與胰腺癌免疫預(yù)后相關(guān)的自噬相關(guān)基因預(yù)測(cè)

蘇澤瑩，劉倩，曾顯容，黃婕，陳斯?jié)桑?

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.腫瘤科；2.廣東省食管癌精準(zhǔn)治療工程技術(shù)研究中心；3.科學(xué)研究中心，廣東廣州510080）

胰腺癌是一種惡性程度很高、診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤。其中最常見的是胰腺導(dǎo)管腺癌。大多數(shù)胰腺癌患者在診斷時(shí)即為晚期，且5 年生存率更是低至3%～5%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[1]。因此，確定預(yù)后標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)對(duì)于改善預(yù)后和提高療效顯得極為重要。最近研究表明，胰腺癌具有較高的自噬水平，其腫瘤的生長(zhǎng)依賴于自噬[2?3]。

自噬是依賴于溶酶體降解受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的一種重要生物過程[4]，在腫瘤的缺氧區(qū)，自噬活性的增加可以促使腫瘤細(xì)胞在各種應(yīng)激因素（如營(yíng)養(yǎng)和缺氧剝奪）下存活，且大多數(shù)自噬相關(guān)基因（ARGs）的表達(dá)隨著自噬活性的增加而上調(diào)。目前，部分自噬基因已被證實(shí)為癌癥的預(yù)測(cè)因子。一項(xiàng)關(guān)于300名接受根治性切除的肝癌患者的組織芯片研究發(fā)現(xiàn)在（抗凋亡基因）Bcl?xl+組中，自噬基因Beclin1的表達(dá)與無瘤生存期（DFS，P＜0.000 1）和總生存期（OS，P＜0.000 1）顯著相關(guān)；多因素和單因素分析顯示Beclin1表達(dá)是Bcl?xl+患者DFS和OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[5]。另一項(xiàng)關(guān)于190 例肝癌組織中自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)c3的表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)Lc3的表達(dá)與腫瘤的TNM、BCLC 分期和Edmonson?Steiner 分級(jí)無關(guān)，而與較長(zhǎng)的總生存期（OS）（P=0.039）及較長(zhǎng)的復(fù)發(fā)時(shí)間（TTR）相關(guān)（P=0.068）；多因素分析顯示，Lc3表達(dá)是影響OS（HR，0.42；95%CI：0.22～0.80；P=0.009）和TTR（HR，0.54；95%CI：0.33～0.9；P=0.017）的獨(dú)立預(yù)后因素[6]。除對(duì)自噬因子在腫瘤中的預(yù)后研究外，關(guān)于自噬因子對(duì)癌癥的治療預(yù)測(cè)上最近也有新的突破。YAMAMOTO 等[7]研究發(fā)現(xiàn)自噬通過降解MHC?1促進(jìn)胰腺癌的免疫逃逸，從而削弱其免疫治療療效，導(dǎo)致胰腺癌療效不佳。

胰腺癌患者中自噬水平與臨床病理特征及免疫預(yù)后有部分報(bào)道，然而，針對(duì)可能存在的潛在的與預(yù)后相關(guān)的自噬基因尚未被分析。在已發(fā)表的基因表達(dá)或拷貝數(shù)變異分析的基礎(chǔ)上，本研究分析了自噬因子在胰腺癌患者中的表達(dá)和突變，以確定自噬基因在胰腺癌中的表達(dá)模式、潛在功能和預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 資料來源從人類自噬基因集HADB 及GSEA 的GO_REGULATION_OF_AUTOPHAGY數(shù)據(jù)集整合收集了566 個(gè)自噬相關(guān)基因。通過GEPIA[8]數(shù)據(jù)庫(kù)，分析上述基因在胰腺癌中的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄情況。通過Kaplan?Meier Plotter[9]分析上述差異表達(dá)基因與胰腺癌的生存關(guān)系。通過Cbioportal[10]在線工具分析具有預(yù)后意義的基因在胰腺癌中的突變情況及各基因之間的相關(guān)性。通過UALCAN[11]對(duì)GEPIA 的分期結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。通過DAVID[12?13]及STRING[14]數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述基因進(jìn)行GO和KEGG 分析。利用TISIDB[15]分析ARGs的表達(dá)量與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及免疫檢查點(diǎn)（PD?1/PD?L1/CTLA4）抑制劑的相關(guān)性。

1.1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析條件：（1）腫瘤類型：PAAD；（2）|Log2FC|Cutoff：1；（3）P?value Cutoff：0.01；（4）Log Scale：Yes；（5）樣本來源：Match TCGA normal and GTEx data。

1.1.3 Kaplan?Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索條件：（1）樣本來源：Pancreatic ductal adenocarcinoma（n=177）；（2）生存分析終點(diǎn)：OS/RFS。

1.1.4 cBioportal 數(shù)據(jù)庫(kù)分析條件：（1）樣本來源：Pancreatic Adenocarcinoma（TCGA，PanCancer Atlas）184 samples；（2）呈現(xiàn)的表達(dá)譜系：Mutations；Structural Variant；Putative copy?number alterations from GISTIC；mRNA Expression. Select one of the profiles below：mRNA expression z?scores relative to all samples（log RNA Seq V2 RSEM）：Enter a z?score threshold±0.2；Protein expression z?scores（RPPA）：Enter a z?score threshold±0.2；（3）輸入基因：ATP6V0D1、ATP6V0A1、ATP6V0E2、MAP1LC3A、CTTN、MET、MTDH、RALB、RIPK2、BCL2L1、CHMP2B、EIF2S1、ITGA3、NCKAP1、SH3GLB1。

1.1.5 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析條件：（1）輸入基因：CTTN、MET、MTDH、RALB、RIPK2、BCL2L1、CHMP2B、EIF2S1、ITGA3、NCKAP1、SH3GLB1。（2）物種：人。

1.1.6 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索條件：（1）輸入蛋白：CTTN、MET、MTDH、RALB、RIPK2、BCL2L1、CHMP2B、EIF2S1、ITGA3、NCKAP1、SH3GLB1。（2）物種：人。

1.1.7 TISIDB 數(shù)據(jù)庫(kù)分析條件：（1）輸入基因：CTTN、MET、MTDH、RALB、RIPK2、BCL2L1、CHMP2B、EIF2S1、ITGA3、NCKAP1、SH3GLB1；（2）樣本來源：Pancreatic Adenocarcinoma（TCGA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰腺癌患者中ARGs的表達(dá)水平

通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)比較ARGs在179 例胰腺癌和171 例正常胰腺組織中的表達(dá)水平，并從中篩選差異表達(dá)的基因。結(jié)果表明566 個(gè)ARGs中297 個(gè)基因的表達(dá)具有顯著差異（P＜0.05）。與正常組織相比，有293 個(gè)基因在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，有4 個(gè)基因（BNIP3、MAPK8IP1、ULK1、GATA4）表達(dá)下調(diào)。

2.2ARGs中與胰腺癌預(yù)后及進(jìn)展相關(guān)的基因

為探討ARGs表達(dá)對(duì)胰腺癌預(yù)后的影響，采用Kaplan?Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)分析ARGs表達(dá)與胰腺癌OS（總生存期）、RFS（無復(fù)發(fā)生存期）的相關(guān)性，并從中選出與胰腺癌OS、RFS相關(guān)的具有表達(dá)顯著差異意義的基因（P＜0.05，F(xiàn)DR≤0.1）。Kaplan?Meier曲 線 和log?rank 檢 驗(yàn) 顯示，11 個(gè)（CTTN、MET、MTDH、RALB、RIPK2、BCL2L1、CHMP2B、EIF2S1、ITGA3、NCKAP1、SH3GLB1）表達(dá)水平升高的基因被預(yù)測(cè)為與OS 和RFS 呈負(fù)相關(guān)（圖1）。相反，有4個(gè)表達(dá)水平升高的基因（ATP6V0D1、ATP6V0A1、ATP6V0E2、MAP1LC3A）的患者與OS 和RFS 呈正相關(guān)。

2.3 預(yù)測(cè)胰腺癌高頻突變候選基因和高風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后基因的功能

由于疾病診斷的復(fù)雜性，單基因的改變并不能完全說明其與患者的診斷及預(yù)后相關(guān)，因此研究進(jìn)一步探索了15 個(gè)基因在患者中的基因突變及基因相關(guān)性。通過cBioportal 在線工具分析在胰腺癌患者中上述15 個(gè)基因的突變頻率及相關(guān)性。結(jié)果顯示，在184 例患者中，約有79 例患者（43%）上述ARGs發(fā)生改變（圖2A）?；蛲蛔兎治霭l(fā)現(xiàn)每個(gè)基因的突變率超過5%，其中，MTDH的突變率最高（圖2B）。

使用上述工具對(duì)胰腺癌中15 個(gè)基因的mRNA表達(dá)（RNA Seq V2RSEM）的相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算分析和Pearson 的校正。結(jié)果顯示CTTN、MET、MTDH、RALB、RIPK2、BCL2L1、CHMP2B、EIF2S1、ITGA3、NCKAP1、SH3GLB1 與ATP6V0D1、ATP6V0A1、ATP6V0E2、MAP1LC3A存在負(fù)相關(guān)性（圖2C）。除CTTN與MTDH、MTDH 與BCL2L1、BCL2L1與SH3GLB1、BCL2L1與MAP1LC3A外，其余基因間的相關(guān)性均具有顯著意義（P＜0.05）。

針對(duì)上述高風(fēng)險(xiǎn)基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能富集。使用DAVID 和String 分別對(duì)11 個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)的基因進(jìn)行Gene Ontology（GO，基因本體）and Kyoto Ency?clopedia of Genes and Genomes（KEGG，京都基因與基因組百科全書）分析，預(yù)測(cè)ARGs的功能及與其改變顯著相關(guān)的信號(hào)通路。GO 分析從生物過程、細(xì)胞成分和分子功能3個(gè)方面預(yù)測(cè)了目標(biāo)宿主基因的功能。GO 結(jié)果顯示，樹突棘維持、細(xì)胞黏附、細(xì)胞對(duì)氨基酸饑餓的反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、蛋白結(jié)合、鈣黏附素結(jié)合參與細(xì)胞間黏附在胰腺癌中受到上述基因的顯著調(diào)控（圖3）。表明上述基因是與細(xì)胞代謝相關(guān)的基因。通過KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)了15 條與11 個(gè)自噬基因功能改變相關(guān)的通路。其中癌癥通路、Ras 信號(hào)通路、胰腺癌、PI3K?AKT 信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、Rap1信號(hào)通路等參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展（圖4）。

2.4 研究基因表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及免疫檢查點(diǎn)抑制藥的關(guān)系

PAPACCIO 等研究表明[16]，高度腫瘤免疫抑制微環(huán)境可導(dǎo)致免疫檢查點(diǎn)抑制劑產(chǎn)生原發(fā)耐藥性，并影響其療效。自噬相關(guān)基因的上調(diào)可能會(huì)減少免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量，從而發(fā)揮免疫抑制作用。為進(jìn)一步了解候選基因與腫瘤免疫的關(guān)系，本研究使用TISIDB 數(shù)據(jù)庫(kù)分析上述11 個(gè)基因表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及免疫檢查點(diǎn)抑制劑的相關(guān)性，結(jié)果顯示：11 個(gè)基因中，部分基因和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的相關(guān)性（圖5）與其和CTLA4/PD?1/PD?L1抑制劑的相關(guān)性（表1）存在相似的趨勢(shì)。CTTN、MET、NCK?AP1的表達(dá)與大多數(shù)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)性，并且與CTLA4和PD?1免疫抑制劑有顯著的負(fù)相關(guān)性；RALB、BCL2L1、CHMP2B、ITGA3的表達(dá)與大多數(shù)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和PD?1呈顯著負(fù)相關(guān)性。RIPK2與大多數(shù)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及CTLA4呈顯著正相關(guān)性。

圖1 11個(gè)與OS和RFS呈負(fù)相關(guān)基因的表達(dá)水平和Kaplan?Meier曲線Figure 1 Expression and prognostic value of mRNA level of 11 ARGs in patients with pancreatic cancer (Kaplan?Meier curves of overall survival(OS,left)and relapse free survival(RFS,right))

圖1（續(xù)） 11個(gè)與OS和RFS呈負(fù)相關(guān)基因的表達(dá)水平和Kaplan?Meier曲線Figure 1（continued） Expression and prognostic value of mRNA level of 11 ARGs in patients with pancreatic cancer（Kaplan?Meier curves of overall survival（OS，left）and relapse free survival（RFS，right））

圖1（續(xù)） 11個(gè)與OS和RFS呈負(fù)相關(guān)基因的表達(dá)水平和Kaplan?Meier曲線Figure 1（continued） Expression and prognostic value of mRNA level of 11 ARGs in patients with pancreatic cancer（Kaplan?Meier curves of overall survival（OS，left）and relapse free survival（RFS，right）

3 討論

自噬已被證實(shí)在胰腺癌中升高[3]。研究表明，自噬與胰腺癌的進(jìn)展有關(guān)，是胰腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。此外，最近的研究結(jié)果證實(shí)，自噬與免疫逃避密切相關(guān)，這解釋了為什么胰腺癌在大多數(shù)情況下對(duì)包括ICBs（雙免疫檢查點(diǎn)抑制劑）在內(nèi)的免疫治療具有抵抗力[7]。并且，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明抑制自噬對(duì)增強(qiáng)免疫治療具有潛在的價(jià)值。因此，對(duì)自噬相關(guān)基因的分析可能為胰腺癌的治療帶來啟示。

本文報(bào)道了15 個(gè)可能與胰腺癌預(yù)后相關(guān)的自噬 基 因，其 中 有4 個(gè) 基 因（MET[17]、MTDH[18]、RALB[19]、ITGA3[20]）已有相關(guān)報(bào)道。并從基因?qū)用嫔咸剿髁俗允上嚓P(guān)預(yù)后基因表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及免疫檢查點(diǎn)抑制劑的相關(guān)性。本研究通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了自噬相關(guān)基因在胰腺癌中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示大多數(shù)自噬相關(guān)基因在胰腺癌中表達(dá)升高，這與相關(guān)實(shí)驗(yàn)中胰腺癌中自噬水平升高的結(jié)論具有一致性。通過HPA 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索免疫組化結(jié)果，表明BCL2L1、ITGA3、RIPK2具有明顯的差異表達(dá)，且在腫瘤組織中表達(dá)升高。另外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，MET[17]、MTDH[18]、RALB[19]、ITGA3[20]在胰腺癌中表達(dá)升高。

圖2 胰腺癌中15個(gè)差異表達(dá)的自噬基因的突變分析Figure 2 Mutation analysis of 15 differentially expressed autophagy genes in pancreatic cancer

運(yùn)用KM?plotter分析上述表達(dá)差異顯著的基因與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，CTTN、MET、MTDH、RALB、RIPK2、BCL2L1、CHMP2B、EIF2S1、ITGA3、NCKAP1、SH3GLB1的高表達(dá)與預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。ATP6V0D1、ATP6V0A1、ATP6V0E2、MAP1LC3A的高表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)。已有部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示存在一些自噬相關(guān)基因與胰腺癌預(yù)后相關(guān)。例如，研究表明MET與患者的生存期相關(guān)，可作為PDAC 患者的不良預(yù)后因素之一[21]。ITGA3的高表達(dá)與總生存率和無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)，特別是在早期癌癥患者中，具有顯著的診斷價(jià)值[20]。

圖3 11個(gè)與預(yù)后不良相關(guān)的ARGs的GO分析Figure 3 GO analysis of 11ARGsassociated with poor prognosis

圖4 11個(gè)與預(yù)后不良相關(guān)的ARGs的KEGG分析Figure 4 KEGG analysis of 11ARGsassociated with poor prognosis

圖5 11個(gè)ARGs的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的相關(guān)性Figure 5 Correlation between the expression of 11ARGsand tumor infiltrating lymphocytes

表1 11個(gè)基因表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的相關(guān)性Table 1 Correlation between the expression of 11ARGsand immune checkpoint inhibitors

GO 和KEGG 分析可以顯示感興趣的基因在功能和通路的相關(guān)富集，對(duì)研究結(jié)果起提示作用。分析結(jié)果表明，上述自噬基因富集胰腺癌相關(guān)通路RAS[22]信號(hào)通路、EGFR[23]信號(hào)通路和PI3K?AK 信號(hào)通路。提示上述基因?qū)σ认侔┐_有潛在的研究意義。關(guān)于預(yù)測(cè)PD?1/PD?L1 抑制劑的研究表明，PD?1/PD?L1 軸是一個(gè)重要的免疫檢查點(diǎn)信號(hào)通路，通過抑制RAS?RAF?MEK?ERK 和PI3K?AKT 等信號(hào)通路來減少T 細(xì)胞的激活；其抑制劑阻斷了該負(fù)性調(diào)控通路，從而促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖和分化。一個(gè)關(guān)于預(yù)后免疫參數(shù)的新定義表明，量化腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞可能比傳統(tǒng)的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期系統(tǒng)對(duì)免疫治療更有價(jià)值。更重要的是，免疫檢查點(diǎn)抑制劑作用于特定的腫瘤浸潤(rùn)T 細(xì)胞亞群。因此，本研究利用TISIDB 分析了自噬相關(guān)基因與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及免疫檢查點(diǎn)抑制劑的關(guān)系，結(jié)果顯示部分自噬基因與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的相關(guān)性同免疫檢查點(diǎn)抑制劑的相關(guān)性具有相似的趨勢(shì)，并且，研究發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)潛在的與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及雙免疫檢查點(diǎn)抑制劑顯著相關(guān)的胰腺癌自噬預(yù)后基因。值得注意的是，CTTN、MET、NCKAP1與免疫檢查點(diǎn)抑制劑和腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞均呈負(fù)相關(guān)，提示CTTN、MET、NCKAP1可通過負(fù)性作用于腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞而被鑒定為免疫抑制刺激。目前，有研究結(jié)果提示[16]，MET的表達(dá)水平升高可能會(huì)減少免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量，從而發(fā)揮對(duì)癌癥的免疫抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示胰腺癌中具有潛在的與預(yù)后不良和免疫浸潤(rùn)相關(guān)的自噬基因。這對(duì)于尋找提升免疫治療胰腺癌療效的新靶點(diǎn)具有重要的參考價(jià)值。