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    田黃方對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷的改善作用及機(jī)制研究

    2022-04-26 07:53:30黃敏儀陳可純羅朵生貝偉劍楊祎琦郭姣
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激小鼠

    黃敏儀,陳可純,羅朵生,貝偉劍,楊祎琦,郭姣

    (廣東藥科大學(xué)廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心/糖脂代謝病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510006)

    隨著中國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展,人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的改變,高脂肪、高熱量的食物攝入比例不斷增加,高脂飲食導(dǎo)致的血脂代謝紊亂使過(guò)多的脂質(zhì)堆積在腎臟,從而導(dǎo)致腎損傷[1]。田黃方(THF)為廣東藥科大學(xué)郭姣教授多年的臨床驗(yàn)方[2],由黃連、三七2 味中藥組成,具有治療高脂血癥、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、腎間質(zhì)纖維化及老年糖脂代謝紊亂等功效[2?6]。本研究利用高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷模型為載體,探究其對(duì)腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 藥物與試劑

    黃連、三七飲片由廣州致信中藥飲片有限公司提供(批號(hào):190301、190603),THF 是由黃連與三七飲片通過(guò)乙醇提取和大孔樹脂富集純化的方法制備得到的提取物;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(美國(guó)Roche 公司);組織蛋白提取液(美國(guó)Thermo sci‐entific 公司);BCA 試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司);總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL?C)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究院);SDS?PAGE凝膠快速制備試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司);PVDF 膜(美國(guó)im‐mobilon?PSQ 公司);一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);TBS緩沖液、PBS緩沖液、SABC 免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);甲醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);Tween?20(碧云天生物技術(shù)公司);蘇木素?伊紅染液(德國(guó)sigma公司);甘氨酸、Tris Base(上海生工生物工程有限公司);SDS(Serva 公司);脫脂奶粉(日本Fujifilm公司);抗體稀釋液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Bax、Bcl2、p?AKT、GAPDH、β?actin、Cleaved caspase?3抗體(美國(guó)CST公司)。

    1.2 主要儀器

    組織破碎儀(美國(guó)QIAGEN 公司);BX53 顯微鏡(日本Olympus公司);H2050R?1低溫高速離心機(jī)(上海華巖設(shè)備有限公司);1658025 小型垂直電泳儀(美國(guó)Bio?Rad 公司);10017142ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio?Rad公司);SHP?150型生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Mithras LB940酶標(biāo)儀(德國(guó)Berthold Technologies公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠,體質(zhì)量(18±2)g,購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):44007200052789。

    1.4 高脂誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷模型的構(gòu)建[6]

    小鼠購(gòu)入后自由攝食飲水,按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組(Control)、模型組(Model)、田黃方組(THF)。正常組及模型組分別采用正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)5個(gè)月后,連續(xù)給藥THF(10 mL/kg)干預(yù)6周,取腎臟組織備檢。

    1.5 腎臟組織蘇木精?伊紅(H&E)染色

    將每組相同位置的腎臟組織塊放入4%(φ)多聚甲醛中固定后,按照70%(φ)乙醇、75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇及無(wú)水乙醇的濃度梯度進(jìn)行脫水處理,再用二甲苯進(jìn)行透明處理,最后置于石蠟中進(jìn)行包埋處理。將包埋好的組織按照4 μm厚度切片,常規(guī)脫蠟,分別置于無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇復(fù)水,然后用純水浸泡5 min 清洗后,進(jìn)行HE 染色,脫水后,使用中性樹膠封片,過(guò)夜風(fēng)干,于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)。

    1.6 腎臟組織中TC、TG、LDL?C、LDH、SOD 和MDA水平的測(cè)定

    取小鼠腎臟,加入一定量的4 ℃預(yù)冷的PBS,勻漿后于2 500 r/min(4 ℃)離心20 min,收集上清液備用,并測(cè)定組織蛋白濃度。根據(jù)反應(yīng)生成的醌類化合物顏色深淺與TC、TG的含量成正比的原理,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)腎勻漿上清TC、TG 含量。利用直接法?表面活性劑消除法使吸光度與LDL?C 的含量成正比的原理,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)腎勻漿上清LDL?C 含量。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的丙酮酸二硝基苯腙顏色深淺與LDH的含量成正比的原理,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)腎勻漿上清LDH 含量。根據(jù)MDA與硫代巴比妥酸反應(yīng)形成紅色產(chǎn)物的顏色深淺與MDA含量成正比的原理,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)腎勻漿上清MDA 含量。根據(jù)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)生成超氧陰離子自由基,后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽,最后顯色為紫紅色,顯色物的顏色深淺與SOD 含量成反比的原理,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)腎勻漿上清SOD活力。

    1.7 腎臟組織TUNEL染色

    組織固定、脫水、包埋、切片、脫蠟后,使用不含DNase 的蛋白酶K 室溫孵育20 min 后,再加入適量TUNEL 檢測(cè)液,于37 ℃避光孵育1 h,使用含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察到呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞,即為凋亡細(xì)胞,使用Image J軟件進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分比分析。

    1.8 腎臟組織中Cleaved caspase?3的測(cè)定

    1.8.1 免疫組化法(immunohistochemistry,IHC) 組織固定、脫水、包埋、切片、脫蠟后,進(jìn)行IHC 染色,染色步驟按SABC 免疫組化試劑盒操作,其中一抗Cleaved caspase?3 按說(shuō)明書推薦1∶200 稀釋濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最后中性樹膠封片,過(guò)夜風(fēng)干。于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)并拍攝圖像,使用Image J軟件進(jìn)行陽(yáng)性表達(dá)定量分析。

    1.8.2 蛋白免疫印跡(WB) 法取凍存的腎臟組織,加入一定量含抑制劑的裂解液,勻漿后于12 000 r/min(4 ℃)離心20 min,取上清,按BCA 試劑盒說(shuō)明書操作,測(cè)定組織蛋白含量并定量。每組取等量蛋白上樣,采用SDS?PAGE 分離蛋白,300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h 后,使用5%脫脂牛奶常溫封閉2 h,洗膜后,分別加入一抗Cleaved caspase?3(1∶1 000)、GAP‐DH(1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜。次日,回收一抗,TBST 洗膜后,分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶3 000),常溫孵育1.5 h,回收二抗,洗膜后顯影。使用Image Lab軟件分析條帶的蛋白灰度值并分析。

    1.9 腎臟組織PI3K、p?AKT、Bax 和Bcl2 蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

    采用WB 法測(cè)定腎臟組織中PI3K、p?AKT、Bax和Bcl2蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)步驟同“1.8.2”,其中加入的一抗,包括PI3K(1∶1 000)、p?AKT(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)和β?actin(1∶1 000);加入的二抗,包括HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶3 000)、羊抗鼠抗體(1∶3 000)。使用Image Lab軟件對(duì)蛋白的灰度值進(jìn)行分析。1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析法(One?way ANOVA)進(jìn)行組間比較,方差齊時(shí),使用LSD?T檢驗(yàn);若方差不齊,則使用Dunnett’s T3 mul‐tiple comparisons test。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 THF 對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷的病理形態(tài)學(xué)的影響

    采用H&E染色觀察小鼠的腎臟組織病理狀況。結(jié)果如圖1 所示,正常組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)排列比較整齊,腎小球、腎小管形狀比較規(guī)則;模型組小鼠腎小球體積明顯腫脹增大,球囊壁出現(xiàn)黏連;與模型組相比,THF 組小鼠腎小球與腎小管的病理形態(tài)均得到明顯改善,包括腎小球體積減小、球囊壁黏連減少等。

    圖1 THF改善高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷Figure 1 THF improves renal damage in mice induced by high fat diet

    2.2 THF對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中TC、TG、LDL?C、LDH、SOD和MDA水平的影響

    如表1所示,與正常組相比,模型組小鼠腎臟勻漿中TC、TG、LDL?C、LDH 和MDA 水平顯著升高(P<0.01 或P<0.05),SOD 水平顯著降低(P<0.05);經(jīng)THF 治療后,一定程度緩解了腎臟損傷,而且腎臟組織中TC 和LDL?C 水平也顯著降低(P<0.01 或P<0.05)。

    表1 THF改善高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟脂質(zhì)與氧化應(yīng)激指標(biāo)Table 1 Effect of THF on lipid and oxidative stress indicators in mice induced by high fat diet(±s,n=6)

    表1 THF改善高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟脂質(zhì)與氧化應(yīng)激指標(biāo)Table 1 Effect of THF on lipid and oxidative stress indicators in mice induced by high fat diet(±s,n=6)

    與正常組比較:*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01。

    組別Control Model THF TC/(mmol·g prot-1)0.27±0.02 0.65±0.17**0.31±0.10##TG/(mmol·g prot-1)0.72±0.13 1.32±0.45*0.85±0.34 LDL-C/(mmol·g prot-1)0.22±0.10 0.44±0.12*0.20±0.06#LDH/(U·g prot-1)4.42±0.88 10.90±4.64**6.67±2.99 MDA/(nmol·mg prot-1)4.65±1.91 16.69±6.33**13.17±4.50*SOD/(U·mg prot-1)11.91±4.83 3.57±3.09*7.06±5.28

    2.3 THF對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中Cleaved caspase?3表達(dá)的影響

    2.3.1 THF改善高脂誘導(dǎo)的小鼠腎損傷中的Cleaved caspase?3 的表達(dá) IHC 染色結(jié)果如圖2A 所示,Cleaved caspase?3 陽(yáng)性染色主要分布在胞漿,大量表達(dá)在腎小管,腎小球也有少量分布,呈棕黃色。從圖2B 可知,與正常組比較,模型組Cleaved caspase?3 的表達(dá)顯著升高(P<0.01),THF 干預(yù)后,Cleaved caspase?3顯著減少(P<0.01)。

    2.3.2 THF 對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中的Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)的影響如圖2C、2D 所示,與正常組相比,高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中Cleaved caspase?3蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01),經(jīng)THF 干預(yù)后,Cleaved caspase?3 蛋白在高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟的表達(dá)顯著減少(P<0.01)。

    圖2 THF下調(diào)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中Cleaved caspase?3的表達(dá)Figure 2 THF reduces the level of Cleaved caspase?3 in mice induced by high fat diet

    2.4 THF 對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中PI3K、p-AKT、Bax和Bcl2蛋白表達(dá)的影響

    如圖3 所示,與正常組相比,模型組中PI3K、p?AKT、Bcl2 蛋白表達(dá)和Bcl2/Bax 比值均顯著下調(diào)(P<0.05 或P<0.01),Bax 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01);與模型組相比,THF 組小鼠腎臟中PI3K、p?AKT、Bcl2 和Bcl2/Bax 比值均顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01),并且Bax 蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01),提示THF可以抑制PI3K/p?AKT/凋亡信號(hào)通路從而抑制高脂誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的發(fā)展。

    圖3 THF 對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中PI3K、p?AKT、Bax 和Bcl2蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of THF on the protein levels of PI3K,p?AKT,Bax,and Bcl2 in mice induced by high fat diet

    2.5 THF 對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的影響

    如圖4所示,與正常組相比,可見高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織中凋亡細(xì)胞顯著增加(P<0.01);與模型組相比,THF 組小鼠腎臟中凋亡細(xì)胞顯著減少(P<0.01),提示THF對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織損傷有較好的保護(hù)作用。

    圖4 THF 對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的影響(200×)Figure 4 Effects of THF on apoptosis of kidney cells in mice fed with high fat diet

    3 討論

    高脂飲食可引起機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂,導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)脂毒性,表現(xiàn)為血清肌酐及血清尿素氮水平升高、腎小球?yàn)V過(guò)率異常、蛋白尿、腎小球肥大和腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積等異?,F(xiàn)象[7],表明脂質(zhì)代謝紊亂與腎損傷之間存在密切關(guān)系。中醫(yī)典籍中,《素問(wèn)·逆調(diào)論》:“腎者水臟,主津液”,說(shuō)明若腎氣虛弱,氣化失常,則腎對(duì)津液調(diào)控功能發(fā)生紊亂,津聚體內(nèi)而生痰,體內(nèi)血脂異常[8?10]。因此,尋找一種有效治療高脂導(dǎo)致的腎損傷藥物,并明確其作用機(jī)制,對(duì)臨床治療高脂誘發(fā)的腎損傷或其他代謝紊亂疾病具有重要意義。

    高脂飲食引發(fā)的腎臟損傷的一個(gè)主要特點(diǎn)是脂質(zhì)蓄積,主要表現(xiàn)為腎臟組織中TC、TG和LDL?C的升高[11?12]。腎臟脂質(zhì)蓄積容易壓迫腎周組織血管,導(dǎo)致腎臟的線粒體功能障礙;腎臟的線粒體損傷后,脂肪酸氧化效率降低,加劇腎臟脂質(zhì)蓄積,這使得細(xì)胞內(nèi)的游離脂肪酸及代謝產(chǎn)物過(guò)量蓄積,活性氧(ROS)大量產(chǎn)生,導(dǎo)致機(jī)體ROS 的生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)被打破,最終腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激[13?14]。另外,隨著慢性炎癥的出現(xiàn),腎臟功能不斷下降,同時(shí),炎癥因子也進(jìn)一步加重腎臟的脂質(zhì)積蓄。炎癥通過(guò)刺激機(jī)體產(chǎn)生趨化因子,從而增加ROS 的釋放,導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)氧化應(yīng)激,表現(xiàn)為MDA升高,SOD 降低[15]。氧化應(yīng)激也影響機(jī)體的炎癥反應(yīng)及線粒體損傷,加劇腎臟損傷,導(dǎo)致腎臟損傷標(biāo)志物L(fēng)DH[16]表達(dá)降低。因此,腎臟的脂質(zhì)積蓄、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化與氧化應(yīng)激相互影響,造成腎臟細(xì)胞損傷。

    腎臟損傷的氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的ROS 不僅對(duì)細(xì)胞具有直接損傷的作用,還可以激活一系列信號(hào)通路作為信號(hào)分子參與細(xì)胞凋亡[17]。關(guān)于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡的機(jī)制[14],研究較多的是線粒體起始的內(nèi)源性凋亡途徑、Bcl2基因家族的調(diào)控、NF?κB、MAPKs家族的介導(dǎo)和caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

    田黃方THF 是郭姣教授應(yīng)用“調(diào)肝啟樞化濁”法治療糖脂代謝性疾病的有效驗(yàn)方,能夠使肝氣調(diào)達(dá),氣機(jī)通暢,五臟調(diào)和,氣血津液運(yùn)化正常,化解祛除痰濁等物質(zhì),降低血脂[18?20]。前期研究表明,田黃方能夠降低高脂血癥大鼠血漿中的TC、TG、LDL?C[3],并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)其可通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路影響糖脂代謝紊亂[21]。本研究也發(fā)現(xiàn),高脂飲食使小鼠腎臟出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂,TC、TG、LDL?C 和LDH 含量升高,同時(shí)腎臟存在如腎小球體積明顯增大及球囊壁出現(xiàn)黏連等腎臟病理變化。機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂時(shí),伴隨氧化應(yīng)激的出現(xiàn),而氧化應(yīng)激與腎損傷有關(guān)[1]。本研究中,模型組的MDA 水平升高,SOD 活力降低,反映腎組織內(nèi)氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。而THF 一定程度逆轉(zhuǎn)了以上的脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)及提高抗氧化水平,減輕腎損傷。在中藥治療高脂誘導(dǎo)的腎損傷的相關(guān)研究中,發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT 信號(hào)通路,緩解高脂導(dǎo)致的小鼠代謝紊亂狀態(tài)[22?23]。腎損傷亦與細(xì)胞凋亡有關(guān)[24],其中PI3K/AKT 通路的下游促凋亡蛋白Bax、cas‐pase?3與抗凋亡蛋白Bcl2參與細(xì)胞凋亡的復(fù)雜病理生理過(guò)程[25?26]。因此本研究圍繞THF 是否可通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路,抑制細(xì)胞凋亡,從而減輕高脂導(dǎo)致的腎損傷,進(jìn)行了相關(guān)的機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組小鼠腎臟組織中PI3K、p?AKT 的表達(dá)下降,Bcl2 蛋白的表達(dá)和Bcl2/Bax 的比值降低,Bax、Cleaved caspase?3 蛋白的表達(dá)增加,而THF 可以緩解高脂誘導(dǎo)的腎臟中PI3K、p?AKT、Bcl2、Bcl2/Bax 的表達(dá)下降,抑制Bax、Cleaved cas‐pase?3 的表達(dá)升高,表明THF 保護(hù)高脂誘導(dǎo)的腎組織損傷可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路、抑制腎臟細(xì)胞凋亡有關(guān)。

    綜上所述,田黃方可有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路、抑制細(xì)胞凋亡、改善機(jī)體氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān),如圖5。研究成果將為田黃方在臨床治療由高脂飲食引起的腎損傷提供科學(xué)依據(jù)。

    圖5 THF對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的作用機(jī)制研究Figure 5 The mechanism of THF on renal injury induced by high fat diet in mice

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