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    菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒的HPLC 指紋圖譜相關(guān)性研究

    2022-04-26 07:53:36姚曉璇王瑜婷邱彩月何榮榮陳銘恩黎桃敏劉燎原
    關(guān)鍵詞:水煎液菟絲子綠原

    姚曉璇,王瑜婷,邱彩月,何榮榮,陳銘恩,黎桃敏,劉燎原

    (廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東佛山528244)

    菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品。菟絲子性平,味辛、甘,具有補(bǔ)益肝腎、固精縮尿、安胎明目的功效[1?2]?,F(xiàn)代研究表明,菟絲子主要包括黃酮類、有機(jī)酸、多糖、木脂素類、氨基酸和生物堿等成分,其主要藥理作用有保肝、抗骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、腫瘤、增強(qiáng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能、抑制黑色素合成等[3?4],具有良好的藥用價(jià)值。

    中藥配方顆粒是以中藥飲片為原料,經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成的可供中醫(yī)臨床調(diào)配使用的顆粒制劑[5],中藥配方顆粒是中藥湯劑的一種現(xiàn)代劑改形式,是中藥飲片的一種補(bǔ)充。中藥配方顆粒與中藥湯劑之間的差異來源于湯液濃縮、干燥過程中相關(guān)成分的物理遺失與化學(xué)變化[6]。目前,有關(guān)菟絲子藥材的化學(xué)成分測(cè)定和指紋圖譜研究較多[7?9],尚無對(duì)菟絲子及其制劑產(chǎn)品相關(guān)性研究的報(bào)道。本研究分別建立了菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒的HPLC指紋圖譜,比較3者之間HPLC指紋圖譜的相關(guān)性和差異性,探討菟絲子配方顆粒制備過程中的化學(xué)成分轉(zhuǎn)化,確保顆粒劑與湯劑質(zhì)量的一致性,以期為菟絲子配方顆粒的質(zhì)量控制和臨床安全有效用藥提供參考。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Waters Arc 型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司);XP26 型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO 公司);Milli?Q Direct 型超純水系統(tǒng)(德國(guó)Merck 公司);SODA?12型噴霧干燥機(jī)(上海大川原干燥設(shè)備有限公司);LGS20 型干法制粒機(jī)(南京迦南科技有限公司);YRE?501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);DLSB?5/20 型低溫冷卻液循環(huán)水泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);KQ?500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    1.2 試藥

    綠原酸(批號(hào):110753?202018,純度96.1%)、金絲桃苷(批號(hào):111521?201809,純度94.9%)、異槲皮苷(批號(hào):111809?201804,純度97.2%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;隱綠原酸(批號(hào):DST210427?035,純度98.24%)對(duì)照品購(gòu)自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)Merck 公司),磷酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),水為超純水,其余試劑均為分析純。

    16 批菟絲子藥材(樣品編號(hào)為S1-S16)經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品,均為南方菟絲子Cuscuta australisR. Br.的干燥成熟種子,藥材產(chǎn)地信息見表1。16批菟絲子飲片(樣品編號(hào)為Y1-Y16)嚴(yán)格按照2020 年版《中國(guó)藥典》一部菟絲子項(xiàng)下飲片炮制規(guī)定進(jìn)行炮制[1];16 批菟絲子水煎液(樣品編號(hào)為T1-T16)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》相關(guān)要求進(jìn)行煎煮[10],取每批菟絲子的提取液,減壓濃縮,定容至100 mL,得樣品水煎液;16批菟絲子配方顆粒(樣品編號(hào)為P1-P16)由水煎液經(jīng)濃縮、干燥、制粒等步驟得到。

    表1 16批菟絲子藥材的來源信息Table 1 Source information of 16 batches of Cuscutae Semen

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件[11]

    色譜柱:Xselect HSS T3(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)?0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0~30 min,7%~12%A;30~35 min,12%~15%A;35~55 min,15%A;55~80 min,15%~30%A;80~85 min,30%~93%A;85~90 min,93%A);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;進(jìn)樣量:5 μL。

    2.2 對(duì)照品溶液的制備

    分別取綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為78.42、62.20、58.27、56.86 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

    2.3 供試品溶液的制備

    2.3.1 菟絲子飲片供試品溶液取菟絲子飲片粉末(過四號(hào)篩)約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,加熱回流30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得飲片供試品溶液。

    2.3.2 菟絲子水煎液供試品溶液精密吸取混合均勻的菟絲子水煎液10 mL,置50 mL 量瓶中,加水5 mL,加甲醇定容至刻度,稱定質(zhì)量,超聲處理(300 W,45 kHz)30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得水煎液供試品溶液。

    2.3.2 菟絲子配方顆粒供試品溶液取菟絲子配方顆粒適量,研細(xì),取約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(300 W,45 kHz)30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得配方顆粒供試品溶液。

    2.4 方法學(xué)考察

    2.4.1 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見圖1??梢?,供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處具有相同的色譜峰,且空白溶劑無干擾,表明方法專屬性良好。

    圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Figure 1 The HPLC chromatograms of specific test

    2.4.2 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次,以5 號(hào)峰金絲桃苷為參照峰,計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 范圍分別為0.15%~0.22%和0.23%~0.64%,表明儀器精密度良好。

    2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取菟絲子飲片(編號(hào)Y16),精密稱定,按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別于制備0、4、8、12、24、48 h 后按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以5號(hào)峰金絲桃苷為參照峰,計(jì)算得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 范圍分別為0.16%~1.21%和1.32%~2.57%,表明菟絲子飲片供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取菟絲子飲片(編號(hào)Y16)6 份,精密稱定,按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以5 號(hào)峰金絲桃苷為參照峰,計(jì)算得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 范圍分別為0.10%~0.12% 和0.13%~2.20%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.5 HPLC指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

    2.5.1 指紋圖譜的建立分別取16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒,按“2.3”項(xiàng)方法分別制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版”對(duì)色譜圖進(jìn)行匹配,確定菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒均有8 個(gè)共有峰,如圖2-4 所示。通過與對(duì)照品圖譜對(duì)比,確定1 號(hào)峰為綠原酸,2 號(hào)峰為隱綠原酸,5 號(hào)峰為金絲桃苷,6號(hào)峰為異槲皮苷。

    圖2 16批菟絲子飲片的HPLC指紋圖譜疊加圖Figure 2 The HPLC fingerprints of 16 batches of Cuscutae Semen pieces

    2.5.2 相似度評(píng)價(jià)分別將16 批菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒HPLC指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版”軟件,分別計(jì)算各批次菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒HPLC指紋圖譜與其對(duì)照?qǐng)D譜的相似度,結(jié)果見表2。可見,16批菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒HPLC指紋圖譜與其相應(yīng)對(duì)照指紋圖譜(R1、R2、R3)的相似度均大于0.900,表明不同批次菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒的質(zhì)量較為穩(wěn)定。

    圖3 16批菟絲子水煎液的HPLC指紋圖譜疊加圖Figure 3 The HPLC fingerprints of 16 batches of Cuscutae Semen water decoction

    圖4 16批菟絲子配方顆粒的HPLC指紋圖譜疊加圖Figure 4 The HPLC fingerprints of 16 batches of Cuscutae Semen formula granules

    2.5.3 對(duì)照指紋圖譜的比較分別將16批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒指紋圖譜生成的對(duì)照指紋圖譜R1、R2 和R3(見圖5)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”軟件,結(jié)果顯示:與菟絲子飲片比較,菟絲子水煎液和配方顆粒的相似度分別為0.998 和0.997,菟絲子水煎液和配方顆粒指紋圖譜相似度為1.000,表明菟絲子飲片、水煎液與配方顆粒成分基本一致,菟絲子水煎液在提取、濃縮、干燥、制粒過程中,其成分種類無明顯變化。

    表2 16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Results of similarity analysis of 16 batches of Cuscu?tae Semen pieces,water decoction,formula granules

    圖5 菟絲子飲片對(duì)照指紋圖譜(R1)、水煎液對(duì)照指紋圖譜(R2)和配方顆粒對(duì)照指紋圖譜(R3)Figure 5 Reference fingerprints of Cuscutae Semen pieces,water decoction,formula granules by HPLC

    2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

    2.6.1 共有峰相關(guān)性分析采用SPSS 26.0 軟件,以16批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒共48個(gè)樣品各特征峰的“峰面積占比”值(各特征峰峰面積占特征峰總面積的比例)為變量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析,結(jié)果見表3??梢姡私z子飲片與水煎液或配方顆粒比較,除色譜峰峰3 外,菟絲子飲片、水煎液及其配方顆粒的7 個(gè)共有峰均具有顯著的正相關(guān)性;菟絲子水煎液與配方顆粒比較,8 個(gè)峰均具有極顯著的正相關(guān)性。

    表3 16批菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Correlation analysis results of common peaks of Cuscu?tae Semen pieces,water decoction and formula granules

    2.6.2 聚類分析采用SPSS 26.0 軟件,以16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒共48個(gè)樣品各特征峰面積為變量進(jìn)行聚類分析[12],結(jié)果見圖6??梢姡?dāng)距離為10 時(shí),48 批樣品可以分為4 類,Y6-Y8、T1-T16、P1-P4、P6-P16 聚為一類,Y3-Y4、Y9-Y16 聚為一類,Y2、Y5、P5 聚為一類,Y1 單獨(dú)聚為一類。表明甘肅與黑龍江產(chǎn)地與其他2個(gè)產(chǎn)地的菟絲子飲片存在差異,菟絲子水煎液與配方顆粒之間無明顯差異,可聚為一類。

    2.6.3 主成分分析(PCA) 采用SPSS 26.0 軟件,對(duì)16批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒共48個(gè)樣品各特征峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值(Xi)進(jìn)行主成分分析,主成分結(jié)果以特征值>1 為標(biāo)準(zhǔn)提取得到2 個(gè)主成分,計(jì)算得特征值和方差貢獻(xiàn)率見表4,主成分因子載荷矩陣見表5。由結(jié)果可知,前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為78.80%,表明提取的2 個(gè)主成分能反映菟絲子指紋圖譜的大部分信息。主成分1 的特征值為3.958,方差貢獻(xiàn)率為49.48%,載荷較高的峰有綠原酸、峰4、金絲桃苷、異槲皮苷、峰7 和峰8,表明這6 個(gè)峰主要反映主成分1的信息;主成分2的特征值為2.345,方差貢獻(xiàn)率為29.32%,載荷較高的峰有隱綠原酸、峰3,表明這2個(gè)峰主要反映主成分2的信息。

    表4 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic value and variance contribution rate of Cuscutae Semen pieces,water decoction,formula granules

    表5 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒主成分因子載荷矩陣Table 5 Factors loading matrix of Cuscutae Semen pieces,water decoction,formula granules

    圖7 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC 指紋圖譜主成分得分圖Figure 7 PCA Score plot of principal component analysis of Cuscutae Semen pieces,water decoction,formula granules

    2.6.4 正交偏最小二乘判別分析(OPLS?DA) 采用SIMCA 14.1 軟件,以16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒共48 個(gè)樣品各特征峰峰面積為變量進(jìn)行OPLS?DA 分析,結(jié)果見圖8-9。由模型參數(shù)可知,數(shù)據(jù)矩陣的解釋率參數(shù)R2X(cum)=0.900,模型區(qū)分參數(shù)R2Y(cum)=0.702,模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2=0.651,均>0.500,表明該數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定可靠[15?16]。48 個(gè)樣品可分成3 類。以VIP 值>1 為提取標(biāo)準(zhǔn),得到峰3、金絲桃苷、峰4是影響分類的主要標(biāo)志性成分。

    圖8 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC 指紋圖譜OPLS?DA得分圖Figure 8 OPLS?DA Score plot of Cuscutae Semen pieces,waterdecoction,formula granules

    3 討論

    中藥配方顆粒既保留了傳統(tǒng)中醫(yī)藥辨證論治、復(fù)方配伍、隨證加減的優(yōu)勢(shì)和特色,同時(shí)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥湯劑煎煮費(fèi)時(shí)、儲(chǔ)存攜帶不便等不足,相比中藥飲片具有更高的附加值,更能體現(xiàn)中藥用藥的現(xiàn)代化、規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化,是對(duì)傳統(tǒng)中藥的重要?jiǎng)?chuàng)新[17]。目前中藥配方顆粒與中藥飲片水煎液的成分對(duì)比研究,大多以單個(gè)指標(biāo)成分含量進(jìn)行比較,整體成分比較的研究較少,不能全面反映中藥質(zhì)量水平。中藥指紋圖譜是中藥整體性的化學(xué)表征,可以直觀地反映制備工藝的穩(wěn)定性和配方顆粒的質(zhì)量,是中藥配方顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制的重要方法[18]。

    圖9 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC 指紋圖譜VIP值Figure 9 Result of VIP of Cuscutae Semen pieces,water decoc?tion,formula granules

    本文建立的菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC指紋圖譜及分析方法共確定了8個(gè)共有峰,并指認(rèn)了其中4個(gè)共有峰分別為綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷和異槲皮苷。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒均與相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜的相似度較高,表明不同批次的菟絲子整體的化學(xué)成分具有較好的一致性;水煎液和配方顆粒的制備工藝穩(wěn)定。散點(diǎn)圖中點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離代表各樣品之間存在的差異程度[19]。CA、PCA和OPLS?DA結(jié)果顯示,不同批次菟絲子飲片較為分散,不同批次水煎液、配方顆粒之間較為緊密,表明經(jīng)過水煎煮后菟絲子中各類化學(xué)成分具有較好的一致性;飲片與水煎液、配方顆粒之間的差異較大,可能是由于菟絲子中的熱敏性成分(如綠原酸)經(jīng)過煎煮后含量發(fā)生變化;水煎液和配方顆粒之間的關(guān)系較為緊密,差異較小,表明菟絲子從水煎液到配方顆粒的制備過程中各類化學(xué)成分得到了較好地保留。由皮爾遜相關(guān)性分析可得,除峰3 外,其他7 個(gè)峰均具有顯著正相關(guān)性。該方法能較好地反映三者的相關(guān)性及差異性,可為菟絲子配方顆粒的生產(chǎn)過程和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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