基于心血管保護(hù)作用的三七粉質(zhì)量標(biāo)志物研究＊

李 新，徐 旭，許 浚，林 娟，李曉霞，王德勤，張鐵軍＊＊，郭海彪＊＊

（1.天津藥物研究院/天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300301；2.天津藥物研究院/中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 天津 300301；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510515；4.華北理工大學(xué)研究生院 唐山 063200）

中藥質(zhì)量一直是中藥臨床需求和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題。中藥區(qū)別于化學(xué)藥的特點(diǎn)主要體現(xiàn)在中藥是一個(gè)復(fù)雜體系，一種中藥往往含有結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同的多種成分，不同性質(zhì)的成分?jǐn)?shù)量多、結(jié)構(gòu)差異大，而化學(xué)藥一般由單體或幾個(gè)化合物組成；由于中藥成分復(fù)雜，常通過(guò)多途徑、多成分、多靶點(diǎn)、多層次發(fā)揮整體療效作用，而化學(xué)藥作用于人體特異性靶點(diǎn)，具有較高的選擇性和專一性[1]。由于中藥質(zhì)量缺少系統(tǒng)的理論指導(dǎo)，長(zhǎng)期以來(lái)，聚焦到中藥質(zhì)量本質(zhì)和內(nèi)涵的研究，還處于碎片化狀態(tài)，是制約中藥質(zhì)量研究的關(guān)鍵瓶頸問(wèn)題[2]。為解決這一問(wèn)題，2016 年劉昌孝院士針對(duì)中藥生物屬性、制造過(guò)程及配伍理論等自身醫(yī)藥體系的特點(diǎn)，整合多學(xué)科知識(shí)，提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）這一核心質(zhì)量概念。該概念關(guān)聯(lián)安全性和有效性，著眼于全過(guò)程的物質(zhì)基礎(chǔ)特有、差異、動(dòng)態(tài)變化和質(zhì)量的傳遞性、溯源性，并且具有整體、多元質(zhì)控的特點(diǎn)[3]。

中藥三七是五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根莖，主要產(chǎn)地云南、廣西等地區(qū)，性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經(jīng)，功效為散瘀止血、消腫定痛，主要用于治療外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等[4]?！侗静菥V目》稱三七為“止血之神藥、理血之妙品”，三七活血作用廣泛用于心腦血管疾病的防治，含三七成分的中藥制劑，如血塞通注射液、三七總皂苷片等，已經(jīng)成為目前中藥制劑中年銷售額最大的品種之一[5]。通過(guò)對(duì)130 例急性腦梗死患者的治療觀察，發(fā)現(xiàn)以血塞通注射液+阿托伐他汀聯(lián)合治療,對(duì)患者心電異常發(fā)生率，血液流變學(xué)具有顯著降低作用[6]。通過(guò)對(duì)慢性心力衰竭大鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可通過(guò)調(diào)節(jié)慢性心力衰竭大鼠心臟功能指標(biāo)，改善心室收縮肌舒張功能,并降低利鈉肽及血管緊張素Ⅱ水平,有效防止心肌重構(gòu)[7]。2020 年藥典記載三七含量測(cè)定以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1為指標(biāo)[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道同等劑量三七超微粉的生物利用度優(yōu)于三七常規(guī)粗粉。三七超微粉中主要成分，如人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量均高于三七細(xì)粉中的成分，兩者間的含量有顯著性差異[9]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)三七中的其他成分也具有心血管保護(hù)作用，如人參皂苷Rg3通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1/NFκB 通路抑制NLRP3 炎性小體和氧化應(yīng)激，從而減輕血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌肥厚[10]；人參皂苷Rg2通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路減輕心肌纖維化[11]。由此可見(jiàn)，2020 年藥典記載的三七成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1，并不能完全代表三七心血管保護(hù)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而其他相關(guān)研究也比較分散，且多集中在個(gè)別皂苷類成分研究，甚至有些研究將一些心血管疾病的病因研究，如凝血機(jī)制、血脂異常等，與三七粉直接保護(hù)心血管的作用相混淆。目前尚未有針對(duì)三七粉保護(hù)心血管作用物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究在前期網(wǎng)絡(luò)藥理和入血成分研究基礎(chǔ)上，采用直接干預(yù)心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，以三七粉中代表成分（包括皂苷類、黃酮類、三七素等）為研究對(duì)象，探索三七粉基于心血管保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，明確質(zhì)量標(biāo)志物。

1 實(shí)驗(yàn)材料

三七粉由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司負(fù)責(zé)收集，來(lái)源于五加科人參屬植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen。三七總皂苷：天津藥物研究院制備。三七粉主要成分：人參皂苷Rh1（批號(hào)：R26N9F75983）、人參皂苷Re（批號(hào)：B04D9S7649 9）、槲皮素（批號(hào)：C09S8Y43412）、人參皂苷F2（批號(hào)：Z10A9X58128）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：G16S10Y97436）、人參皂苷Rg3（批號(hào)：Z14J10X90607）、人參皂苷Rd（批號(hào)Z09A9X67397）、人參皂苷Rb2（批號(hào)：P15O10F9498 3）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：P19S10U98130）、人參皂苷Rb3（批 號(hào)：P05M10F87444）、人 參 皂 苷Rk1（批 號(hào)：B27J8S39859）、三七皂苷R1（批號(hào)：G22D9Y77958）、人參皂苷Rg2（批號(hào)：M07N10S102243）、三七素（批號(hào)：R05N10F102244）14 種實(shí)驗(yàn)樣品，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。三七總皂苷和三七素以PBS 配制成儲(chǔ)備液，其他單體成分以DMSO配制成儲(chǔ)備液。

試劑盒：BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：010719190624）、SOD 試劑盒（批號(hào)：060619190723）、MDA 試劑盒（批號(hào)：030819190522），碧云天公司產(chǎn)品；LDH 試劑盒，南京建成公司產(chǎn)品（批號(hào)：20191109）；ACP試劑盒（批號(hào)：FJ2XQKQU6Z）：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

試劑：CoCl2·6H2O（批號(hào)：SLBZ4786），sigma 公司產(chǎn)品；MTT（批號(hào)：123A0510），索萊寶公司產(chǎn)品；H2O2（批號(hào)：20181205）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

儀器：酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific 公司；倒置顯微鏡，Leica 公司；低溫高速離心機(jī)；Thermo 公司；生物安全柜：濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司。

細(xì)胞：大鼠心肌細(xì)胞（H9C2）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），購(gòu)自于賽百慷（上海）細(xì)胞庫(kù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)心肌細(xì)胞的影響

大鼠H9C2 心肌細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2 細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)，分別給予三七總皂苷（終濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg·L-1）及人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg3、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素實(shí)驗(yàn)樣品（每種實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)5 個(gè)終濃度0.1、1、10、100、200μM），MTT 法測(cè)定實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)正常心肌H9C2 細(xì)胞的作用。計(jì)算細(xì)胞存活率公式如下：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-校正組OD值）÷（對(duì)照組OD值-校正組OD值)×100%。

采用CoCl2制備心肌細(xì)胞（H9C2）損傷模型。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2 細(xì)胞接種于96 孔板，每孔接種100 μL，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。根據(jù)上述正常H9C2 心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按空白組和給藥組給予空白培養(yǎng)液或不同濃度的三七總皂苷/三七單體實(shí)驗(yàn)樣品溶液各50 μL（共150 μL/孔）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。處理結(jié)束后，加入終濃度為500 μM 的CoCl2溶液或空白培養(yǎng)液50 μL 至上述96孔板中（共200 μL/孔），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔避光加入終濃度為0.5 mg·mL-1的MTT 20 μL，在培養(yǎng)箱中孵育4 h。孵育結(jié)束取走上清液后，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定OD值。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。上清液按照試劑盒要求檢測(cè)LDH，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。心肌細(xì)胞用預(yù)冷PBS 洗2 遍后，每孔加入裂解液60 μL，冰上裂解10min 后，刮下細(xì)胞，以12000r 低溫離心10 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。隨后按照試劑盒要求測(cè)定MDA含量和SOD活性，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。

2.2 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）經(jīng)復(fù)蘇、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC 細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)，分別給予三七總皂苷（終濃度3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg·L-1），以及人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Re、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rd、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素實(shí)驗(yàn)樣品，（每種實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)5 個(gè)終濃度0.1、1、10、100、200 μM），MTT 法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)HUVEC 細(xì)胞存活率的作用。

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，接種于96孔板，密度為6×104cells/mL，每孔中接種100 μL，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h。根據(jù)上述正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入不同濃度的三七總皂苷/三七單體成分50 μL，孵育24h。然后按空白組和造模組分別給予400 μM H2O2溶液或空白培養(yǎng)液各50 μL（共200 μL/孔）繼續(xù)培養(yǎng)2h。藥物處理結(jié)束后，每孔避光加入終濃度為0.5 mg·mL-1的MTT 20 μL，在培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，取走上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min 至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后于酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定OD 值。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。上清液按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)LDH、ACP，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)心肌細(xì)胞的影響

3.1.1 對(duì)正常心肌細(xì)胞的影響

三七總皂苷的濃度在3.125-100 mg·L-1時(shí)對(duì)H9C2 細(xì)胞存活率無(wú)影響（P＞0.05）；其濃度在200-400 mg·L-1時(shí)表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞增殖作用（P＞0.05），濃度為800 mg·L-1時(shí)表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性（P＜0.01），因此小于等于400 mg·L-1是三七總皂苷的安全劑量。

單體成分中人參皂苷Rb3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3和人參皂苷Rh1具有促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖作用。部分成分超過(guò)10μM，出現(xiàn)毒性反應(yīng)，因此各單體成分在0.1-10 μM 范圍內(nèi)均為安全劑量，可進(jìn)行效應(yīng)比較。結(jié)果詳見(jiàn)圖1。

圖1 三七總皂苷和各單體對(duì)H9C2細(xì)胞存活率的影響。（A）三七總皂苷對(duì)H9C2細(xì)胞存活率的影響；（B-C）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、槲皮素、人參皂苷F2等單體對(duì)H9C2細(xì)胞存活率的影響。

3.4.2 對(duì)心肌損傷細(xì)胞存活率的影響

選擇對(duì)H9C2 細(xì)胞存活率無(wú)毒性影響的三七總皂苷濃度在3.125-200 mg·L-1，觀察對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞（H9C2）損傷模型的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三七總皂苷3.125-50 mg·L-1濃度時(shí)，與CoCl2組比較，未見(jiàn)顯著差異（P＞0.05）；100、200 mg·L-1時(shí)，可顯著增加細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01）。

選擇對(duì)H9C2 細(xì)胞存活率無(wú)毒性影響的三七單體成分濃度在在0.1-10 μM，觀察對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞（H9C2）損傷模型的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CoCl2組比較，三七單體成分人參皂苷Rb3、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rd、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素能夠顯著增加H9C2 細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

圖2 三七總皂苷和各單體對(duì)CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞存活率的影響。（A）三七總皂苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞存活率的影響；（B-C）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、槲皮素、人參皂苷F2等單體對(duì)CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞存活率的影響。

3.4.3 對(duì)心肌損傷細(xì)胞LDH的影響

三七總皂苷100 mg·L-1、200 mg·L-1預(yù)處理組LDH檢測(cè)結(jié)果分別為104.07±45.06，116.64±27.31，與CoCl2細(xì)胞損傷模型組檢測(cè)結(jié)果152.78±6.92比較，具有顯著差異，能夠減少LDH 活性（P＜0.01）。單體成分人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg3、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1和人參皂苷Rh1能夠顯著降低H9C2 細(xì)胞上清中LDH 活性（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果詳見(jiàn)圖3。

圖3 各單體化合物對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞上清LDH含量的影響。（A）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2等5個(gè)單體化合物對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞上清LDH含量的影響；（B）人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Re等4個(gè)單體化合物對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞上清LDH含量的影響；（C）三七總皂苷及槲皮素、人參皂苷F2等5個(gè)單體成分對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞上清LDH含量的影響。

3.4.4 對(duì)心肌損傷細(xì)胞SOD、MDA的影響

三七總皂苷100 mg·L-1、200 mg·L-1預(yù)處理組SOD檢測(cè)結(jié)果分別為0.91±0.07，0.74±0.03，與CoCl2細(xì)胞損傷模型組檢測(cè)結(jié)果0.65±0.03 比較，具有顯著差異，能夠提高SOD 活性（P＜0.05，P＜0.01）。單體成分人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rd、槲皮素和三七素能夠顯著增加H9C2 細(xì)胞SOD 活性（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果詳見(jiàn)圖4。

圖4 各單體化合物對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞SOD含量的影響。（A）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2等9個(gè)單體化合物對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞SOD含量的影響；（B）三七總皂苷及槲皮素、人參皂苷F2等5個(gè)單體成分對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞SOD含量的影響。

三七總皂苷100mg·L-1、200mg·L-1預(yù)處理組MDA檢測(cè)結(jié)果分別為14.62±2.01，11.19±0.38，與CoCl2細(xì)胞損傷模型組檢測(cè)結(jié)果44.65±2.21比較，具有顯著差異，能夠減少M(fèi)DA含量（P＜0.01）。

單體成分人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg3、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1和三七素能夠顯著降低H9C2 細(xì)胞上清液MDA含量（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果詳見(jiàn)圖5。

圖5 各單體化合物對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞MDA含量的影響。（A）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2等9個(gè)單體化合物對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞MDA含量的影響；（B）三七總皂苷及槲皮素、人參皂苷F2等5個(gè)單體成分對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞MDA含量的影響。

3.5 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

3.5.1 對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞的影響

三七總皂苷的濃度在3.125 mg·L-1時(shí)，對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響（P＞0.05）；其濃度在6.25-100 mg·L-1時(shí)其細(xì)胞存活率雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01），但細(xì)胞并未受到明顯損傷；其濃度在200 mg·L-1時(shí)細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；其濃度為400-800 mg·L-1時(shí)表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性（P＜0.01），因此小于等于200 mg·L-1是三七總皂苷的安全劑量。

與溶劑對(duì)照組比較，三七皂苷R1在1 μM 劑量下有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用（P＜0.05）；人參皂苷Rb3在0.1-1 μM 劑量下有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用（P＜0.05）。各單體成分除人參皂苷F2外在0.1-10 μM 范圍內(nèi)均為安全劑量，可進(jìn)行效應(yīng)比較。結(jié)果詳見(jiàn)圖6。

圖6 三七總皂苷和各單體對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響。（A）三七總皂苷對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響；（B-C）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、槲皮素、人參皂苷F2等單體對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響。

3.5.2 對(duì)內(nèi)皮損傷細(xì)胞存活率的影響

選擇對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)毒性作用的三七總皂苷濃度3.125-200mg·L-1，觀察對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）損傷模型的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三七總皂苷3.125-100mg·L-1與H2O2組比較，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷并未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05），三七總皂苷200 mg·L-1可顯著增加細(xì)胞存活率（P＜0.01）。

選擇對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)毒性作用的三七單體成分濃度0.1-10 μM，觀察對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）損傷模型的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三七單體成分三七皂苷R1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素可顯著提高HUVEC細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果詳見(jiàn)圖7。

圖7 三七總皂苷和各單體對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞存活率的影響。（A）三七總皂苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞存活率的影響；（B-C）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、槲皮素、人參皂苷F2等單體H2O2誘導(dǎo)對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響。

3.5.3 對(duì)內(nèi)皮損傷細(xì)胞LDH的影響

三七總皂苷100 mg·L-1、200 mg·L-1預(yù)處理組LDH檢測(cè)結(jié)果分別為138.49±13.69，172.48±23.53，與H2O2細(xì)胞損傷模型組檢測(cè)結(jié)果175.13±17.28 比較，能夠減少LDH活性（P＜0.05，P＞0.05）。

單體成分人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg3、人參皂苷Re、人參皂苷Rd 和三七素均能不同程度降低細(xì)胞上清中LDH 活性（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果詳見(jiàn)圖8。

圖8 各單體對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞上清LDH活性的影響。（A）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2等9個(gè)單體化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞上清LDH活性的影響；（B）三七總皂苷及槲皮素、人參皂苷F2 等5個(gè)單體化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞上清LDH活性的影響。

3.5.4 對(duì)內(nèi)皮損傷細(xì)胞ACP的影響

三七總皂苷100 mg·L-1、200 mg·L-1預(yù)處理組ACP檢測(cè)結(jié)果分別為0.34±0.21，0.45±0.04，與H2O2細(xì)胞損傷模型組檢測(cè)結(jié)果0.67±0.07比較，能夠減少ACP活性（P＜0.05）。

單體成分人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Re、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rd、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rh1和三七素均能不同程度降低細(xì)胞上清中ACP活性（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果詳見(jiàn)圖9。

圖9 各單體對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞上清ACP含量的影響（A）三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2等9個(gè)單體化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞上清ACP含量的影響；（B）三七總皂苷及槲皮素、人參皂苷F2 等5個(gè)單體化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞上清ACP含量的影響。

4 小結(jié)

三七單體成分對(duì)心肌損傷細(xì)胞存活率、心肌細(xì)胞LDH、心肌細(xì)胞SOD、內(nèi)皮損傷細(xì)胞存活率、內(nèi)皮細(xì)胞LDH、內(nèi)皮細(xì)胞ACP 等6 個(gè)指標(biāo)的作用，匯總?cè)缦?，詳?jiàn)表1。

表1 三七粉中單體成分心血管保護(hù)指標(biāo)匯總

5 討論

中藥三七是五加科植物人參三七panaxnotoginseng（Burk）F.H.Chen 的干燥根，主產(chǎn)于云南、廣西等地。三七活血作用廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的防治[12]。其主要作用機(jī)制包括，保護(hù)心肌，維持心肌正常泵血功能；保護(hù)血管內(nèi)皮，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成等。三七化學(xué)成分類型多樣，主要有皂苷類、黃酮類、多糖類、氨基酸類等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合血清移行成分結(jié)果和文獻(xiàn)查證，選取了12個(gè)人參皂苷類成分（包括5 個(gè)人參三醇類成分和7 個(gè)人參二醇類成分），1個(gè)黃酮類成分和1 個(gè)氨基酸類成分，從中藥心血管保護(hù)的多種機(jī)制方面研究三七的標(biāo)志性成分。

5.1 保護(hù)心肌細(xì)胞

冠心病是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔阻塞，心肌缺血、缺氧而引起的心臟病。心臟對(duì)缺血缺氧極其敏感，缺血缺氧造成的心肌細(xì)胞損傷較難恢復(fù)，因此保護(hù)心肌對(duì)冠心病患者非常重要[13]。戴紅紅等將92例心源性腦栓塞患者分為對(duì)照組和觀察組,對(duì)照組（n=46）給予常規(guī)治療，中藥治療組（n=46）在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予黃芪三七湯治療，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)治療后，中藥治療組在生活質(zhì)量評(píng)分方面顯著高于對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在經(jīng)過(guò)治療7 天、14 天后，中藥治療組在NIHSS 評(píng)分、MMP-9 方面均顯著比對(duì)照組低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此認(rèn)為黃芪三七湯治療心源性腦栓塞能夠阻礙患者血漿中MMP-9 的高表達(dá)，臨床效果較好[14]。

冷雪等采用異丙腎上腺素建立大鼠急性心肌缺血模型，腹腔注射給予人參皂苷Rg110、20 mg·kg-1，連續(xù)5天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，人參皂苷Rg1組，心肌表面平均血流有顯著提升，血清一氧化氮（NO）升高，肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）降低，心肌丙二醛（MDA）含量降低，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）含量升高，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA 表達(dá)含量升高，PI3K/Akt 通路蛋白的表達(dá)升高，認(rèn)為人參皂苷Rg1可以通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt-eNOS 信號(hào)通路改善急性心肌缺血大鼠心臟變化防治心血管病變[15]。吳惠珍等采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前支30 min 后再松解手術(shù)線的方法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，灌胃給予人參皂苷Rb310、20、30 mg·kg-1，連續(xù)2 天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，人參皂苷Rb3組大鼠心肌梗死面積百分比降低，同工酶、丙二醛、乳酸脫氫酶、內(nèi)皮舒張因子水平降低，谷胱甘肽過(guò)氧化酶、超氧化物歧化酶水平升高，認(rèn)為人參皂苷Rb3對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、抗自由基、抗炎癥反應(yīng)及影響心肌酶參與體內(nèi)能量代謝的過(guò)程有關(guān)[16]。

當(dāng)機(jī)體缺血缺氧時(shí)，活性自由基會(huì)突然生成增多，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和維生素等內(nèi)源性物質(zhì)的活性開(kāi)始降低，由于難以承受負(fù)荷，生成的自由基如MDA，難以清除掉，使得細(xì)胞內(nèi)的生物膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸受到損傷，并引起線粒體受損，因而造成心肌細(xì)胞損傷，釋放LDH。本研究采用CoCl2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素可以顯著提高心肌細(xì)胞存活率，其機(jī)制可能與提高心肌細(xì)胞SOD活力，降低MDA含量有關(guān)。

5.2 保護(hù)血管內(nèi)皮

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能改變是動(dòng)脈粥樣硬化的初始環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷不僅可以促進(jìn)血管局部血栓的形成，還可促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、內(nèi)皮素、5-羥色胺、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、黏附分子等，促進(jìn)血管的收縮，吸引炎性細(xì)胞的趨化和黏附，動(dòng)脈粥樣斑塊形成[17]。梁文華等選擇109例氣虛痰瘀阻絡(luò)型不穩(wěn)定型心絞痛（UA）患者，分為治療組與對(duì)照組。對(duì)照組患者給予常規(guī)心內(nèi)科監(jiān)護(hù)及規(guī)范治療，治療組患者在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予自擬的芪蛭三七湯口服治療。結(jié)果顯示，對(duì)照組總有效率為73.58%（39/53），治療組總有效率為95.92%（47/49），治療組總有效率高于對(duì)照組（P＜0.05），治療后對(duì)照組和治療組患者在中醫(yī)證候評(píng)分、心絞痛的發(fā)作頻率及硝酸甘油的用量、血液流變學(xué)指標(biāo)、TXB2、ET-1 等方面均較治療前顯著降低，而且治療組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；治療后，對(duì)照組和治療組患者在NO 水平方面顯著升高，且治療組高于對(duì)照組（P＜0.05）[18]。

陳文明等采用球囊損傷法制備大鼠頸動(dòng)脈損傷模型，術(shù)后次日灌胃人參皂苷Rg35、10 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)14 天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，人參皂苷Rg3組血管內(nèi)膜增生明顯減輕，內(nèi)膜與中膜面積比明顯下降，新生內(nèi)膜區(qū)平滑肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，損傷血管Fas 基因表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 基因表達(dá)水平明顯降低，認(rèn)為人參皂苷Rg3可能通過(guò)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡，從而減輕球囊損傷后血管內(nèi)膜的增生[19]。鄧敏貞等采用四血管阻斷法復(fù)制血管性癡呆（VD）模型，灌胃給予人參皂苷Rb310 mg·kg-1，每日2 次，連續(xù)30 天。結(jié)果與模型組比較，人參皂苷Rb3組小鼠的避暗潛伏期顯著延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)均顯著減少，4-羥基壬烯酸（4-HNE）、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）、活性氧（ROS）含量以及Bax mRNA、蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，Bcl-2 mRNA、蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），認(rèn)為人參皂苷Rb3對(duì)VD 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有一定改善作用，其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激、抗海馬組織凋亡有關(guān)[20]。

本研究采用了過(guò)氧化氫誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞損傷2h內(nèi)的急性氧化應(yīng)激損傷，與冠心病、高血壓等病理演變的始動(dòng)環(huán)節(jié)吻合，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞功能標(biāo)志物L(fēng)DH 和ACP 分泌增加。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素可明顯增高氧化損傷下的細(xì)胞存活率，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述，三七具有保護(hù)心肌、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用，主要活性成分為人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素等。