益氣養(yǎng)陰方對急性心肌缺血模型大鼠的保護作用

代培方，任蓁，牛雯穎，肖洪彬，劉思瑩，劉欣欣，任宇婷，穆欣?

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）屬于心血管病急癥之一，是由于冠狀動脈出現(xiàn)狹窄、堵塞導致心肌血供突然中斷、心肌供血不足，使心肌細胞缺血、缺氧而引起心肌功能受損和壞死的病理狀態(tài)［1-3］。數(shù)據(jù)顯示，美國和歐洲地區(qū)每年分別有約240 萬和400 萬人的因AMI 而死亡［4］?！吨袊难芙】蹬c疾病報告2020》顯示，我國心血管病負擔沉重，近年來心血管病死亡連續(xù)位居中國居民總死亡原因首位，患病率和病死率呈快速上升趨勢［5］，其中AMI 是關(guān)鍵致死因素［6］。AMI 已成為全球迫切需要解決的重大公共衛(wèi)生問題之一。現(xiàn)代醫(yī)學治療AMI 的主要手段有藥物治療、溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）、冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）等［7］。上述方法能夠快速恢復心肌血供、挽救壞死心肌組織，是早期改善臨床結(jié)局的最有效的策略。然而冠狀動脈再通治療手段并不能再生和補償心肌細胞死亡的損失，且在恢復缺血心肌血流的同時還可能會帶來再灌注損傷［8］。因此，積極尋找更為有效的AMI 防治方法和藥物至關(guān)重要。中醫(yī)古籍并沒有“心肌缺血”“心肌梗死”病名，可歸于“真心痛”“胸痹”“心痛”等范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》及現(xiàn)代中醫(yī)臨床診療指南均認為AMI 與氣虛、血瘀、痰瘀、寒凝、氣滯、氣陰兩虛等有關(guān)，因而臨床多以益氣、活血、養(yǎng)陰、通絡(luò)等法為主進行治療［9-10］。多項研究證實，中醫(yī)藥防治AMI 具有較低毒性、高生物活性的特點，對心肌缺血損傷有較好的保護作用［11-12］。但尋找更為安全有效的藥物，仍是國內(nèi)外醫(yī)藥界不懈努力的重要方向，而針對藥食同源食療方治療AMI 的研究報道卻鮮有見到。中醫(yī)學素來就有“以食代養(yǎng)、醫(yī)食同根、藥食同源”的防病、治病理念，因此，利用藥食同源物品研究和開發(fā)食療方劑學有著堅實的中醫(yī)學理論基礎(chǔ)。

本課題組前期研究建立了《中藥大辭典》《中醫(yī)方劑大辭典》藥食同源物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，從中篩選出具有補氣、養(yǎng)陰、活血作用的益氣養(yǎng)陰方，并經(jīng)過多名專家論證，確立由黃芪、葛根、西洋參、黃精、山茱萸、山藥、山楂、玉竹、豆豉9 種組成益氣養(yǎng)陰方。大量研究證實本方中的有效成分具有改善心血管功能的相關(guān)作用。為探明該方治療心肌缺血的機制，本課題組采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支經(jīng)典造模方法制備AMI 大鼠模型，通過檢測分析心電圖變化、血清肌酸激酶（CK）、羥丁酸脫氫酶（HBDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及乳酸脫氫酶（LDH）含量、心肌總超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、丙二醛（MDA）水平、心肌梗死面積等指標，對益氣養(yǎng)陰方抗心肌缺血的作用機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF清潔級10周齡健康雄性Wistar大鼠70只，體質(zhì)量250～280 g，合格證號：SCXK（黑）2019-001，使用許可證號：SYXK（黑）2019-001。實驗前大鼠予自由性飲食水，適應性喂養(yǎng)習慣環(huán)境1 周。實驗環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度50%～60%，每日徹底清潔消毒1次。

1.2 實驗儀器、試劑與藥物

儀器：MP150 多導生理記錄儀（美國BIOPAC）；HX-200小動物呼吸機（成都泰盟）；KY2000半自動生化分析儀（日本島津）。

試劑：AST試劑盒（貨號：C010-1）、CK 試劑盒（貨號：A032-1）、HBDH 試劑盒（貨號：E005-1-1）、LDH 試劑盒（貨號：A020-1）、T-SOD 試劑盒（貨號：A001-1）、GSH-Px 試劑盒（貨號：A005-1）、MDA 試劑盒（貨號：A003-1）均購于南京建成生物工程研究所；2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）。

藥物：益氣養(yǎng)陰方中各味中藥飲片均購自于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，經(jīng)藥劑科鑒定，飲片符合2015版《中華人民共和國藥典》標準。經(jīng)標準煎煮流程制備后，再將藥液后減壓濃縮為1.1 g/mL生藥，4 ℃冰箱冷藏備用，灌胃時加蒸餾水調(diào)成所需給藥濃度，溫服；硝苯地平控釋片（10 mg/片，揚子江藥業(yè)集團有限公司）；氨基甲酸乙酯（烏拉坦，天津光復精細化工研究所）。

1.3 分組及給藥

按體質(zhì)量隨機分為7 組，分別為空白組（K 組）、假手術(shù)組（J 組）、模型組（M 組）、陽性藥對照組（Y 組）和益氣養(yǎng)陰方高、中、低劑量組（分別為G 組、Z 組和D組）。適應性喂養(yǎng)1周后進行灌胃給藥14 d。按藥理學實驗方法學計算益氣養(yǎng)陰方高、中、低劑量組的給藥劑量分別為22、11、5.5 g/kg；陽性對照組給藥劑量為3.7 mg/kg；正常組和模型組灌胃等量生理鹽水。除空白組、假手術(shù)組外，其余各組連續(xù)給藥14 d 后，第15 天行左冠狀動脈前降支（left anterior descending coronary artery，LAD）結(jié)扎術(shù)制備AMI 模型，當左心室前壁出現(xiàn)灰白或發(fā)紺，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST 段弓背樣抬高≥0.1 mV時，表示造模成功［13-14］。

1.4 實驗取材和指標測定

1.4.1 心電圖監(jiān)測

連續(xù)給藥14 d 后，采用10%烏拉坦（20 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于放置恒溫動物墊實驗板上，按要求連接MP150 多導生理記錄儀，觀察并記錄大鼠正常狀態(tài)下心電圖。LAD 結(jié)扎術(shù)造模成功后，全程密切觀察心電圖的動態(tài)改變并記錄。選取7 個時間節(jié)點描記心電圖，分別是麻醉后、結(jié)扎成功后、結(jié)扎后10 min、結(jié)扎后30 min及結(jié)扎后1、2、4、6 h。

1.4.2 血清及心肌標本采集

采用腹主動脈采血法采集大鼠動脈血標本。取血4 mL，取血后立即進行離心、分離、分裝、凍存?zhèn)溆?。各組均隨機抽取3 只大鼠，取完血后迅速摘取心臟，冷鹽水沖洗干凈心腔殘血，迅速用手術(shù)刀切去結(jié)扎線以上部分，將結(jié)扎部位與心尖部之間的心臟組織以垂直心臟縱軸方向切成3 等份，取近心尖部1/3 的心肌組織，置于-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 TTC染色計算心肌梗死面積

取血后迅速摘取心臟，冷鹽水沖洗干凈心腔殘血，再置于濾紙上吸干水分，盛放于無菌小培養(yǎng)皿并用封口膜封口，再置于-20 ℃冰箱中凍存。TTC染色步驟：①凍存取出；②心臟組織切片；③TTC 染色；④避光溫育；⑤固定、觀察；⑥拍照取圖；⑦計算梗死面積比。觀察心臟組織梗死區(qū)呈灰白色，非缺血區(qū)呈磚紅色，計算心肌梗死面積比。

心肌梗死面積比= Σ 切片中蒼白區(qū)面積× 厚度/Σ 切片總面積× 厚度

1.4.4 血清心肌酶的測定

血清樣本取出后解凍處理，平衡至常溫。用KY2000 半自動生化分析儀酶比色法測定血清肌酸激酶（CK）、羥丁酸脫氫酶（HBDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及乳酸脫氫酶（LDH）活性。

1.4.5 心肌組織中抗氧化酶活力的測定

取凍存的心肌組織組織勻漿后，用ELISA 法測定GSH-Px、MDA、SOD含量水平。所有實驗步驟嚴格按照相應試劑盒說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，組間比較采用One-way ANOVA。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心電圖的改變

大鼠LAD 結(jié)扎術(shù)造模成功后，觀察其心電圖可以發(fā)現(xiàn)，與空白組及假手術(shù)組相比較，模型組和各給藥組大鼠心電圖ST 段呈進行性弓背向上抬高，T 波直立高尖，呈“小紅旗”樣，振幅增高，提示AMI 模型構(gòu)建成功；缺血30 min 達到峰值，此后振幅略下降，連續(xù)觀察6 h，見圖1。

圖1 造模前后大鼠心電圖變化

2.2 各組大鼠血清心肌酶的變化

與K 組相比，J 組血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量變化不大，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與K 組比較，M 組血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均明顯升高（P＜0.01）；與M 組比較，Y、D、Z、G 組血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），益氣養(yǎng)陰方各組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清心肌酶含量水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清心肌酶含量水平比較（±s）

注：與K組比較，##P ＜0.01；與M組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別K組J組M組Y組D組Z組G組n 10 8 9 9 8 9 9 AST（U/L）70.75±16.21 77.68±13.48 434.96±53.43##334.73±33.64**373.74±47.92*323.79±59.85**350.50±41.55**CK（U/L）302.68±37.63 347.33±53.64 656.19±86.40##475.12±75.64**555.98±62.93*499.36±80.10**501.81±89.15**HBDH（U/L）149.15±48.31 116.25±46.64 501.69±67.40##372.12±57.24**423.35±59.18*371.41±65.39**352.50±67.21**LDH（U/L）241.82±65.91 204.72±60.11 472.23±99.34##353.28±59.50*336.89±61.44*339.76±74.82*357.14±71.86*

2.3 各組大鼠心肌抗氧化酶活力水平的變化

與K 組相比，M 組大鼠心肌中SOD、GSH-Px 的活性顯著降低，MDA 的活性升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與M 組相比，Y、D、Z、G 組大鼠心肌中的SOD、GSH-Px活性均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），MDA 的活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活力水平的比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活力水平的比較（±s）

注：與K 組比較，#P ＜0.05##，P ＜0.01；與M 組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別K組J組M組Y組D組Z組G組n 10 8 9 9 8 9 9 SOD（U/L）269.16±30.04 270.32±35.51 215.83±26.91##266.58±28.97**255.05±31.17*260.93±26.88**253.41±24.88**GSH-Px（U/L）983.19±99.84 968.60±103.31 795.36±98.90##940.33±99.10**900.91±104.27*947.93±116.16**948.01±117.47**MDA（μmol/L）8.77±1.96 9.06±2.01 12.62±2.34##9.20±1.73**9.93±2.00*9.39±1.35**9.71±1.65**

2.4 各組大鼠心肌梗死面積的比較

K 組、J 組心肌組織的TTC 染色結(jié)果是全部磚紅色，沒有蒼白色，表明心肌無梗死；M 組左心室的前壁和側(cè)壁呈現(xiàn)大片白色，表明心肌出現(xiàn)大面積梗死。Y、D、Z、G組染色結(jié)果顯示，左心室前、側(cè)壁的白色面積減少，表明心肌梗死面積有所減少，見圖2。與M 組（33.32 ± 3.81）%相比，Y 組（16.67 ± 1.83）%、Z 組（15.02 ± 1.70）%、G 組（14.18 ± 1.35）%顯著下降（P＜0.05）。見圖3。

圖2 各組大鼠心肌TTC染色結(jié)果

圖3 各組大鼠心肌梗死面積的比較

3 討論

近年來，隨著人們不健康生活方式日漸普遍，心血管病危險因素對居民健康的影響越加顯著，我國心血管病的發(fā)病率和病死率持續(xù)增高，已成為我國居民首位死亡原因［5］，因此尋找能夠降低其患病率的飲食方法顯得尤為重要。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導下的藥食同源食療不僅具有悠久的歷史，而且臨床效果顯著，正契合心血管疾病的防治策略。本研究組方中黃芪、山藥、西洋參性溫味甘平，有補氣養(yǎng)陰、行滯通痹的功效；玉竹、黃精性平味甘、山茱萸性微溫味酸澀，三者并用取養(yǎng)陰固脫之功；葛根、山楂性涼味甘，有行氣、活血、散瘀之功，豆豉性味苦寒，有宣郁、解毒的功效；諸藥合用共奏益氣養(yǎng)陰、活血散瘀之功。黃芪經(jīng)常用于煎湯或代茶飲食療中，取補氣補虛之功；西洋參為補而不上火的滋補佳品，可切片生用，煎湯、泡飲、口含、研末沖服均可［15］；山藥適于做粥食用，清代名醫(yī)張錫純用山藥粥治療多種疾病；山楂自古便是有名的“果子藥”，生食、蒸煮均可，但脾胃虛弱的人不宜多食；葛根用于藥膳自古有之，陶弘景云：“葛根，人皆蒸食之”［16］；山茱萸常用于食療粥或湯佐膳，在食品加工中已應用于果酒、飲品等領(lǐng)域［17］；玉竹與黃精同屬黃精屬的代表性藥食兩用中藥，常見于湯粥、酒方等食療中，有益氣養(yǎng)陰潤燥之功［18］；淡豆豉藥食兩用歷史悠久，廣泛使用于多種食療方及各類烹飪食品中［19］。

AMI 病理生理過程十分復雜，目前大量研究證實主要與氧化應激損傷、炎性反應、鈣超載和細胞凋亡等密切相關(guān)。研究表明心肌缺血會導致機體氧化與抗氧化失衡，產(chǎn)生大量活性氧（ROS）物質(zhì)，導致氧化應激損傷［20-21］。心肌酶廣泛存在于心肌細胞中，大量ROS 造成細胞膜結(jié)構(gòu)嚴重損傷，細胞膜通透性增加甚至破裂，使心肌內(nèi)這些特異性酶不同程度釋放入血，包括AST、CK、LDH 等［22］，可作為心肌損傷的診斷性標志物［23］。當ROS 攻破細胞抗氧化防御系統(tǒng)后會耗盡細胞內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化劑，如GSH、SOD，引起多種酶失活，抑制心肌細胞能量合成，導致Ca2+超載等，進一步加重心肌損傷。脂類物質(zhì)被氧化后主要分解生成MDA，MDA又會造成細胞DNA 損傷，導致GSH-Px 及SOD 活性降低［24］。因此，以上指標的含量測定心肌細胞損傷的嚴重程度，有助于評價抗心肌藥物的作用效果［25-26］。TTC染色可直觀地觀察心肌組織梗死與缺血情況。

本實驗發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰方對AMI 大鼠的心肌細胞損傷具有保護作用。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰方低、中、高劑量組血清AST、CK、HBDH 和LDH 含量水平均低于模型組（P＜0.05）。與模型組相比，益氣養(yǎng)陰方低、中、高劑量組心肌中的SOD、GSH-Px活性均升高，MDA 的活性降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TTC染色結(jié)果顯示，D、Z、G組大鼠左心室前壁、心尖部的蒼白面積減少，表明心肌梗死面積有所減少；與模型組相比，益氣養(yǎng)陰方中、高劑量組心肌梗死面積百分比顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

綜上實驗結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰方能有效減輕AMI 大鼠的心肌損傷程度，抑制血清心肌酶的釋放，提高心肌中抗氧化酶活性，減輕MDA 水平，從而發(fā)揮保護心肌的作用，但其作用機制還需進一步的系統(tǒng)實驗研究進行證明。