苯胺類受體熒光探針識(shí)別位點(diǎn)的差異性構(gòu)筑與識(shí)別機(jī)制研究

成 昭, 鄭 蕾, 徐 玥, 何 昊

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

作為一種在分子水平進(jìn)行目標(biāo)物檢測的分析測試技術(shù),并明顯區(qū)別于諸多傳統(tǒng)檢測手段對(duì)檢測設(shè)備與樣品處理的較高要求,小分子熒光探針能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的快速、靈敏與直觀檢測[1-2]。

現(xiàn)階段針對(duì)小分子熒光探針的研究,多集中于已合成探針對(duì)諸多可能目標(biāo)物的識(shí)別性能篩選與后續(xù)定性、定量分析,而如何基于探針與目標(biāo)物分子水平的識(shí)別機(jī)制、進(jìn)行探針分子結(jié)構(gòu)的定向構(gòu)筑與合成,仍是該領(lǐng)域的研究難點(diǎn)。

本論文對(duì)苯胺類受體熒光探針進(jìn)行識(shí)別位點(diǎn)的差異性設(shè)計(jì),分別以苯胺、鄰苯二胺、間苯二胺作為起始原料,通過溴乙酸甲酯對(duì)氨基氫的取代,分別在識(shí)別基團(tuán)中引入了兩個(gè)、鄰位四個(gè)與間位四個(gè)識(shí)別位點(diǎn),定向構(gòu)筑一系列結(jié)構(gòu)相似、僅識(shí)別位點(diǎn)具有差異的探針S1、S4與S5(圖1),。通過識(shí)別位點(diǎn)數(shù)目與識(shí)別基團(tuán)空間排布的差異性設(shè)計(jì),調(diào)控探針與目標(biāo)物的結(jié)合能力,以期實(shí)現(xiàn)對(duì)探針與目標(biāo)物結(jié)合過程的識(shí)別機(jī)制研究。

圖1 探針S1、 S4、 S5的結(jié)構(gòu)

本文以苯胺、鄰苯二胺、間苯二胺、溴乙酸甲酯、三氯氧磷等為原料,經(jīng)3步合成得到一系列苯胺型熒光探針S1、S4、S5(光譜測試中使用探針S1、S4、S5的銫鹽,即T1、T4、T5),合成路線(以S4/T4為例， Scheme 1)。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XT-4型顯微熔點(diǎn)儀;SHIMADZU UV-1700型紫外分光光度計(jì);Bruker AVANCE III 400 MHz型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(CDCl3、 CD3OD為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));Bruker TENSOR T-27型傅里葉變換紅外光譜儀(KBr壓片);Bruker microTOF-QⅡ ESI-Q-TOF LC/MS/MS型飛行時(shí)間-質(zhì)聯(lián)儀;PerkinElmer LS-55型熒光分光光度計(jì)。

苯胺、鄰苯二胺、間苯二胺、溴乙酸甲酯、三氯氧磷、無水碳酸鉀,化學(xué)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF),、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷,化學(xué)純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 合成

(1) 化合物I的合成

向25 mL乙腈中,加入鄰苯二胺(1.08 g, 0.01 mol),二異丙基乙基胺(17.4 mL, 0.1 mol),與溴乙酸甲酯為(9.4 mL, 0.1 mol),于80 ℃反應(yīng)12 h。待反應(yīng)結(jié)束,冷卻至室溫,以100 mL冰水稀釋、二氯甲烷(3×100 mL),萃取,用無水硫酸鈉干燥,真空旋干溶劑,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/正己烷=1/3,V/V)純化得1-N,N-2-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,2-二氨基苯(I)。

反應(yīng)物投入量分別為苯胺(2.28 mL, 0.025 mol),二異丙基乙胺(21.75 mL, 0.125 mol),溴乙酸甲酯(11.75 mL, 0.125 mol)，以及間苯二胺(1.08 g, 0.01 mol),二異丙基乙基胺(17.4 mL, 0.1 mol),溴乙酸甲酯為(9.4 mL, 0.1 mol),用類似的方法合成N,N-二乙酸甲酯基苯胺和1-N,N-3-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,3-二氨基苯。

N,N-二乙酸甲酯基苯胺: 淡黃色油狀液體,收率88%;1H NMR(CDCl3, 400MHz)δ: 6.75(t,J=8.0 Hz, 2H, Ar-H), 6.31(t,J=7.3 Hz, 1H, Ar-H), 6.14(d,J=8.4 Hz, 2H, Ar-H), 3.67(s, 4H, 2×-CH2-), 3.28(s, 6H, 2×-CH3); IRν: 3031.33, 2952.76, 2849.55, 1742.01, 1601.25, 1504.75, 1270.22, 1204.01, 752.82, 693.38 cm-1; ESI-MSm/z: 260.0891{[M+Na]+}。

1-N,N-2-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,2-二氨基苯: 白色粉末狀固體,收率89%, m.p.135～136 ℃;1H NMR(CDCl3, 400MHz)δ: 7.09～7.05(m, 2H, Ar-H), 6.98～6.92(m, 2H, Ar-H), 4.32(s, 8H, 4×-CH2-), 3.66(s, 12H, 4×-CH3); IRν: 2954.99, 1737.74, 1595.73, 1498.15, 1206.20, 768.23 cm-1; ESI-MSm/z: 419.1420 {[M+Na]+}。

1-N,N-3-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,3-二氨基苯: 白色粉末狀固體,收率82%, m.p.85～86 ℃;1H NMR(CDCl3, 400MHz)δ: 7.06(t,J=8.2 Hz, 1H, Ar-H), 6.07(d,J=8.1 Hz, 2H, Ar-H), 5.79(s, 1H, Ar-H), 4.11(s, 8H, 4×-CH2-), 3.75(s, 12H, 4×-CH3); IRν: 3002.65, 2951.82, 2847.39, 1727.88, 1611.92, 1576.57, 1513.09, 1196.52, 800.94, 678.11 cm-1; ESI-MSm/z: 419.1430{[M+Na]+}。

(2) 化合物II的合成

控制溫度為5～10 ℃,向20 mL DMF中,緩慢滴入POCl3(2.4 mL),再向化合物I(3.96 g, 0.01 mol)的20 mL DMF溶液中,滴入上述POCl3/DMF混合物,于75 ℃反應(yīng)4 h。待反應(yīng)結(jié)束,冷卻至室溫,將其倒入100 mL冰水中,抽濾得到固體粗品,經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/正己烷=1/1,V/V),純化得得4-甲?；?1-N,N-2-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,2-二氨基苯(II)。

反應(yīng)物投入量為N,N-二乙酸甲酯基苯胺(2.37 g, 0.01 mol), 1-N,N-2-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,2-二氨基苯/1-N,N-3-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,3-二氨基苯(3.96 g, 0.01 mol),。

4-甲?；?N,N-二乙酸甲酯基苯胺: 淡黃色粉末狀固體,收率85%, m.p.58～60 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 9.79(s, 1H, -CHO), 7.76(d,J=7.8Hz, 2H, Ar-H), 6.66(d,J=8.0 Hz, 2H, Ar-H), 4.23(s, 4H, 2×-CH2-), 3.79(s, 6H, 2×-CH3); IRν: 2824.47, 2743.11, 1746.67, 1599.54, 1523.10, 1207.48, 814.96 cm-1; ESI-MSm/z: 288.0847{[M+Na]+}。

4-甲酰基-1-N,N-2-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,2-二氨基苯: 淡黃色粉末狀固體,收率88%, m.p.114～115 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 9.84(s, 1H, -CHO), 7.60(s, 1H, Ar-H), 7.50(d,J=8.2Hz, 1H, Ar-H), 7.11(d,J=8.6Hz, 1H, Ar-H), 4.44(s, 4H, 2×-CH2-), 4.30(s, 4H, 2×-CH2-), 3.69(s, 6H, 2×-CH3), 3.67(s, 6H, 2×-CH3); IRν: 3003.45, 2955.46, 2919.72, 1740.53, 1593.81, 1505.48, 1207.25, 906.75, 834.22 cm-1; ESI-MSm/z: 447.1378 {[M+Na]+}。

4-甲酰基-1-N,N-3-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,3-二氨基苯: 淡黃色粉末狀固體,收率80%, m.p.98～99 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 9.85(s, 1H, -CHO), 7.60(d,J=8.7 Hz, 1H, Ar-H), 6.29(d,J=8.6 Hz, 1H, Ar-H), 6.09(s, 1H, Ar-H), 4.15(s, 8H, 4×-CH2-), 3.77(s, 6H, 2×-CH3), 3.74(s, 6H, 2×-CH3); IRν: 3006.48, 1744.59, 1679.51, 1605.68, 1510.75, 1475.49, 1216.20, 1169.55, 824.26, 794.20 cm-1; ESI-MSm/z: 447.1370{[M+Na]+}。

(3) 探針S1、S4、S5的合成

向20 mL無水乙醇中,加入化合物II(0.42 g, 1 mmol)與鄰苯二胺(0.11 g, 1 mmol),于80 ℃反應(yīng)8 h。待反應(yīng)結(jié)束,冷卻至室溫,真空旋干溶劑,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/正己烷=2/1,V/V),純化得目標(biāo)熒光探針S4。

反應(yīng)物投入量為4-甲?；?N,N-二乙酸甲酯基苯胺(0.27 g, 1 mmol), 4-甲酰基-1-N,N-2-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,2-二氨基苯/4-甲?；?1-N,N-3-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,3-二氨基苯(0.42 g, 1 mmol)。

4-苯并咪唑基-N,N-二乙酸甲酯基苯胺(探針S1): 白色粉末狀固體,收率71%, m.p.202～204 ℃;1H NMR(CD3OD, 400MHz)δ: 7.86(d,J=8.6Hz, 2H, Ar-H), 7.48(dd,J=5.7, 3.1 Hz, 2H, Ar-H), 7.13(dd,J=5.8, 3.0 Hz, 2H, Ar-H), 6.61(d,J=8.7 Hz, 2H, Ar-H), 4.13(s, 4H, 2×-CH2-), 3.70(s, 6H, 2×-CH3), 3.27(s, 1H, -NH-); IRν: 3599.68, 1740.71, 1614.33, 1504.57, 1446.39, 1207.37, 836.18 cm-1; ESI-MSm/z: 354.1445{[M+H]+}。

4-苯并咪唑基-1-N,N-2-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,2-二氨基苯(探針S4): 黃色粉末狀固體,收率80%, m.p.186～187 ℃;1H NMR(CD3OD, 400 MHz)δ: 7.97(s, 1H, -NH-), 7.87(d,J=1.7Hz, 1H, Ar-H), 7.67(dd,J=8.4, 1.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.58(dd,J=6.0, 3.1 Hz, 2H, Ar-H), 7.25(dd,J=6.0, 3.1 Hz, 2H, Ar-H), 7.17(d,J=8.4 Hz, 1H, Ar-H), 4.43(s, 4H, 2×-CH2-), 4.41(s, 4H, 2×-CH2-), 3.65(s, 6H, 2×-CH3), 3.64(s, 6H, 2×-CH3); IRν: 3463.73, 1744.10, 1672.38, 1612.50, 1500.43, 439.38, 1208.08, 1172.26, 938.24, 879.17 cm-1; ESI-MSm/z: 513.1984{[M+H]+}。

4-苯并咪唑基-1-N,N-3-N′,N′-四乙酸甲酯基-1,3-二氨基苯(探針S5): 黃色粉末狀固體,收率78%, m.p.189～191 ℃;1H NMR(CD3OD, 400 MHz)δ: 7.52(d,J=8.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.13(s, 2H, Ar-H), 6.81(s, 2H, Ar-H), 6. 25(s, 1H, Ar-H), 6.13(d,J=8.6 Hz, 1H, Ar-H), 3.84(s, 4H, 2×-CH2-), 3.68(s, 1H， -NH-), 3.53(s, 4H, 2×-CH2-), 3.33(s, 6H, 2×-CH3), 3.23(s, 6H, 2×-CH3); IRν: 3443.23, 1743.25, 1605.59, 1507.98, 1459.24, 1208.12, 883.82, 809.11 cm-1; ESI-MSm/z: 513.1985{[M+H]+}。

(4) 探針T1、T4、T5的合成

用于水系離子分析時(shí),將乙酸甲酯結(jié)構(gòu)的熒光探針S1、S4、S5水解為其羧酸鹽形式,即銫鹽結(jié)構(gòu)的熒光探針T1、T4、T5。水解方法為:向10 mL無水乙醇中加入S1(0.0353 g,0.1 mmol), CsOH·H2O(0.1679 g, 1 mmol), 80 ℃反應(yīng)12 h。待反應(yīng)結(jié)束、冷卻,旋干溶劑,即得到探針T1。

T4、T5的制備方法類似,反應(yīng)用量為S4/S5(0.0512 g,0.1 mmol)。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜

配制探針溶液,使S1、S4、S5濃度均為1×10-5mol L-1,進(jìn)行200～500 nm波段熒光光譜掃描,得到如圖2所示的探針熒光激發(fā)與發(fā)射光譜。由圖2可知,S1、S4、S5熒光激發(fā)與發(fā)射光譜呈現(xiàn)良好的鏡像對(duì)稱關(guān)系(S1: λex,max=325 nm, λem,max=380 nm;S4: λex,max=326 nm, λem,max=410 nm;S5: λex,max=353 nm, λem,max=410 nm),斯托克位移分別為55、 84、 57 nm。相對(duì)于S1,探針S4與S5分子中,受體部分鄰位/間位氨基的引入與氨基氫的后續(xù)修飾,使S4、S5熒光吸收與發(fā)射光譜均表現(xiàn)紅移。通過改變?nèi)〈?進(jìn)而調(diào)控探針分子的熒光光譜,對(duì)于新型熒光探針的設(shè)計(jì)具有一定的指導(dǎo)意義。

λ/nm

2.2 探針對(duì)金屬離子的選擇性

設(shè)計(jì)以堿金屬(Na+),堿土金屬(Mg2+、 Ca2+、 Ba2+),過渡金屬(Fe3+、 Fe2+、 Cu2+、Zn2+、 Cd2+、 Cr3+、 Hg2+、 Ag+)及Sn2+、 Al3+等15種常見金屬離子,進(jìn)行探針對(duì)金屬離子的選擇性研究。向1號(hào)比色管中加入探針T1/T4/T5溶液,向2～15號(hào)比色管中,分別加入Tris-HCl、探針與各金屬離子,使探針與金屬離子的終濃度均為1×10-5mol L-1,混勻后進(jìn)行300～550 nm波段內(nèi)的光譜掃描,得到圖3。由圖3(a)可知,各金屬離子的加入均未引起探針T1的熒光改變,說明T1對(duì)上述金屬離子均無響應(yīng)。探針T5與金屬混合時(shí),各金屬離子的加入均使T5熒光信號(hào)增強(qiáng),致使圖3(b)中包括Cu2+的所有T5-金屬離子體系的熒光曲線均出現(xiàn)相對(duì)于T5的增強(qiáng),只是因?yàn)镃u2+較強(qiáng)的電子效應(yīng)致使熒光部分猝滅,才使T5-Cu2+熒光曲線出現(xiàn)相對(duì)于T5的最小增幅,從而表現(xiàn)出T5-Cu2+與其他離子的差別。

λ/nm

嚴(yán)格地說,T5與所有待測離子的混合體系,均出現(xiàn)相似的、一致性的熒光增強(qiáng)變化趨勢,T5對(duì)各金屬離子不表現(xiàn)選擇性響應(yīng)。圖3(c)與(d)中,探針T4對(duì)Zn2+表現(xiàn)出增強(qiáng)型的識(shí)別,對(duì)Cu2+和Hg2+具有猝滅型響應(yīng),其它金屬離子則未引起探針T4熒光強(qiáng)度的明顯變化,說明探針T4對(duì)Zn2+/Cu2+/Hg2+呈現(xiàn)選擇性響應(yīng)。從探針的離子選擇實(shí)驗(yàn)來看,通過對(duì)T1、T4、T5進(jìn)行識(shí)別基團(tuán)中兩個(gè)、鄰位四個(gè)、間位四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的差異性設(shè)計(jì),致使識(shí)別位點(diǎn)所形成的離子包合空腔、探針與離子結(jié)合的能力均出現(xiàn)顯著差別。探針T4結(jié)構(gòu)中,鄰位N、N、N′、N′上所連接的4個(gè)乙酸根柔性鏈形成尺寸合適的包合空腔,初步實(shí)現(xiàn)了T4對(duì)Zn2+/Cu2+/Hg2+的合適作用距離與選擇性識(shí)別,結(jié)合探針分子的電子效應(yīng)變化,將能夠進(jìn)一步分析和解釋離子識(shí)別的作用機(jī)制。

Zn、Cu、Hg在生命體中廣泛分布,在多種生理過程中表現(xiàn)相應(yīng)離子濃度水平的動(dòng)態(tài)分布與動(dòng)態(tài)變化,已被證明與表現(xiàn)認(rèn)知、行動(dòng)障礙的多種退行性疾病緊密相關(guān)[3-4]。而空氣、土壤、水體中過量分布的Cu和Hg,以食物鏈富集、經(jīng)食源性攝入后,將危及人體健康[5]。探針T4對(duì)Cu2+、Hg2+和Zn2+的快速檢測,具有廣泛的應(yīng)用性[6-7]。

2.3 Zn2+/Cu2+/Hg2+對(duì)探針T4的熒光滴定曲線

向探針T4溶液中分別加入濃度依次遞增的Zn2+/Cu2+/Hg2+溶液,使T4終濃度為1×10-5mol L-1、金屬離子終濃度為0～800 μmol L-1(Cu2+),或0～1000 μmol L-1(Zn2+/Hg2+),混勻后掃描300～550 nm波段范圍,得圖4。

λ/nm

如圖4所示,當(dāng)Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度從0至800/1000 μmol L-1遞增時(shí),探針T4熒光強(qiáng)度隨Zn2+濃度升高而增強(qiáng),隨Cu2+、Hg2+濃度升高而減小。進(jìn)行熒光強(qiáng)度峰值與Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度的相關(guān)性分析[8-9],得到熒光強(qiáng)度F與[Zn2+]/[Cu2+]/[Hg2+]的線性關(guān)系(圖5,F:T4- Zn2+/Cu2+/Hg2+在410 nm處的熒光強(qiáng)度峰值)。線性方程分別為T4-Zn2+(0～16 μmol L-1): y=177.24x+6002.2(R2=0.9967),T4-Cu2+(0～16 μmol L-1): y=-343.01x+5701.6(R2=0.99),T4-Hg2+(0～16 μmol L-1):y=-395.36x+6722.8(R2=0.9904)。當(dāng)Zn2+/Cu2+/Hg2+濃度為0～16 μmol L-1時(shí),探針熒光強(qiáng)度與[Zn2+]/[Cu2+]/[Hg2+]均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,能夠進(jìn)行Zn2+/Cu2+/Hg2+的準(zhǔn)確定量分析,初步滿足μmol L-1濃度數(shù)量級(jí)的生理Zn2+/Cu2+/Hg2+檢測。

[Zn2+]/μ·mol L-1

2.4 探針T4與Zn2+/Cu2+的絡(luò)合比

分別向比色管中加入體積依次遞增的Zn2+和體積依次遞減的T4,保持T4與Zn2+總濃度為1×10-5mol L-1,使Zn2+摩爾分?jǐn)?shù)依次為0、10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%,經(jīng)熒光強(qiáng)度與Zn2+摩爾分?jǐn)?shù)分析,得到圖6(a)所示探針T4與Zn2+的Job’s曲線。由圖6(a)可知,對(duì)于T4-Zn2+的熒光增強(qiáng)型識(shí)別,Zn2+的摩爾分?jǐn)?shù)為0.5時(shí),在其熒光最大發(fā)射波長410 nm處,T4-Zn2+絡(luò)合物出現(xiàn)熒光強(qiáng)度的最大值,表明探針T4與Zn2+的定量結(jié)合比例是1∶1。

Zn2+摩爾分?jǐn)?shù)

對(duì)于T4-Cu2+的熒光猝滅型響應(yīng),由圖4(b)所示的Cu2+對(duì)探針T4的熒光滴定曲線可得到圖6(b),當(dāng)Cu2+濃度較小時(shí),探針T4熒光不完全猝滅,當(dāng)T4與Cu2+物質(zhì)的量一致或Cu2+濃度較大時(shí),探針與Cu2+達(dá)到1/1結(jié)合,探針-Cu2+絡(luò)合物熒光幾乎完全猝滅、熒光強(qiáng)度不再變化。圖4(c)與圖6(c)所示的T4-Hg2+體系,其變化趨勢類似于T4-Cu2+,可推知探針T4與Cu2+/Hg2+的定量結(jié)合比例均為1∶1。

2.5 探針識(shí)別機(jī)制

探針T4對(duì)Zn2+、 Cu2+/Hg2+表現(xiàn)差別性熒光響應(yīng),而T4-Zn2+/Cu2+/Hg2+體系的紫外吸收光譜中,吸收譜峰無明顯變化(圖7)。

λ/nm

綜合來看,T4-Zn2+/Cu2+/Hg2+體系熒光與紫外-可見光譜的不同,主要基于以下因素:一方面,依據(jù)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制[10-11],T4分子內(nèi)同時(shí)具有電子給體和電子受體,當(dāng)識(shí)別基團(tuán)與Zn2+/Cu2+/Hg2+結(jié)合時(shí),首先影響分子內(nèi)的推-拉電子作用,進(jìn)而誘使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程隨之減弱或強(qiáng)化,導(dǎo)致熒光光譜變化;而當(dāng)探針-金屬離子識(shí)別作用中的電子轉(zhuǎn)移變化引起其熒光發(fā)射信號(hào)變化時(shí),分子吸收則幾乎不受影響,紫外光譜無改變。

另一方面,探針T4識(shí)別部分的氮原子具有孤對(duì)電子、表現(xiàn)給電子作用,不飽和環(huán)作為電子受體,分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移路徑發(fā)生于電子給體至電子受體,使探針分子呈現(xiàn)熒光。1)在T4對(duì)Cu2+/Hg2+的熒光猝滅型響應(yīng)中,配位作用與探針分子內(nèi)ICT過程減弱,成為T4-Cu2+/Hg2+體系熒光強(qiáng)度變化的主要影響因素。T4結(jié)合目標(biāo)物Cu2+/Hg2+時(shí),探針提供孤對(duì)電子、金屬離子提供空軌道的配位作用,致使探針分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程被完全阻斷或部分削弱,使T4-Cu2+/Hg2+體系熒光強(qiáng)度顯著降低。此外,Cu2+/Hg2+的自旋-軌道耦合、電子或能量轉(zhuǎn)移可能進(jìn)一步加劇了熒光信號(hào)猝滅[12-13]。2)在T4與Zn2+的識(shí)別過程中,Zn2+配位能力較弱,且極化能力與變形性較弱、空軌道較少,此外,Zn的還原性遠(yuǎn)大于Cu和Hg。上述因素的綜合作用,致使Zn2+作為電子受體的能力較弱,難以接受探針提供的孤對(duì)電子、進(jìn)行配位,探針T4分子內(nèi)的ICT過程并未明顯受阻,相反,還可能因?yàn)門4-Zn2+的結(jié)合,使分子剛性略有增強(qiáng),導(dǎo)致T4-Zn2+體系熒光增強(qiáng),呈現(xiàn)與T4-Cu2+/Hg2+相反的識(shí)別方式。

綜合來看,T4鄰位四羧酸結(jié)構(gòu)的識(shí)別位點(diǎn),首先形成了合適尺寸的包合空腔[14-15],這意味著T4與Zn2+/Cu2+/Hg2+合適的分子間作用距離,區(qū)別于分子中沒有合適作用空腔的探針T1及T5(圖8),,T4自身的熒光光譜與T4-Zn2+/Cu2+/Hg2+體系的熒光光譜,因此顯現(xiàn)明顯差異。而T4對(duì)Zn2+、 Cu2+/Hg2+進(jìn)一步的識(shí)別趨勢差異,則因3種金屬離子的電子效應(yīng)、配位能力的差異而產(chǎn)生。綜上,探針T4分別與Zn2+、 Cu2+/Hg2+作用時(shí),熒光強(qiáng)度的變化趨勢不同。

圖8 探針T1、T4、T5的識(shí)別位點(diǎn)與識(shí)別性能差異

經(jīng)離子識(shí)別實(shí)驗(yàn)篩選,具有兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的探針T1對(duì)金屬離子均無響應(yīng),各種金屬離子與間位四位點(diǎn)的探針T5混合時(shí),T5熒光光譜的整體變化趨于一致,對(duì)各金屬離子無顯著性、特征性響應(yīng)差異。而鄰位四位點(diǎn)的探針T4對(duì)Zn2+表現(xiàn)特異性的熒光增強(qiáng)型識(shí)別、對(duì)Cu2+/Hg2+具有熒光猝滅型響應(yīng)。這種識(shí)別性能上的差異性,與探針T1、T4、T5識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)的差異具有直接關(guān)系[16],T1、T4、T5識(shí)別基團(tuán)中的多羧酸柔性鏈能夠形成包合空腔,通過目標(biāo)物包合、進(jìn)行目標(biāo)離子的初步響應(yīng),進(jìn)一步受到目標(biāo)離子的電子效應(yīng)、配位與還原性能綜合影響,給出各自的特征熒光信號(hào)變化,發(fā)生對(duì)不同目標(biāo)離子的特征性響應(yīng)過程。由圖8可知,探針T1的兩條羧酸柔性鏈僅構(gòu)成兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn),形成的包合空腔尺寸過小,無法有效包合目標(biāo)離子,對(duì)金屬離子均無響應(yīng)。間位四位點(diǎn)的探針T5,則因形成包合空腔的四條柔性羧酸鏈分處于間位,孔隙過大,亦無法有效包合目標(biāo)離子[17]。經(jīng)識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)與離子識(shí)別實(shí)驗(yàn)篩選,證明鄰位四位點(diǎn)的探針T4形成了尺寸合適的包合空腔,能夠容納目標(biāo)物Zn2+/Cu2+/Hg2+,并因目標(biāo)物電子效應(yīng)、配位能力的差別,對(duì)Zn2+、Cu2+/Hg2+表現(xiàn)差別性熒光響應(yīng)。

經(jīng)識(shí)別位點(diǎn)的差異性設(shè)計(jì),定向構(gòu)筑二位點(diǎn)探針T1、鄰位四位點(diǎn)探針T4與間位四位點(diǎn)探針T5,其中,探針T4結(jié)構(gòu)中處于鄰位的四條羧酸柔性鏈作為識(shí)別位點(diǎn)、形成有效的目標(biāo)物包合空腔,并受到目標(biāo)離子的電子效應(yīng)、配位與還原性能綜合影響,表現(xiàn)出對(duì)Zn2+、 Cu2+、 Hg2+的特征響應(yīng)、熒光性能穩(wěn)定,且探針T4與上述離子均以1∶1定量結(jié)合、線性關(guān)系良好,能夠初步滿足μ·mol L-1數(shù)量級(jí)的生理Zn2+、 Cu2+、 Hg2+濃度檢測。結(jié)合熒光、紫外等光譜學(xué)手段,電子效應(yīng)與識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)/包合空腔,初步闡明了探針T4對(duì)Zn2+、 Cu2+/Hg2+的不同識(shí)別機(jī)制,對(duì)于探針結(jié)構(gòu)優(yōu)化與性能篩選研究提供了研究基礎(chǔ)。