井穴放血減輕全身炎癥反應(yīng)防治大鼠心臟驟停后腦損傷

鐘曉芃,郭義

(1.天津市人民醫(yī)院,天津 300121;2.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617)

隨著診療技術(shù)的提高,心臟驟?；颊叩玫搅撕芎玫木戎蝃1]。但是部分患者雖然恢復(fù)了心跳、呼吸和血壓,往往遺留神經(jīng)功能障礙,甚至昏迷及腦死亡,被稱為心肺復(fù)蘇后腦損傷[2],嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,并造成巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)[3],因此目前更加重視復(fù)蘇后神經(jīng)功能的保護(hù)[4]。亞低溫作為目前唯一推薦的治療手段[5],技術(shù)復(fù)雜不便于推廣[6]。

十二井穴刺絡(luò)放血用于急救在我國(guó)有著悠久的歷史,其簡(jiǎn)捷、高效,長(zhǎng)于院外急救、自救及他救,彌補(bǔ)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不足。明代朱權(quán)所撰《乾坤生意》:“凡中風(fēng)跌倒,卒暴昏沉、痰涎壅滯、不省人事、牙關(guān)緊閉、藥水不下,急以三棱針,刺手十指十二井穴,當(dāng)去惡血,治一切暴死惡候,不省人事,及絞腸痧,乃起死回生妙訣”,現(xiàn)代研究中也發(fā)現(xiàn)該療法對(duì)于卒中[7-8]、顱腦外傷[9]及一氧化碳中毒[10]造成的神經(jīng)功能障礙有著良好的治療作用。

然而手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)心肺復(fù)蘇后腦損傷是否有治療作用尚未見報(bào)道。本研究觀察了手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)于心臟驟停復(fù)蘇后大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分及大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死凋亡的干預(yù)作用,及其對(duì)血清白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)水平的調(diào)節(jié),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠18只,體質(zhì)量(340±50)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于天津易生源生物科技有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度18～22 ℃,濕度50%～60%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批同意。18只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和井穴組3組,每組6只。

1.2 主要試劑與儀器

腎上腺素(天津金耀藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H12020526),大鼠IL-6 ELISA酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(宸功生物, CGE20064),大鼠TNF-α ELISA酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(Peprotech, 315-01A),原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(ROCHE, 11684817910),光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11)。

1.3 造模方法

大鼠誘導(dǎo)心臟驟停及心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation, CPR)方法依照Utstein動(dòng)物CPR實(shí)驗(yàn)指南[11]。SD大鼠術(shù)前禁食但不禁水,戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔內(nèi)麻醉,備皮,仰臥位固定。經(jīng)口直視插入14號(hào)氣管鞘管。左股動(dòng)脈置入23號(hào)PE-50聚乙烯管,并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓,心電圖和直腸溫度。手術(shù)完成后,待大鼠生理參數(shù)穩(wěn)定開始夾閉氣管插管,觀察大鼠呼吸、心搏和血壓,心搏停止以動(dòng)脈收縮壓＜20 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)作為心臟驟停標(biāo)準(zhǔn)。心搏驟停后開始進(jìn)行心肺復(fù)蘇,頻率為 200次/min的胸外按壓和100次/min的同步機(jī)械通氣,按壓深度為胸廓前后徑的1/3,吸入氧濃度100%。按壓2 min后,予腎上腺素0.025 mg/kg靜脈注射,持續(xù)按壓通氣10 min,期間如出現(xiàn)室顫,立即給予 2J的雙向波除顫,如自主循環(huán)恢復(fù)(restoration of spontaneous circulation, ROSC)則停止按壓,10 min未恢復(fù)自主循環(huán)宣布復(fù)蘇失敗。ROSC定義為恢復(fù)室上性心律,平均動(dòng)脈壓(MAP)＞60 mmHg,維持5 min以上。復(fù)蘇成功的動(dòng)物連續(xù)監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué) 1 h,術(shù)畢拔除所有插管,蘇醒后放回籠中飼養(yǎng),使用自制保溫設(shè)備使動(dòng)物肛溫保持在 36.5 ℃左右。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組只行氣管插管,不誘導(dǎo)心臟驟停和 CPR;模型組采用氣管夾閉窒息法誘導(dǎo)心臟驟停后進(jìn)行常規(guī)CPR;井穴組采用氣管夾閉窒息法誘導(dǎo)心臟驟停后進(jìn)行常規(guī)CPR,復(fù)蘇后1 h、24 h、48 h進(jìn)行前肢十二井穴放血。十二井穴放血參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]在心肺復(fù)蘇后腦損傷模型建立后1 h后,將采血針垂直插入皮膚,兩側(cè)取穴的末端深度為 1 mm,以少商、商陽(yáng)、中沖、關(guān)沖、少?zèng)_、少澤的順序。參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]動(dòng)物腧穴定位及既往文獻(xiàn)[9],每個(gè)穴位分別擠壓3～5次,出血量為 15～20 μL。假手術(shù)組和模型組的大鼠以相同的強(qiáng)度抓握,而穴位不刺血。

1.5 樣本采集

復(fù)蘇后6 h、24 h、48 h、72 h經(jīng)鼠尾靜脈取血0.5 mL,置4 ℃ 1 500 r/min離心15 min,分離血清,-20 ℃冰箱保存待測(cè)。72 h后迅速斷頭取腦,剝離左右大腦半球,常規(guī)脫水石蠟包埋,切片至出現(xiàn)海馬組織,每隔5張留取1張。

1.6 觀測(cè)指標(biāo)

1.6.1 血壓和平均動(dòng)脈壓檢測(cè)

左股動(dòng)脈置入 23號(hào) PE-50聚乙烯管,并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓和心率。

1.6.2 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分

在大鼠復(fù)蘇后6 h、24 h、48 h及72 h被處死之前進(jìn)行評(píng)估。神經(jīng)缺陷評(píng)分范圍為0～80(80表示正常大腦功能),是基于喚醒,神經(jīng)系統(tǒng)反射,運(yùn)動(dòng)功能和簡(jiǎn)單行為反射的測(cè)試。每組大鼠根據(jù)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分表獨(dú)立評(píng)分,取平均值,獲得最終的神經(jīng)缺陷分?jǐn)?shù)[13]。

1.6.3 尼氏染色

將 5 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟。用移液器在組織上滴加適量尼氏染液,染色8 min,ddH2O溶液洗滌2次,每次 30 s。再將切片分別置于 95%乙醇溶液Ⅰ、95%乙醇溶液Ⅱ、二甲苯溶液Ⅰ、二甲苯溶液Ⅱ中脫水透明,最后滴加中性樹膠,用蓋玻片封片。待自然風(fēng)干后在光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.6.4 TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡

取海馬組織使用4%甲醛溶液固定24 h,石蠟包埋,切片,按照原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書行 TUNEL檢測(cè)。每組大鼠取6張切片,顯微鏡下觀察大腦皮層神經(jīng)元的形態(tài),胞核成深棕色的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞,根據(jù)SOSLOW RA[14]方法計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.6.5 血清IL-6、TNF-α水平檢測(cè)

血液自然凝固后以3 000 r/min離心10 min,取上清液,-20 ℃冷藏。采用ELISA法檢測(cè)血清IL-6、TNF-α水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行操作,最后用普朗 DNM-9602酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè),以空白孔調(diào)零,450 nm波長(zhǎng)測(cè)每孔OD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,對(duì)于不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析,其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(OneWay-ANOVA),組間兩兩比較采用Tukey's檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心率和平均動(dòng)脈壓的改變

復(fù)蘇前 3組大鼠心率及平均動(dòng)脈壓比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。復(fù)蘇后6 h、24 h、48 h與假手術(shù)組比較,模型組和井穴組大鼠心率和平均動(dòng)脈壓均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),至復(fù)蘇后 72 h與假手術(shù)組比較,井穴組平均動(dòng)脈壓比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),與模型組比較,井穴組平均動(dòng)脈壓升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心率和平均動(dòng)脈壓水平比較 (±s)

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心率和平均動(dòng)脈壓水平比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較 1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

項(xiàng)目 組別 n 復(fù)蘇前 6 h 24 h心率(次/分)假手術(shù)組 6 317.33±11.81 343.83±17.82 342.67±14.27模型組 6 335.67±15.46 194.50±13.171) 219.67±15.111)井穴組 6 338.17±13.53 213.67±10.231) 250.00±12.151)2)平均動(dòng)脈壓(mmHg)假手術(shù)組 6 106.67±9.18 104.17±8.68 104.00±8.12模型組 6 104.67±7.20 71.67±7.841) 80.17±11.021)井穴組 6 106.33±9.37 86.50±4.371) 90.33±4.381)48 h 72 h 334.50±20.36 333.67±11.47 252.00±15.521) 274.00±19.781)261.67±14.401) 288.67±11.271)101.50±9.14 105.00±8.32 83.33±9.071) 90.00±2.371)90.67±4.321) 105.17±7.332)

2.2 3組大鼠神經(jīng)缺陷分?jǐn)?shù)的變化

復(fù)蘇前各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。復(fù)蘇后與假手術(shù)組比較,模型組和井穴組經(jīng)功能缺陷評(píng)分均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中6 h最為明顯,至72 h與假手術(shù)組比較,井穴組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而模型組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠復(fù)蘇不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分水平比較 (±s,分)

表2 3組大鼠復(fù)蘇不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分水平比較 (±s,分)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 復(fù)蘇前 6 h 24 h 48 h 72 h假手術(shù)組 6 77.75±1.08 78.00±0.71 78.25±0.82 78.00±0.89 78.33±1.17模型組 6 78.25±0.76 29.83±3.721) 41.83±3.371) 48.33±5.791) 58.17±2.111)井穴組 6 78.00±1.14 33.25±2.141) 45.83±1.371)2) 56.7±2.701)2) 74.58±5.302)

2.3 3組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞尼氏染色觀察

甲苯胺藍(lán)染色顯示,假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見深藍(lán)色斑塊狀或虎斑樣尼氏體,細(xì)胞核大,核仁明顯;模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體固縮壞死,溶解、液化后形成空泡樣結(jié)構(gòu);與模型組比較,井穴組大鼠腦組織神經(jīng)元水腫較輕,神經(jīng)元形態(tài)較好,僅見少量空泡樣改變,有部分神經(jīng)元細(xì)胞核腫大,核仁消失。詳見圖1。

圖1 3組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞尼氏染色觀察(×400)

2.4 3組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

復(fù)蘇72 h后與假手術(shù)組比較,模型組和井穴組凋亡指數(shù)顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,井穴組凋亡指數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 3組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況觀察(TUNEL法染色,×400)

圖3 3組大鼠凋亡指數(shù)比較

2.5 3組大鼠復(fù)蘇不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6、TNF-α水平比較

隨著復(fù)蘇時(shí)間延長(zhǎng),模型組和井穴組血清 IL-6、TNF-α水平均呈先升高后降低的趨勢(shì),IL-6于復(fù)蘇后24 h達(dá)峰值,TNF-α于復(fù)蘇后 48 h達(dá)峰值,復(fù)蘇后72 h均降低。自復(fù)蘇后6 h開始,與假手術(shù)組比較,模型組和井穴組血清IL-6、TNF-α水平顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較,井穴組血清IL-6于復(fù)蘇后24 h、72 h,血清TNF-α于復(fù)蘇后24 h、48 h、72 h均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),兩組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)血清 IL-6、TNF-α均未恢復(fù)到正常水平。詳見表3。

表3 3組大鼠復(fù)蘇不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6和TNF-α水平比較 (±s, ng/L)

表3 3組大鼠復(fù)蘇不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6和TNF-α水平比較 (±s, ng/L)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

項(xiàng)目 n 組別 復(fù)蘇前 6 h 24 h 48 h 72 h IL-6 6 假手術(shù)組 20.98±0.99 20.94±1.02 21.64±0.87 21.70±0.95 21.78±1.37 6 模型組 20.94±1.02 63.57±4.161) 94.94±6.421) 80.79±3.291) 70.97±3.801)6 井穴組 21.00±2.23 62.50±3.231) 86.05±9.551)2) 75.78±6.881) 62.1±10.131)2)TNF-α 6 假手術(shù)組 19.21±2.00 18.32±1.39 18.65±2.02 17.41±1.68 17.48±2.31 6 模型組 17.50±1.23 47.50±2.511) 58.90±2.231) 88.82±2.111) 68.65±4.241)6 井穴組 17.93±2.39 43.19±3.411) 50.86±5.591)2) 77.68±8.411)2) 61.85±8.021)2)

3 討論

《醫(yī)宗金鑒》指出:“商陽(yáng)主刺卒中風(fēng),暴仆昏沉痰涎壅,少商、中沖、關(guān)沖、少澤、商陽(yáng),使氣血流行,乃起死回生救急之妙穴?！毙呐K驟停在中醫(yī)學(xué)屬于“厥癥”范疇,基本病機(jī)為氣血陰陽(yáng)不相順接,陰陽(yáng)離絕[15]。經(jīng)心肺復(fù)蘇呼吸循環(huán)恢復(fù)后患者氣血陰陽(yáng)初復(fù),氣血運(yùn)行無力,易出現(xiàn)瘀血痰濁上蒙清竅,故仍昏迷不醒。《靈樞·九針十二原》:“病在臟者,取之井。”手十二井穴位于手三陰三陽(yáng)經(jīng)交匯處刺絡(luò)放血可調(diào)整陰陽(yáng),開竅醒神[16]。此時(shí)應(yīng)用手十二井穴刺絡(luò)放血可續(xù)接陰陽(yáng),活血祛瘀,化痰開竅,促進(jìn)患者蘇醒,神經(jīng)功能恢復(fù)。

本研究采用經(jīng)典窒息法[17]誘導(dǎo)心跳驟停,制作復(fù)蘇后腦損傷動(dòng)物模型,與假手術(shù)組相比模型組心率及血壓降低、神經(jīng)功能評(píng)分減少、大腦海馬區(qū)凋亡細(xì)胞明顯增多,尼氏染色顯示海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞壞死溶解液化明顯增多,提示造模成功。而手十二井穴刺絡(luò)放血組與模型組比較心率及血壓升高、神經(jīng)功能評(píng)分增高,大腦海馬區(qū)尼氏染色顯示神經(jīng)元細(xì)胞壞死溶解液化減少,TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞明顯減少,提示手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)復(fù)蘇后腦損傷有明顯的防治作用。

研究表明心跳驟停復(fù)蘇成功后,機(jī)體經(jīng)歷了缺血再灌注過程,復(fù)蘇后全身各臟器的再灌注損傷產(chǎn)生大量氧自由基、乳酸、花生四烯酸的代謝產(chǎn)物等炎性介質(zhì),導(dǎo)致全身的炎癥反應(yīng)[18-19],心臟驟停1 h后,血液中細(xì)胞因子 IL-6和 TNF-α?xí)杆偕遊20-22]。TNF-α可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素和次級(jí)炎癥介質(zhì)的合成,高表達(dá)時(shí)會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)毒性[23-24],IL-6可引起神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[25],引起中樞神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡[26],有研究表明手十二井穴刺絡(luò)放血可調(diào)節(jié)患者血清 IL-6、TNF-α水平治療丘腦梗死神經(jīng)后遺癥[27-28]。本研究結(jié)果提示,大鼠心跳驟停復(fù)蘇后6 h、24 h、48 h、72 h時(shí)血液中細(xì)胞因子IL-6和TNF-α與假手術(shù)組相比明顯升高。其中6 h升高最為明顯,與之對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分也最低。而井穴組與模型組相比,血清IL-6和TNF-α水平減少,海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞減少,神經(jīng)功能恢復(fù)較好,且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這表明手十二井穴刺絡(luò)放血能夠減少炎性細(xì)胞因子的升高,減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,改善心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能障礙。因此本研究認(rèn)為減輕心臟驟停后機(jī)體炎癥反應(yīng)可能是手十二井穴刺絡(luò)放血防治復(fù)蘇后腦損傷的機(jī)制之一。