三七粉血清藥物化學(xué)研究＊

劉耀晨，王德勤，張洪兵，郭海彪，韓彥琪，林 娟，張鐵軍，5＊＊，許 浚，5＊＊

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 天津 300070；2.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510515；3.天津藥物研究院天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300301；4.天津藥物研究院中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 天津 300301；5.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300301）

三七為五加科人參屬植物三七Panax notoginseng(Burk.) f.H.Chen 的干燥根和根莖，收載于《中國(guó)藥典》，傳統(tǒng)功效為活血化瘀、消腫止痛[1]。三七中以皂苷類(lèi)有效成分為主，還含有多種非皂苷類(lèi)成分，如糖類(lèi)、氨基酸、黃酮類(lèi)等[2]。三七粉是將三七藥材經(jīng)粉碎而成，作為中藥飲片主要用于外傷出血、胸腹刺痛及跌撲腫痛等[3]。三七粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要參考《中國(guó)藥典》，但現(xiàn)行《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了三七粉中人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的含測(cè)總量[1]，相關(guān)研究表明，三七皂苷成分主要與活血、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用相關(guān)[4-10]。因此，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不能真正反映三七粉質(zhì)量與療效的關(guān)系。

為解決我國(guó)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在的問(wèn)題，劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的概念，明確了QMarker 的基本條件，Q-Marker 研究應(yīng)對(duì)中藥有效成分的傳遞和轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行研究[11,12]。三七粉以口服用藥的形式通過(guò)體內(nèi)傳輸發(fā)揮臨床療效，化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)經(jīng)過(guò)質(zhì)量傳遞和代謝轉(zhuǎn)化后體現(xiàn)出其特有的生物效應(yīng)。入血成分及其代謝產(chǎn)物是三七粉最終的“效應(yīng)成分”。從質(zhì)量傳遞與溯源的角度,血中的效應(yīng)成分是質(zhì)量傳遞體系的最終環(huán)節(jié),也是中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定的重要依據(jù)[13]。因此，必須明確三七粉體外化學(xué)成分組-體內(nèi)血行成分組的傳遞-轉(zhuǎn)化過(guò)程，為三七粉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的傳遞過(guò)程提供清晰的路徑。目前三七皂苷成分表征及單體皂苷的代謝轉(zhuǎn)化研究已有報(bào)道[14-20]，但缺乏三七粉化學(xué)物質(zhì)組及其體內(nèi)血行成分組的表征。

本研究建立三七粉的化學(xué)指紋譜，運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)所含化學(xué)成分進(jìn)行了全面分析；隨后結(jié)合血清藥物化學(xué)方法建立給藥血漿的血行成分指紋譜，分析血中移行的原型藥物成分及代謝物，明確體外化學(xué)成分組-體內(nèi)血行成分組的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)傳遞-轉(zhuǎn)化過(guò)程，為三七粉的質(zhì)量標(biāo)志物確定與全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。同時(shí)為課題組后期深入三七粉分子作用機(jī)制，從成分的“有效性”方面框定其質(zhì)量標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

Acquity UPLC 超液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Xevo G2 Q-Tof 高分辨質(zhì)譜（美國(guó)Waters 公司），配備ESI 離 子 源；Acquity UPLC BEH C18（2.1×100 mm, 1.7 μm）色譜柱（美國(guó)Waters 公司）；HAC-Ⅰ自動(dòng)濃縮氮吹儀（天津市恒奧科技有限公司）；3K15高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）

1.2 試藥

對(duì)照品人參皂苷Re（批號(hào)110754-201827）、人參皂苷Rd（批號(hào)111818-201603）、人參皂苷Rg1（批號(hào)110704-201827）、三七皂苷R1（批號(hào)10745-201820）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，人參皂苷Rc（批號(hào)M29F11S109055）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；色譜純乙腈、甲醇和甲酸購(gòu)自天津市康科德科技有限公司；純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈飲用水有限公司；三七粉購(gòu)自廣州白云山和記黃埔中藥有限公司（批號(hào)YPA8L0006）。

2 方法

2.1 三七粉樣品溶液制備

取三七粉1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇10 mL，超聲提取20 min，重復(fù)2 次合并提取液，以70%甲醇稀釋至25 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得三七粉樣品溶液供檢測(cè)分析。

2.2 三七粉大鼠灌胃溶液制備

取三七粉適量，加入羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液，并稀釋至濃度為0.3 g·mL-1，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取適量人參皂苷Re、Rd、Rg1、Rc 和三七皂苷R1，置于量瓶中，加入甲醇，制備成0.1 mg·mL-1各對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別量取上述儲(chǔ)備液適量，稀釋?zhuān)苽涑删鶠?0 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。4℃下保存，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)。

2.4 含藥血清制備與處理

2.4.1 給藥與采血

雄性SD 大鼠（200±20 g），飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為兩組并稱(chēng)定體重，按1 mL/100 g的灌胃劑量，空白組給予羧甲基纖維素鈉溶液，給藥組灌以三七粉混懸液。

實(shí)驗(yàn)大鼠給藥4 h 后以10%水合氯醛麻醉，肝門(mén)靜脈取血置肝素化試管中，于4℃條件下3500 rpm 離心10 min分離血漿，置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 血漿樣品的處理

取大鼠血漿樣品500 μL，加入甲醇，混勻，于4℃條件下13000 rpm 離心10 min，上清液使用N2吹干，殘?jiān)约状紡?fù)溶，離心吸取上清液供檢測(cè)分析。

2.5 LC-MS分析

色譜分析采用Waters Acquity UPLC 液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Waters Acquity UPLC? BEH C18（2.1×100 mm,1.7 μm）柱，流動(dòng)相系統(tǒng)由A（0.1%甲酸乙腈）和B（0.1%甲酸水溶液）組成，流速0.4 mL·min-1，柱溫45℃，進(jìn)樣量5 μL。運(yùn)用梯度洗脫，梯度程序設(shè)置如下：0-3 min，8%-20% A；3-6 min，20%-25% A；6-16 min，25%-40%A；16-22 min，40%-65%A；22-26 min，65%-75%A；26-27 min，75%-95%A。

質(zhì)譜分析采用Waters Xevo G2 Q-Tof 高分辨質(zhì)譜，配備電噴霧離子源（ESI），毛細(xì)管電壓正離子模式3.0 kV，負(fù)離子模式2kV。離子源溫度110℃，樣品錐孔電壓30V，錐孔氣流速50 L·h-1，氮?dú)饷摎鉁囟?50℃，脫氣流速800 L·h-1，掃描范圍50-2000m/z，內(nèi)參校準(zhǔn)液亮氨酸腦啡肽用于分子量實(shí)時(shí)校正。

2.6 數(shù)據(jù)處理

2.6.1 三七粉化學(xué)成分鑒定

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品參照、文獻(xiàn)檢索和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，對(duì)比分析正負(fù)模式下的MS、MS/MS 數(shù)據(jù)信息，結(jié)合保留時(shí)間、峰強(qiáng)度等對(duì)各色譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與確證，明確三七粉中所含的化學(xué)成分。

2.6.2 入血原型成分及代謝產(chǎn)物鑒定

通過(guò)比對(duì)三七粉樣品、大鼠給藥血漿及空白血漿樣品的色譜圖，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和文獻(xiàn)檢索，對(duì)比各色譜峰的MS、MS/MS 數(shù)據(jù)信息，對(duì)三七粉吸收入血的原型成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；進(jìn)一步分析原型成分的裂解規(guī)律，結(jié)合碎片離子的特征中性丟失，比對(duì)相關(guān)代謝產(chǎn)物的MS、MS/MS質(zhì)譜信息，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，明確體內(nèi)代謝途徑。

3 結(jié)果與分析

3.1 三七粉樣品分析

采用“2.5”項(xiàng)下優(yōu)化的條件，對(duì)三七粉樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)分析，正、負(fù)離子模式下，三七粉樣品及混合對(duì)照品的BPI 色譜圖（圖1-圖2）。按照“2.6.1”項(xiàng)下數(shù)據(jù)處理方法確定化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，對(duì)三七粉主要化學(xué)成分進(jìn)行表征，共鑒定得到54個(gè)化合物（表1），其中原人參二醇皂苷類(lèi)36 個(gè)，原人參三醇皂苷類(lèi)14 個(gè)，黃酮類(lèi)1個(gè)，糖類(lèi)1 個(gè)，氨基酸類(lèi)1 個(gè)和酯類(lèi)化合物1 個(gè)。

圖1 三七粉BPI色譜圖

圖2 混合對(duì)照品負(fù)離子模式BPI色譜圖

表1 三七粉化學(xué)成分LC-MS數(shù)據(jù)

3.1.1 皂苷類(lèi)

三七粉中皂苷類(lèi)化合物，結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖、鼠李糖等多個(gè)糖基取代，在質(zhì)譜中容易逐級(jí)丟失產(chǎn)生一系列特征碎片離子，進(jìn)一步斷裂C-17 支鏈取代烷基，形成84 Da的特征中性丟失[16]。

原人參二醇型皂苷類(lèi)化合物，以人參皂苷Rb1為例，其C-3 位和C-20 位羥基均有二糖取代，分別由兩分子葡萄糖2→1 位相連和兩分子葡萄糖6→1 位相連。在質(zhì)譜中分子離子[M-H]-m/z1107連續(xù)丟失四分子葡萄糖，形成m/z945、m/z783、m/z621 的碎片離子及m/z459 的原人參二醇型皂苷元離子，進(jìn)一步失去C-17 支鏈產(chǎn)生m/z375 的碎片離子，所得碎片信息與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致，MS/MS譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 人參皂苷Rb1的MS/MS譜圖

續(xù)表

原人參三醇型皂苷類(lèi)化合物，以三七皂苷R1為例，C-6 位羥基由一分子葡萄糖與一分子木糖2→1 位相連取代，C-20位羥基被一分子葡萄糖取代。在質(zhì)譜中，[M-H]-m/z931的分子離子連續(xù)丟失一分子木糖和兩分子葡萄糖，形成m/z799、m/z637 的碎片離子及m/z475 的原人參三醇型皂苷元離子，進(jìn)一步斷裂C-17烷基支鏈?zhǔn)?4 Da，產(chǎn)生m/z391的碎片離子所得，碎片信息與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致，MS/MS譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 三七皂苷R1的MS/MS譜圖

3.1.2 氨基酸類(lèi)

正離子模式下檢測(cè)到三七素[M+H]+m/z177 的分子離子，丟失一分子NH3和H2O 產(chǎn)生m/z160 和159 碎片離子，m/z159 碎片離子丟失一分子CO 產(chǎn)生m/z131碎片離子，m/z160碎片離子可發(fā)生重排并丟失一分子CO2產(chǎn)生m/z116 關(guān)鍵碎片離子，所得碎片信息與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致[21]，MS/MS譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 三七素的MS/MS譜圖

3.1.3 黃酮類(lèi)

正離子模式下檢測(cè)到槲皮素[M+H]+m/z303 的分子離子，可丟失一分子H2O 形成碎片m/z285 碎片離子，繼續(xù)丟失一個(gè)CO產(chǎn)生m/z257 碎片離子[22]，所得碎片信息與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致，MS/MS譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 槲皮素的MS/MS譜圖

3.2 三七粉血漿樣品分析

采用“2.5”項(xiàng)下優(yōu)化的條件，對(duì)三七粉、大鼠空白血漿及給藥血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，負(fù)、正離子模式下，三七粉、大鼠空白血漿和給藥血漿樣品的BPI色譜圖如圖7、圖8 所示。按照“2.6”項(xiàng)下數(shù)據(jù)處理方法確定化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，在給予三七粉的大鼠血漿中共鑒定得到14 個(gè)吸收原型藥物成分和4 個(gè)代謝物（表2-表3）。

圖7 負(fù)離子模式BPI色譜圖

圖8 正離子模式BPI色譜圖

表2 三七粉吸收入血原型成分LC-MS數(shù)據(jù)

表3 三七粉大鼠血漿代謝物L(fēng)C-MS數(shù)據(jù)

3.2.1 三七粉血漿樣品代謝物鑒定

吸收入血的原型藥物成分在體內(nèi)不同藥物代謝酶的作用下，經(jīng)過(guò)Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應(yīng)，原型成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和精確質(zhì)量數(shù)都會(huì)被改變。然而，絕大多數(shù)代謝物仍然保留了其原型的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)分析裂解規(guī)律來(lái)進(jìn)行代謝物的鑒定。

M1在負(fù)離子模式下產(chǎn)生[M-H]-m/z475的分子離子及m/z391 的碎片離子，形成84 Da 的特征中性丟失，被鑒定為原人參三醇。M2 的在質(zhì)譜圖中具有與M1 一致的裂解行為，但其分子離子[M-H]-m/z473 比M1小2 Da，推測(cè)為脫氫原人參三醇。

M3在負(fù)離子模式下顯示[M-H]-m/z459的分子離子，失去84 Da 產(chǎn)生了m/z375 的碎片離子，質(zhì)譜裂解行為與原人參二醇一致，因此被鑒定為原人參二醇。

M4 在質(zhì)譜圖中顯示[M+Na]+m/z645 的分子離子，正離子模式下丟失一分子葡糖糖和一分子水，產(chǎn)生[M+Na-glc-H2O]+m/z465 和[glc+H2O+Na]+m/z203 的碎片離子，經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)鑒定為人參皂苷C-K[23]。

4 討論

本研究中，采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 的技術(shù)方法，優(yōu)化液相色譜、質(zhì)譜分離檢測(cè)條件，建立三七粉指紋譜分析所含化學(xué)成分，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，分析其質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)果在三七粉樣品中共鑒定得到54 個(gè)化學(xué)成分，以皂苷類(lèi)化合物為主，包括原人參二醇皂苷類(lèi)36 個(gè)，原人參三醇皂苷類(lèi)14 個(gè)，黃酮類(lèi)1個(gè)，糖類(lèi)1個(gè)，氨基酸類(lèi)1個(gè)和酯類(lèi)化合物1個(gè)。

在三七粉化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立給藥血漿的血行指紋譜，通過(guò)比對(duì)三七粉、大鼠給藥血漿及空白血漿樣品的色譜圖，篩選分析血中移行的原型藥物成分及代謝物，結(jié)果在大鼠血漿中共鑒定得到18個(gè)三七粉相關(guān)的外源性化合物，包括14個(gè)吸收原型藥物成分和4個(gè)代謝物。吸收原型藥物成分中原人參三醇皂苷類(lèi)有6 個(gè)分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg2、人參皂苷F1；原人參二醇皂苷類(lèi)有6 個(gè)，分別為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷F2、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rk1、三七皂苷Fa；氨基酸類(lèi)成分有1個(gè)為三七素；黃酮類(lèi)成分有1 個(gè)，為槲皮素。代謝物中原人參二醇和人參皂苷C-K 來(lái)源于原人參二醇型皂苷；原人參三醇和脫氫原人參三醇來(lái)源于原人參三醇型皂苷[24]。在給藥大鼠血漿中檢測(cè)到的吸收原型成分及其代謝產(chǎn)物可能是三七粉潛在真正的活性成分，并與三七粉的藥理作用直接相關(guān)，為后期課題組進(jìn)行三七粉傳統(tǒng)功效的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，它們作為三七粉最終的“效應(yīng)成分”可作為其質(zhì)量標(biāo)志物的候選。