三七粉質量標志物研究＊

張鐵軍，郭海彪，許 浚，徐 旭，王德勤，韓彥琪，張洪兵，李楚源＊＊，劉昌孝

（1.天津藥物研究院/天津市中藥質量標志物重點實驗室 天津 300301；2.天津藥物研究院/中藥現(xiàn)代制劑與質量控制技術國家地方聯(lián)合工程實驗室 天津 300301；3.天津藥物研究院/釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室天津 300301；4.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣東 廣州 510515）

三七為常用大宗中藥材，來源于五加科人參屬植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根莖，性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，主要用于治療外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有止血、活血、抗炎、免疫調節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、增強記憶力等作用[2]。是具有“多重功效”的代表性中藥。三七粉作為三七市場應用的主要形式之一，對于三七粉的質量評判多參考《中國藥典》規(guī)定指標，三七粉的質量標準主要是測定其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及Rb1的含量[1]，不能全面反映三七粉的質量。并且，目前三七粉品牌眾多，缺少統(tǒng)一的三七粉質量標準，由于三七成粉后失去了傳統(tǒng)評價的性狀，給摻假的鑒別和質量評價帶來更多的難度。同時，不同于三七藥材，三七粉既可作為原料，又是臨床以單味使用的主要形式，加之使用人群的需求特點，都決定了三七粉質量研究與質量控制的重要意義。

中藥質量標志物（Q-Marker）是劉昌孝院士提出的中藥質量控制的新概念[3]，以中藥質量標志物“五要素”統(tǒng)領，更能保證中藥質量的“有效性”“特有性”“傳遞與溯源性”特點，反映中醫(yī)理論的本質內涵，更好地評價和控制中藥整體質量。本課題組根據中藥QMarkers 基本條件和原則[4-6]，對三七粉的化學物質組及其傳遞規(guī)律進行了系統(tǒng)辨識；應用網絡藥理學方法、體內、體外模型評價三七粉的活血化瘀、消腫定痛、止血作用及作用機理，明確其藥效物質基礎；進一步結合成分特有性分析，確定三七粉的質量標志物。在此基礎上，建立了基于三七粉質量標志物的“一測多評”多指標含量測定和指紋圖譜方法，為優(yōu)質三七粉的質量標準制定及原料藥材的選擇提供科學依據。

1 三七粉質量標志物發(fā)現(xiàn)研究

1.1 化學物質組系統(tǒng)辨識及傳遞規(guī)律

中藥以口服用藥的形式通過藥物體內傳輸發(fā)揮臨床療效，其功效是化學物質基礎經過質量傳遞和代謝轉化后生物效應的綜合體現(xiàn)[6]。因此，從中藥的有效性角度認識和評價其質量，必須明確體外化學成分組-體內血行成分組的傳遞-轉化過程，能為中藥藥效物質基礎的傳遞過程提供清晰的路徑，也是深入開展其分子作用機制研究的重要依據[7-8]。三七化學成分的辨識及三七皂苷的代謝轉化研究已有報道[9-14]，三七粉為三七藥材經粉碎加工而成，目前缺乏三七粉化學物質組及其口服后體內血行成分組的表征。本研究運用超高液相色譜-電噴霧/四級桿飛行時間串聯(lián)質譜聯(lián)用技術（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）對三七粉所含化學成分進行了全面分析；建立口服給藥血漿的血行成分分析方法，分析三七粉口服給藥血中移行的原型藥物成分及代謝物，明確體外化學成分組-體內血行成分組的藥效物質基礎傳遞-轉化過程，為三七粉的質量標志物確定與全面質量控制提供依據，也為其深入分子作用機制研究奠定基礎。

經與標準品和文獻數(shù)據比對，分析其質譜裂解規(guī)律，結果在三七粉樣品中共鑒定得到54 個化學成分，以皂苷類化合物為主，包括原人參二醇皂苷類36 個，原人參三醇皂苷類14 個，黃酮類1 個，糖類1 個，氨基酸類1 個和酯類化合物1 個。通過比對三七粉、大鼠給藥血漿及空白血漿樣品的色譜圖，篩選分析血中移行的原型藥物成分及代謝物，結果在大鼠血漿中共鑒定得到18 個三七粉相關的外源性化合物，包括14 個吸收原型藥物成分（原人參二醇皂苷類6個，原人參三醇皂苷類6 個，黃酮類1 個，氨基酸類1 個）和4 個代謝物（2 個來源于原人參二醇皂苷類，2 個來源于原人參三醇皂苷類），它們可能是三七粉潛在真正的活性成分，并與三七粉的藥理作用直接相關。另外，從質量傳遞與溯源的角度，血中的效應成分是質量傳遞體系的最終環(huán)節(jié)[4]，可為后期三七粉質量標志物的確定提供重要依據。

1.2 有效性的系統(tǒng)表達及藥效物質基礎及質量標志物發(fā)現(xiàn)研究

傳統(tǒng)功效（功能主治）是中藥有效性的概括，也是臨床用藥的依據。Q-marker 作為評價和控制中藥有效性的主要指標，須與有效性相結合?！吨袊幍洹?020 版一部收錄三七具有散瘀止血，消腫止痛的功效。用于咯血，吐血，便血，崩漏，外傷出血，胸腹刺痛，跌撲腫痛。本課題組首先選取了三七中12個入血成分，應用網絡藥理學方法，分析其作用靶點和信號通路，并進行蛋白間相互作用（PPI）分析以及生物信息學（GO）分析，構建“化合物-靶點-信號通路-藥理作用-功效”網絡來揭示三七活血止血，消腫止痛的多靶點、多通路協(xié)同作用機制。在此基礎上，采用CoCl2制備心肌細胞（H9C2）損傷模型，通過觀察三七主要成分對心肌細胞成活率、LDH、MDA、SOD 的影響；采用H2O2制備人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）損傷模型，通過觀察三七主要成分對內皮細胞存活率、LDH、ACP 的影響，評價其血管保護作用并確定物質基礎；采集家兔血漿，采用體外TT、APTT、PT、FIB 檢測試劑盒觀察三七主要成分對凝血系統(tǒng)的影響評價其活血化瘀作用并確定其藥效物質基礎；采用小鼠醋酸扭體實驗和采用LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型，評價其消腫定痛作用并確定物質基礎；采用體外模型，通過觀察TT、APTT、PT、FIB等凝血指標、血小板聚集率、對血管平滑肌的影響，評價其止血作用并確定止血的藥效物質基礎。

1.2.1 基于網絡藥理學的三七粉傳統(tǒng)功效作用機制預測分析[15]

為了探索三七活血止血，消腫止痛傳統(tǒng)功效的網絡調控機制。本課題組首先選取了三七粉中12 個入血成分為研究對象，依據反向分子對接的方法預測化合物靶點，借助String 10 數(shù)據庫與Omicsbean 在線分析軟件對靶點進行信號通路分析、基因本體（gene ontology,GO）功能富集分析，最后利用Cytoscape 軟件構建網絡藥理圖。結果顯示：12個化合物可通過65個相關靶點作用于65條信號通路，主要涉及抑制血栓生成、纖溶、血管新生、舒張血管、凝血、抗炎以及鎮(zhèn)痛等方面，進一步得到三七“化合物-靶點-通路-藥理作用-功效”的網絡圖。

根據網絡藥理學預測并結合文獻分析，人參皂苷Re 與Rk1分別通過增加胞內環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平[16]和下調環(huán)氧酶（COX）的活性[17]來抑制血小板聚集，進而阻礙血栓形成。三七皂苷R1[18]、人 參皂 苷Rg1[19]、Re[16]、Rg3[20]、Rb1[21-22]、槲皮素[23]等化合物可增加內皮一氧化氮（NO）水平，舒張血管，緩解血栓形成。另外，三七皂苷R1[24]、人參皂苷Rg1[19]、Rg3[25]、Rb1[26]、Re[27]等能夠增加血管內皮生長因子（VEGF）的表達，促進血管新生，保護血管內皮；三七素可作用于凝血酶（F2）、凝血因子X（F10）等蛋白，激活凝血因子，使血液凝固；還能使血小板發(fā)生伸展偽足、聚集、變形，從而誘導釋放腺苷二磷酸（ADP）、血小板因子和Ca2+等物質，縮短凝血時間，增加血小板數(shù)目，達到止血的效果；并且能通過降低血漿NO 水平以及增益組織胺來增 強 血 管 收 縮[28-29]；三 七 皂 苷R1[30]、人 參 皂 苷Rg1[31]、Re[32-33]、Rk1[34]、Rg3[20]、槲皮素[35]等可作用于IL-1β、IL-6等相關蛋白，下調炎癥因子的表達，抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路，從而減輕炎癥狀態(tài)，抑制炎性水腫。人參皂苷Rb1[36]、Rd[37]、Rh1[38-39]、Rk1[40]等作用于COX-2、前列腺素E 合成酶（PTGES）等蛋白，抑制前列腺素的合成，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rb1、F2、Rg3、Rd[34]等化合物可激活阿片受體發(fā)揮中樞神經鎮(zhèn)痛作用。

1.2.2 基于活血作用的三七質量標志物研究

為了研究和確定三七活血作用的質量標志物。本課題組采用體外TT、APTT、PT、FIB檢測試劑盒觀察三七主要成分對凝血系統(tǒng)的影響；收集家兔富含血小板血漿，以ADP 誘導血小板聚集，觀察三七主要成分對血小板聚集率的影響；取家兔主動脈條，置于體外組織灌流系統(tǒng)中，以去氧腎上腺素誘導血管條收縮，觀察三七主要成分對血管平滑肌收縮功能的影響。結果顯示：人參皂苷F2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rk1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg2，可顯著延長TT（P＜0.05，P＜0.01）；人參皂苷F2、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb1、槲皮素在可延長APTT（P＜0.05）；人參皂苷Re、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rb3，可顯著延長PT（P＜0.05）；槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、三七皂苷R1、人參皂苷Rg2可顯著降低血漿FIB 含量（P＜0.05）；人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb2、三七皂苷R1、人參皂苷Rg2、人參皂苷F2、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1可顯著降低ADP誘導的血小板聚集（P＜0.05）；人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rk1、三七皂苷R1和人參皂苷Rg2可明顯擴張血管動脈條（P＜0.05，P＜0.01）。

綜上所述，三七活血作用表現(xiàn)在抗凝、抗血小板聚集、擴血管等方面，通過抗凝、抗血小板作用來防止血栓形成；通過擴張血管增加血流量。上述結果提示：三七可通過改善血液流變學性質、血液凝聚狀態(tài)以及血流動力學從而發(fā)揮其活血散瘀作用，用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病以及外傷瘀血腫痛等疾病，其主要活性成分包括槲皮素、三七皂苷R1、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg1，人參皂苷Rg2，人參皂苷F2人參皂苷Rg3、人參皂苷Rd等。

1.2.3 基于心血管保護作用的三七質量標志物研究

三七常用于心腦血管疾病，心肌、血管的保護作用是該類藥物發(fā)揮臨床功效的主要作用機制。本課題組采用CoCl2 制備心肌細胞（H9C2）損傷模型，觀察三七主要成分對心肌細胞成活率、LDH、MDA、SOD 的影響；采用H2O2 制備人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）損傷模型，觀察三七主要成分對內皮細胞存活率、LDH、ACP 的影響。結果顯示：人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rd、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素能夠顯著增加H9C2 細胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），多個成分能夠減少LDH、MDA，增加SOD；三七皂苷R1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素可顯著提高HUVEC 細胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），多個成分能夠減少LDH、ACP。表明人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rd、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素是三七發(fā)揮心臟保護作用的物質基礎；三七皂苷R1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、槲皮素、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh1、三七素是三七發(fā)揮血管保護作用的物質基礎。

1.2.4 基于消腫定痛作用的三七超微粉質量標志物研究

三七常用于跌打損傷，具有消腫定痛作用。本課題組采用小鼠醋酸扭體模型評價三七超微粉和三七總皂苷的鎮(zhèn)痛效果。研究發(fā)現(xiàn)，三七超微粉可劑量依賴性的降低醋酸誘導的小鼠疼痛反應，表現(xiàn)在降低小鼠的扭體產生次數(shù)。三七總皂苷為三七中富含皂苷成分的提取物，也可以劑量依賴性的降低小鼠扭體次數(shù)，表明三七總皂苷為三七鎮(zhèn)痛的有效部位。進一步以LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型對三七總皂苷及14個關鍵化學成分（包括原人參三醇型：三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1；原人參二醇型：人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1；黃酮類：槲皮素以及氨基酸類：三七素）進行了體外抗炎活性評價。結果顯示：三七總皂苷及14 個化合物能顯著降低LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中NO、TNF-α 和IL-6 的含量，顯示較好的抗炎效果，推測以上14個化合物可能為三七超微粉發(fā)揮消腫定痛作用的關鍵藥效物質基礎。

1.2.5 基于止血作用的三七質量標志物研究

三七具有止血作用，但其止血作用的物質基礎未見系統(tǒng)研究。本課題組為全面表征三七的質量屬性，確定其質量標志物，對其止血作用的物質基礎進行了研究。網絡藥理學研究表明：三七素可作用于凝血酶（F2）、凝血因子X（F10）等蛋白，激活凝血因子，使血液凝固；還能使血小板發(fā)生伸展偽足、聚集、變形，從而誘導釋放腺苷二磷酸（ADP）、血小板因子和Ca2+等物質，縮短凝血時間，增加血小板數(shù)目，達到止血的效果；并且能通過降低血漿NO 水平以及增益組織胺來增強血管收縮[27-28]。本課題組在此基礎上，進一步進行驗證研究。在兔血漿中分別加入三七素樣品，采用凝血記錄儀，依據試劑盒說明書，測定TT、APTT、PT、FIB；在兔富含血小板血漿中加入三七素藥物樣品后，再加入誘導劑ADP，采用比濁法，測定血小板聚集率；取離體兔主動脈條，體外組織灌流，以去氧腎上腺素誘導動脈條收縮，分別加入三七素、人參皂苷Rb2，觀察血管條張力變化值。結果顯示：三七素500-1000 μM 是可顯著降低血漿TT、APTT，100-1000 μM 顯著縮 短 血 漿PT，50-2000 μM 可 顯 著 增 加FIB 含 量；1000-2000 μM 時可顯著增加血小板聚集率；三七素1 μM 濃度時，人參皂苷Rb2在25 μM 濃度時可顯著收縮血管動脈條。表明三七素是三七促凝、促血小板聚集發(fā)揮止血作用的物質基礎；三七素、人參皂苷Rb2 是三七縮血管發(fā)揮止血作用的物質基礎。

1.3 化學成分的特有性分析

上文研究明確了三七化學物質組及其傳遞規(guī)律，并根據該藥的散瘀止血、消腫定痛功效，對其藥效物質基礎及作用機理進行了系統(tǒng)闡釋，為該藥的質量標志物的確定奠定了基礎。按照質量標志物的定義和確定原則，“特有性”是重要因素，三七與人參、西洋參等著名藥材均來源于五加科人參屬植物，但功效迥異。成分特有性是功效差異的物質基礎，是質量評價的重要依據。

三七來源于五加科人參屬PanaxL.，人參屬植物主要分布于北美洲東部和亞洲東部，在中國有6個種，3個變種，多數(shù)分布于東北、云南、四川、廣西、江西、陜西等地。人參屬植物發(fā)源于第三世紀古熱帶山區(qū)，屬東亞-北美間斷分布的植物區(qū)系成分，該屬植物的現(xiàn)代分布中心從東喜馬拉雅至我國西南地區(qū)，特別是云南西北部則是以假人參Panax pseudoginsengWall.和竹節(jié)參Panax japonicus(T.Nees) C.A.Mey.為核心的近代分化中心，隨著海拔和緯度的變化分化出多種內變異類型。

結合形態(tài)特征及化學成分，人參屬劃分為兩大類群：第一類群被認為是古老類群，典型植物有人參Panax ginsengC.A.Mey、西洋參Panax quinquefoliusL.、三七；第二類群被認為是進化的類群，典型植物有竹節(jié)參、姜狀三七。假人參在形態(tài)上屬于第一類群，但在化學成分上與第二類群相一致，是過渡類群。

有文獻提出[41]，人參屬古老類群的特征性成分組包括：（1）氨基酸-三七素；（2）以達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷為主的皂苷成分。其中三七素、皂苷類成分是三七主要活性成分，且皂苷類成分含量較高。

三七皂苷類成分主要為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1等達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷。目前，達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷的生物合成途徑已有初步的認識，研究認為植物達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷主要通過乙酸/甲羥戊酸途徑[42]（MVA pathway）（圖1）。一般可分為3個階段：①合成異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）；②由異戊烯基轉移酶和萜類環(huán)化酶催化IPP 和DMAPP 形成2,3-氧化鯊烯；③2,3-氧化鯊烯依次經過環(huán)化、羥基化、糖基化修飾后最終形成三萜類皂苷，但糖基化步驟仍有待鑒定。從成分的特異性分析來看，三七中的四環(huán)三萜皂苷類成分處于生源途徑的下游位置，特異性較強，三七特有的皂苷類成分有三七皂苷R1、R2、R4、R6等。

圖1 三七達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷生物合成途徑

綜上所述，通過對三七分的化學物質組及口服血行成分的系統(tǒng)辨識、活血、止血及消腫止痛藥效物質基礎的研究，并結合成分特有性分析，確定三七粉的質量標志物為：三七素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd。

2 基于質量標志物的三七粉質量標準提升研究

目前，《中國藥典》2020 年版三七（三七粉）項下僅規(guī)定了人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量要求，不能全面評價和控制其散瘀止血、消腫定痛的功效。為了建立科學的質量評價和質量控制方法，全面評價三七粉的整體質量，本課題組通過系統(tǒng)研究，確定了三七素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd 為三七粉的質量標志物，在此基礎上，采用“一測多評”等分析方法，對三七素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd 進行含量測定，對不同三七粉及不同商品規(guī)格原料藥材進行質量標志物差異分析。建立指紋圖譜，采用新的相似度計算模型-等同系數(shù)法和模式識別對三七粉及原料藥材進行質量一致性評價。結果顯示：三七素為廣州白云山和記黃埔三七粉的優(yōu)勢指標，原料藥材中三七素和皂苷含量與頭數(shù)關系不大，但與季節(jié)、部位具有相關性進一步結合化學模式識別實現(xiàn)了不同規(guī)格原料藥材的區(qū)分。

本課題建立的含量測定及指紋圖譜方法穩(wěn)定可行，專屬性強，具有較強創(chuàng)新性，對于控制三七粉質量具有顯著意義。與2020年版《中國藥典》相比，該文修訂了三七粉含量測定項，增加了HPLC 指紋圖譜項，可為優(yōu)質三七粉的質量標準制定及其原料藥材的選擇提供科學依據。

3 討論

3.1 “多重功效”是中藥有效性表達的普遍現(xiàn)象，表現(xiàn)為“一物多效”“一物多性”。

這是由中藥的復雜的化學物質基礎所決定的。也為中藥臨證配伍提供了更多的靈活性。同一藥材針對不同疾病可發(fā)揮不同的療效，同一藥味在不同方劑中可以起到不同的作用。從疾病的生物學角度，外源性藥物成分亦存在“有故無殞”“補之不足、損其有余”的規(guī)律。中藥質量評價是對其有效性的系統(tǒng)表征，應對其“多重功效”進行系統(tǒng)表達，評價和控制整體質量。

3.2 三七具有典型的“多重功效”，既可活血、又能止血，還有消腫定痛的作用。

現(xiàn)行標準中僅規(guī)定了人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量要求，難以反映其“多重功效”的特點。本課題組研究在闡明三七粉活血和心肌、血管保護作用的物質基礎上，又發(fā)現(xiàn)：三七素是其止血作用的主要藥效物質基礎；三七粉中原人參三醇型成分三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1；原人參二醇型成分人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷F2、人參皂苷Rk1；黃酮類成分槲皮素以及氨基酸類成分三七素為其消腫定痛的藥效物質基礎。

3.3 成分的“可測性”是建立質量評價和質量控制方法的必要條件。

本課題組在確定質量標志物的基礎上，建立了“一測多評”等分析方法，對三七素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd 進行含量測定。建立了三七粉的指紋圖譜，對其質量標準進行了提升。并對不同入藥部位、不同采收時間、不同商品規(guī)格的多批次三七樣品進行測定，為三七分質量評價提供了實驗證據。

本課題組基于三七粉有效性完整表達、化學物質組的傳遞與溯源以及成分特有性分析等方面的系統(tǒng)研究，確定了三七粉的質量標志物，進步建立基于質量標志物的多指標成分含量測定及指紋圖譜方法，為其質量評價和質量控制提供了理論與實驗證據。