔ)研究為支撐、以Q-markers 辨析為核心、以質(zhì)控方法為手段，構(gòu)建符合中藥特色的質(zhì)量控制標準，正逐步成為中藥質(zhì)量控制新模式[17]。

由于中藥的功效是在中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下對中藥預(yù)防、治療作用的高度概括。以中藥的功效研究為基礎(chǔ)，發(fā)掘中藥的功效標志物對中藥現(xiàn)代化也具有重要的意義。進行中藥功效標志物的識別，理清其作用機制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、系統(tǒng)藥理學(xué)等新興學(xué)科、交叉學(xué)科發(fā)展迅速，數(shù)據(jù)挖掘、分子模擬、生物網(wǎng)絡(luò)等新興技術(shù)逐漸被引入[18]。本課題前期血清移行成分的分析鑒定了三七超微粉入血的原型成分及代謝產(chǎn)物，并根據(jù)原型成分和查閱文獻共同確定的化合物進行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析。結(jié)合兩者結(jié)果，本課題選取了多個單體化合物進行了凝血指標實驗、血小板聚集實驗、血管平滑肌實驗、心肌和血管保護實驗、消腫定痛實驗等，進行活性化合物的篩選，構(gòu)建了不同的體外細胞模型、體內(nèi)動物模型和離體模型，分別得到三七超微粉發(fā)揮不同作用的標志性成分，其中包括活血成分和止血成分。本文闡述了止血成分的實驗結(jié)果。

《本草綱目新編》中記載：“三七根，止血之神藥也?！比叩闹寡π菍W(xué)界公認的功效。三七止血一般生用，因三七氨基酸不穩(wěn)定，經(jīng)蒸燙炸后易分解。石瑩等采用改良的Feeney 自由落體模型制備法建立創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠模型，于術(shù)前3 天至術(shù)后3 天灌胃三七粉2.5 g·kg-1，結(jié)果三七粉能改善72 h 神經(jīng)功能缺陷評分，同時HE 染色和Nissl 染色腦組織損傷較模型組改善，透射電鏡下腦細胞中可見自噬體減少，泛素結(jié)合蛋白p62、Beclin1 和微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）均明顯下降（P＜0.05或0.01），說明干預(yù)TBI大鼠自噬過程，能促進腦功能恢復(fù)[19]。雷霆等采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)、一次性腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，再以磁鐵壓軋大鼠背部制作潰瘍創(chuàng)面造成糖尿病足潰瘍（DFU）模型，并給予三七/白及膠海綿紗布覆蓋創(chuàng)面進行干預(yù)治療，每1-2 天換藥1 次，干預(yù)治療后第3、7 天時，與模型組分別比較，發(fā)現(xiàn)三七/白及膠海綿組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（P＜0.05）；創(chuàng)面組織的炎細胞浸潤、膠原纖維沉積、毛細血管和肉芽組織生長均明顯增加；β-連環(huán)素（β-catenin）、R-脊椎蛋白3（Rspo3）的mRNA 表達水平均有升高，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）的mRNA 表達水平降低（P＜0.05），表明三七/白及膠海綿可有效促進DFU 模型大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合，作用機制可能與GSK-3β 的mRNA 表達的下調(diào)和β-catenin、Rspo3的mRNA表達的上調(diào)相關(guān)[20]。

止血過程與凝血因子、血小板、血管收縮等有關(guān)。凝血是一系列凝血因子相繼酶解激活，最終纖維蛋白原激活生成纖維蛋白凝塊，使血液由流動狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)的過程，包括內(nèi)源性凝血途徑、外源性凝血途徑和共同凝血途徑（圖7）。APTT 是臨床上篩選內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ缺乏的首選實驗。有出血癥狀的單因子缺乏患者及手術(shù)和創(chuàng)傷后的異常出血等均需要了解凝血因子的缺乏程度[21]。PT 用于外源性凝血途徑的篩選性實驗和凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ缺乏的篩選，用于定量測定及口服抗凝劑治療的監(jiān)控[22]。TT 測定適用于檢驗共同凝血途徑的篩選試驗，反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)為纖維蛋白的時間。纖維蛋白原是凝血過程中的主要蛋白質(zhì)，在凝血酶、血纖維穩(wěn)定因子（FXⅢa）、Ca2+等凝血因子的作用下形成纖維蛋白單體，并相互共價結(jié)合形成纖維蛋白多聚體，形成穩(wěn)定的纖維蛋白網(wǎng)，最終網(wǎng)羅紅細胞（RBC）、血小板（PLT）等成分形成穩(wěn)定血栓結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)三七中的三七素可顯著縮短APTT、TT、PT 時間，提高血漿中FIB含量,是三七促凝作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖7 凝血途徑

血小板在正常生理血液中是靜息的，血小板活化功能亢進是血栓形成的主要病理機制之一。受多重因素的影響血小板被激活，血小板和纖維蛋白原聚集成團，最終導(dǎo)致血栓形成及血管的閉塞。鄺晶等采用腦出血大鼠模型，給予大鼠灌胃三七后大鼠出血量、血腫程度和梗死面積明顯比模型組少或減輕，血管組織中血小板活化因子CD62P的表達量明顯下調(diào)[23]。本實驗發(fā)現(xiàn)三七素可誘導(dǎo)血小板聚集，是三七促血小板聚集發(fā)揮止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

人工全髖關(guān)節(jié)置換（THA）術(shù)后會較大量失血，同時關(guān)節(jié)的積血腫脹增加了術(shù)后感染幾率，也影響患者的康復(fù)鍛煉。如何減少THA 術(shù)后失血，爭取做到不輸血是目前關(guān)注的焦點。臨床上有術(shù)中關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射腎上腺素、術(shù)后彈力繃帶加壓包扎、冰敷等引起血管收縮或造成血管腔變小的方法來減少THA 術(shù)后出血。肖署陽等選取人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者30 例，于前1天和術(shù)后連續(xù)3 天口服三七止血湯，結(jié)果顯示三七止血湯能顯著減少人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的總失血量、顯性失血量及隱性失血量，輸血患者數(shù)量和輸血量明顯降低，可顯著減少人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)圍手術(shù)期失血[24]。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb2在25 μM濃度時，可顯著收縮血管；三七素在1 μM 濃度時，可顯著收縮血管，表明人參皂苷Rb2、三七素是三七縮血管發(fā)揮止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，三七止血作用主要表現(xiàn)在促凝血、促血小板聚集、血管收縮等方面。促凝血、促血小板聚集作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是三七素，縮血管作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是三七素（圖8）、人參皂苷Rb2（圖9）。

圖8 L-三七素

圖9 人參皂苷Rb2