藏紅花素對急性心肌梗死大鼠心肌組織損傷和細(xì)胞凋亡的影響及機制

胡亞麗，龐茜茜，楊杰，劉云寧，劉克勤

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北張家口075000）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是因冠狀動脈阻塞，引起心臟供血不足導(dǎo)致心肌缺血壞死的常見心血管疾病，嚴(yán)重威脅著患者生命健康安全。近年數(shù)據(jù)顯示，AMI 發(fā)病逐漸年輕化，及時治療是挽救生命最重要的手段[1?2]。研究顯示AMI 基本病因為心臟供血不足，缺血心肌持續(xù)工作而引起的供氧和需氧失衡，引發(fā)體內(nèi)持續(xù)氧化應(yīng)激過程[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為[4]，AMI屬于“胸痹”“厥心痛”和“真心痛”等范疇，主要病機為本虛而標(biāo)實。大量研究顯示[5?6]，中藥藏紅花有效成分藏紅花素（crocin）對心血管系統(tǒng)疾病顯示出良好療效，同時兼具抗炎和抗氧化的作用，能夠通過抑制機體氧化應(yīng)激而對AMI 損傷起到一定保護(hù)作用，但其減輕心肌梗死和細(xì)胞凋亡的機制尚未完全明確。MicroRNA 是廣泛參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的小分子RNA，已有一系列miRNA 分子被證實參與機體心血管發(fā)育過程，對心血管慢性炎癥疾病發(fā)揮調(diào)控作用[7?8]。miR?146作為第一個被發(fā)現(xiàn)的具有免疫調(diào)節(jié)作用的miRNA，在多項體內(nèi)外實驗中被證實具有減輕炎癥和氧化應(yīng)激的功能[9]。因此，本文通過研究藏紅花素對miR?146a?5p 表達(dá)的影響，以進(jìn)一步明確miR?146a?5p 對AMI 損傷的保護(hù)作用，為臨床治療AMI提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

本研究經(jīng)動物實驗倫理委員會審核通過。

實驗動物：SD 大鼠40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（220±20）g，SPF級，購自河北省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2018?004。

主要試劑：乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和半胱氨酸天冬氡酸蛋白酶3（cysteine aspastic protease 3，Caspase?3）檢測試劑盒均購于南京賽泓瑞生物科技有限公司，批號分別為20201206、20201124、20200312；總RNA 提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司，批號分別為20200308、20200315；miR?146a?5p 和引物由上海生工生物工程有限公司合成；miR?146a?5p inhibitor 均由上海吉瑪基因公司合成；SsoFastTMEva?Green Su?permix 試劑盒購自Bio?Rad 公司，1864034；GAPDH鼠單克隆抗體購自Abcam 公司，批號：ab181602；Cleaved Caspase?3 和Caspase?3 單克隆抗體購于上海聯(lián)邁生物工程有限公司，批號分別為ab52072、ab13847；辣根過氧化 酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記兔抗鼠二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號：ZB2305；藏紅花素由上海玉博生物科技有限公司提供；鹽酸右美托咪定（Dexmedeto?midine，Dex）注射液購自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：20200618；三苯基氯化四氮唑（2，3，5?Tri?phenyltetrazolium Chloride，TTC）染色液購自無錫云萃生物科技有限公司，批號：20200524；TUNEL染色服務(wù)由晶萊生物提供，批號：20201104；H9c2大鼠心肌細(xì)胞購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自上海吉至生化科技有限公司，批號分別為20210308、20201216。

主要儀器和設(shè)備：ALC?V8D型動物呼吸機購自上海alcbio 公司；福田心電圖機、Bio?Rad 多功能酶標(biāo)檢測儀（型號iMark680）、OLYMPUS 光學(xué)顯微鏡（型號BX60）、Philips iU22 高頻線陣探頭超聲診斷儀（型號L12?5）、CO2培養(yǎng)箱均購自Thermo Fisher Scientific公司；實時熒光定量PCR（real?time fluores?cence quantification PCR，qRT?PCR）儀購自Bio?Rad公司；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀購自美國Becton?DickinSon公司。

1.2 動物分組及造模

將40 只大鼠隨機分為假手術(shù)（Sham）組、AMI組、AMI+crocin 和Dex組，每組各10只。飼養(yǎng)在25 ℃，50%濕度、12 h光/暗交替的環(huán)境中自由飲食，7 d適應(yīng)環(huán)境。

通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支（left anterior descendingcoronaryartery, LAD）制備AMI 大鼠模型[10]。AMI 組、AMI+crocin 組和Dex 組大鼠通過腹腔注射10%（φ）水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，麻醉成功后仰臥固定至手術(shù)板上，75%（φ）乙醇消毒頸部皮膚，切開氣管進(jìn)行氣管插管，連接呼吸機。術(shù)區(qū)使用碘酒消毒，以左胸第三肋間為手術(shù)切口，打開胸腔。使用無齒鑷輕提心包膜并剪開，距離冠脈2～3 mm處使用縫合針結(jié)扎左冠脈前降支，關(guān)胸，待大鼠蘇醒恢復(fù)自主呼吸后撤下呼吸機并縫合氣管切口。

麻醉復(fù)蘇2 h后，AMI+crocin組和Dex組大鼠分別灌胃crocin（40 mg/kg）[11]和Dex（20 μg/kg）[12]，AMI組和Sham 組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)注射5 d。

1.3 標(biāo)本采集

末次干預(yù)后，0.4%戊巴比妥鈉深度麻醉后開胸取心臟，橫斷切片，進(jìn)行TTC 染色，采用Image?pro Plus 軟件計算心肌梗死面積，剩余心肌組織一部分采用4%（φ）多聚甲醛固定24 h，之后進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片等步驟；另一部分加入細(xì)胞裂解液，將標(biāo)本充分研成勻漿，3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，得到心肌組織勻漿，冷凍待用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將大鼠H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)基，設(shè)置培養(yǎng)箱為37 ℃，5%（φ）CO2。將細(xì)胞隨機分為對照組（control）、缺氧組（hypoxia）、hypoxia+crocin組、hypoxia+crocin+inhib?itor 組、Dex 組、inhibitor 組（inhibitor 是一段能與成熟mir?146a?5p 互補結(jié)合并抑制mir?146a 活性的寡聚核苷酸）和inhibitor?NC 組，除control組、inhib?itor 組 和inhibitor?NC 組 外，其 他 細(xì) 胞 均加入高氮氣飽和的缺氧液培養(yǎng)4 h[13]，分別向hypoxia+crocin組、hypoxia+crocin+inhibitor 組和Dex 組細(xì)胞加入10 μmol/L crocin、10 μmol/L crocin+inhibitor 和10 nmol/L Dex 進(jìn)行孵育，control 組和hypoxia 組加入等量PBS緩沖液，培養(yǎng)24 h。

按照Lipofectamin2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書分別制備miR?146a?5p 空白質(zhì)粒和miR?146a?5p 的miRNA/Lipofectamin 陽性復(fù)合物，分別對inhibitor?NC 組和inhibitor組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后向inhibitor?NC組和inhibitor組細(xì)胞中加入10 nmol/L inhibitor，培養(yǎng)24 h[14]。將各組細(xì)胞一部分離心（1 000 r/min，5 min）獲取心肌細(xì)胞，另一部分制作細(xì)胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 高頻線陣探頭經(jīng)胸超聲心動圖評價左心室功能建立AMI 模型4 周后進(jìn)行心臟超聲檢查，M?型掃描連續(xù)3 個心動周期，獲得胸骨旁長軸切面的M型記錄，計算心臟左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.5.2 TUNEL染色檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡取大鼠心肌組織切片及細(xì)胞爬片，按照TUNEL染色一般操作步驟操作，光鏡下計數(shù)總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)即凋亡細(xì)胞數(shù)，采用TUNEL末端標(biāo)記法計算細(xì)胞凋亡率。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測大鼠心肌組織及心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平取大鼠心肌組織勻漿及心肌細(xì)胞上清液，采用ELISA 法測定心肌組織LDH、CK 和Caspase?3活性及心肌細(xì)胞上清液CK、LDH 活性，所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 qRT?PCR 檢測大鼠體內(nèi)及體外miR?146a?5p表達(dá)取大鼠心肌組織勻漿和心肌細(xì)胞，加入Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，按PCR 擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：引物序列為5′?ACUUUAAGGCUGAGAAGUU?CUCA 和3′?UUGGGUACCUUAAGUCAAGAGU，反應(yīng)總體積20 μL，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min，共40 個循環(huán)。使用SsoFastTMEva?Green Supermix 試劑盒檢測各組miR?146a?5p表達(dá)，以葡萄糖3?磷酸甘油醛脫氫酶（glyceralde?hyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）為內(nèi)參，重復(fù)實驗3次，取平均值，結(jié)果采用2 法進(jìn)行計算。

1.5.5 Western blot 檢測大鼠心肌細(xì)胞Cleaved cas?pase?3 及caspase?3 表達(dá)取心肌細(xì)胞上清液，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，用Beyotime 細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，Beyotime 核蛋白提取試劑盒獲得核蛋白，將蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）分離，分離后蛋白電子轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上。將膜與封閉緩沖液孵育，洗滌，加入一抗Cleaved caspase?3（1∶2 000）和caspase?3（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。洗膜，使用HRP 偶聯(lián)的二抗（1∶5 000）孵育膜，室溫孵育2 h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光顯像，以GAPDH 作為內(nèi)參，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對比條帶強弱。

1.5.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡將對照管上樣，調(diào)整FACS Calibur 流式細(xì)胞儀測定參數(shù)FAS 和SSC，在散色光點圖中顯示出清晰的細(xì)胞群體圖。根據(jù)FAS/SSC 特點設(shè)定電壓和放大器數(shù)值，以門中細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，已門中細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)熒光信號檢測，將散點圖中細(xì)胞集中在左下象限，采用CellQest軟件分析，數(shù)據(jù)以List Mode形式儲存。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，滿足正態(tài)分布的計量資料均以x±s表示，采用單因素方差分析比較多組間差異性，SNK-q比較多組兩兩間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花素對AMI大鼠心肌梗死大小的影響

TTC 染色結(jié)果顯示，急性心梗死區(qū)呈黃色，具備活力的心肌組織被染成紅色。與Sham 組對比，AMI 組大鼠心肌梗死面積明顯增大，其心肌梗死面積明顯大于AMI+crocin組和Dex組。見圖1。

圖1 藏紅花素對AMI大鼠心肌梗死面積的影響（TTC染色）Figure 1 Effect of crocin on the area of myocardial infarction

2.2 藏紅花素對AMI大鼠心臟功能障礙的影響

超聲心動圖顯示，Sham組大鼠心肌梗死區(qū)左室心肌薄厚度正常，收縮舒張運動正常；AMI 組大鼠心室壁變薄，部分向外擴(kuò)張，呈室壁瘤樣病變，心室舒縮行為異常；AMI+crocin 組和Dex 組大鼠心肌組織較薄，心肌舒縮無嚴(yán)重異常行為。與Sham 組相比，AMI 組大鼠LVEF 和LVFS 明顯下降（P＜0.05）。與AMI 組相比，AMI+crocin 組和Dex 組大鼠心臟LVEF及LVFS均明顯上升（P＜0.05）。見圖2。

圖2 藏紅花素對AMI大鼠心臟功能障礙的影響Figure 2 Effect of crocin on cardiac dysfunction in AMI rats

2.3 藏紅花素對AMI大鼠心肌組織凋亡的影響

Sham 組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率約（3.18±0.27）%，與Sham 組相比，AMI 組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率約（37.25±5.02）%，明顯升高（P＜0.05）；與AMI 組相比，AMI+crocin 組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率約為（20.64±1.88）%，Dex 組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率約（19.27±1.93）%，均明顯降低（P＜0.05）；AMI+crocin 組和Dex 組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率無明顯差異（P＞0.05）。與Sham 組相比，AMI 組大鼠CK、LDH 和Caspase?3 水平明顯升高（P＜0.05）；與AMI組相比，AMI+crocin 組和DEX 組大鼠CK、LDH 和Caspase?3 水平明顯下降（P＜0.05）；與AMI+crocin組大鼠相比，DEX 組大鼠上述指標(biāo)無明顯差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 藏紅花素對AMI大鼠心肌凋亡的影響（TUNEL染色，200×）Figure 3 Effect of crocin on myocardial apoptosis in AMI rats

2.4 藏紅花素對miR?146a?5p表達(dá)的影響

與Sham 組相比，AMI 組大鼠相對miR?146a?5p表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與AMI組相比，AMI+crocin組和Dex組大鼠miR?146a?5p相對表達(dá)水平明顯上升（P＜0.05）。與control 組相比，hypoxia 組和inhibitor組細(xì)胞相對miR?146a?5p 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與hypoxia 組相比，hypoxia+crocin 組和Dex 組細(xì)胞miR?146a?5p 相對表達(dá)水平明顯上升（P＜0.05）。見圖4。

圖4 藏紅花素對miR?146a?5p表達(dá)的影響Figure 4 Effect of crocin on miR?146a?5p expression

2.5 藏紅花素通過上調(diào)miR?146a?5p 對心肌細(xì)胞凋亡和損傷標(biāo)志物的影響

與control組相比，hypoxia組細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase?3表達(dá)、LDH和CK水平明顯上升（P＜0.05）；與hypoxia 組相比，hypoxia+crocin 組和Dex 組細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase?3 表達(dá)、LDH 和CK 水平明顯下降（P＜0.05）；與hypoxia+crocin 組細(xì)胞相比，hypoxia+crocin+inhibitor 組細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase?3表達(dá)、LDH和CK水平明顯上升（P＜0.05）。見圖5。

圖5 藏紅花素通過上調(diào)miR?140?3p對心肌細(xì)胞凋亡和損傷標(biāo)志物的影響Figure 5 Effects of crocin on myocardial cell apoptosis and injury markers by up?regulating miR?140?3p

3 討論

氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)在AMI 發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。既往研究表明[15]，miR?146a?5p 在動物心肌組織中具備調(diào)控炎癥和氧化應(yīng)激水平的作用，因此本研究通過研究藏紅花素對miR?146a?5p 的調(diào)控作用，進(jìn)一步明確藏紅花素減輕心肌梗死和細(xì)胞凋亡的作用機制。

本研究結(jié)果顯示，AMI 組大鼠心肌梗死面積明顯增大，LVEF 和LVFS 明顯下降，心肌細(xì)胞凋亡率增加；經(jīng)crocin 干預(yù)后，各指標(biāo)均明顯改善，說明藏紅花素可以提高心肌功能，改善冠脈微循環(huán)，修復(fù)AMI 引起的心肌損傷。LVEF 及LVFS 是評價心臟功能的常用超聲指標(biāo)，其水平升高表明藏紅花素可以提高心臟泵血能力，改善AMI 大鼠心功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡。分析原因，可能是crocin 抑制了心肌組織細(xì)胞的異常凋亡，心肌細(xì)胞數(shù)量維持在正常水平，冠脈微循環(huán)得以改善，心臟供血能力提高，有利于減少梗死部位面積。AMI+crocin 組和Dex 組大鼠上述結(jié)果無明顯差異可以進(jìn)一步表明藏紅花素具備改善心功能的作用。

本研究結(jié)果顯示，模型大鼠和細(xì)胞中CK、LDH和Caspase?3 水平明顯高于正常大鼠，經(jīng)crocin 干預(yù)后，其CK、LDH 和Caspase?3 水平明顯下降。CK 廣泛分布于心肌細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，與細(xì)胞能量轉(zhuǎn)運和肌肉收縮有關(guān)，其活性測定已被應(yīng)用于心肌疾病的診斷中[16]。LDH 是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一，AMI發(fā)生時，血清LDH活性明顯升高，是用以反映心肌疾病的重要指標(biāo)[17]。使用藏紅花素干預(yù)后，CK和LDH水平下降，說明心肌線粒體功能得以恢復(fù)，線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的最重要場所，也是心肌細(xì)胞最重要的細(xì)胞器，但線粒體受氧自由基影響明顯，當(dāng)心肌細(xì)胞缺血時，其結(jié)構(gòu)與功能受損是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡及AMI損傷加重的直接原因，藏紅花素干預(yù)使線粒體功能正常運轉(zhuǎn)，提高氧利用能力，避免乳酸堆積對受損心肌細(xì)胞的進(jìn)一步損害。Caspase?3 在細(xì)胞凋亡過程中具有不可替代的地位，正常情況下，Caspase?3以procaspase的形式存在體內(nèi)，當(dāng)受到刺激后，Caspase?3被多種因素活化，活化后的Caspase?3 快速參與細(xì)胞凋亡過程。Western blot 檢測結(jié)果顯示，hypoxia 組Cleaved caspase?3 表達(dá)明顯上升，hypoxia+crocin 組和Dex 組Cleaved caspase?3表達(dá)明顯下降，hypoxia+crocin+inhibitor組細(xì)胞Cleaved caspase?3 表達(dá)較hypoxia+crocin 組明顯上升。說明藏紅花素能夠抑制Caspase?3 活化過程，使其不能介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，維持心肌正常細(xì)胞數(shù)量，從而改善因缺血缺氧而導(dǎo)致的心肌細(xì)胞功能受損和異常凋亡。

既往研究證明[18?19]，miR?146a?5p 參與介導(dǎo)機體多種炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，推測藏紅花素可能通過影響miR?146a?5p 水平，直接或間接減輕心肌梗死和心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，AMI 組大鼠和hypoxia 組細(xì)胞相對miR?146a?5p 表達(dá)明顯降低，與AMI 組相比，AMI+crocin 組和Dex 組大鼠miR?146a?5p相對表達(dá)水平明顯上升；與hypoxia組相比，hypoxia+crocin組和Dex組細(xì)胞miR?146a?5p相對表達(dá)水平明顯上升。研究結(jié)果直接說明藏紅花素對miR?146a?5p 表達(dá)具有調(diào)控作用，miR?146a?5p 過表達(dá)會使得血清及細(xì)胞中CK 和LDH 活性升高，細(xì)胞線粒體受損，造成心肌細(xì)胞進(jìn)一步缺氧。同時其介導(dǎo)caspase?3 活化以促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。藏紅花素下調(diào)miR?146a?5p 表達(dá)，減輕機體氧化應(yīng)激水平，減少心肌細(xì)胞凋亡，恢復(fù)冠狀動脈微循環(huán)，改善心肌細(xì)胞缺氧缺血環(huán)境，減輕AMI損傷。

綜上所述，藏紅花素對AMI所致的心肌損傷具有改善作用，其機制可能是通過上調(diào)miR?146a?5p水平以減少心肌細(xì)胞凋亡，從而有助于受損心肌細(xì)胞維持較高供血及供氧水平，以減輕AMI癥狀。