基于Keap1/Nrf2信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷探討三七總皂苷對七氟烷麻醉后大鼠認(rèn)知功能障礙的影響

王帥，王佳佳，董夢真，李長生

（漯河市第二人民醫(yī)院，河南 漯河 462000）

認(rèn)知功能障礙是全麻手術(shù)患者術(shù)后常見麻醉相關(guān)并發(fā)癥，多見于65 歲以上人群，重大手術(shù)術(shù)后1 周的發(fā)生率超過25%，以認(rèn)知水平、注意力下降，記憶受損為主要臨床表現(xiàn)［1］。七氟烷是吸入式全麻代表藥物，以誘導(dǎo)迅速、刺激小、麻醉深度調(diào)節(jié)性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于多種全麻術(shù)中，但其對海馬區(qū)的抑制作用可影響老年患者認(rèn)知功能，導(dǎo)致預(yù)后不良，因而受到研究人員的普遍關(guān)注［2］。三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是中藥三七的主要活性物質(zhì)，可通脈活絡(luò)、活血祛瘀，常被用于治療心腦血管類疾病，具有抗缺氧、抗衰老、提升機體免疫力等藥理作用［3］。有研究表明［4］，PNS 可促進(jìn)卒中后抑郁模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生，從而提高其學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。然而，目前關(guān)于其對七氟烷麻醉后大鼠認(rèn)知功能障礙的治療作用報道尚少，且缺乏對應(yīng)的機制研究。因此本研究通過建立七氟烷麻醉認(rèn)知障礙大鼠模型，觀察PNS 對七氟烷麻醉后大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用，并探討其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康SD 大鼠40 只，雄性，20月齡，體質(zhì)量（550±50）g，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2018-0010。

1.2 主要藥物、試劑和儀器

三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）（純度：99%，上海依赫生物科技有限公司）；七氟烷（上海百舜生物科技有限公司）；Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）/核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-E2 related factor2，Nrf2）信號通路抑制劑ML385（美國Sigma 公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）比色法試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）；兔抗大鼠Keap1、Nrf2蛋白一抗（美國R&D公司）。

CX21 光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS 株式會社）；WD-9403 凝膠成像儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 七氟烷麻醉認(rèn)知障礙大鼠模型的制備

參考文獻(xiàn)［5］取全部SD 大鼠，隨機選取10 只設(shè)為Blank 組，其余30 只大鼠建立七氟烷麻醉認(rèn)知障礙模型，將大鼠置于自制麻醉箱內(nèi)，麻醉箱出口處連接氣體監(jiān)護(hù)儀監(jiān)控箱內(nèi)氣體濃度，入口處連接七氟烷揮發(fā)罐及氧氣瓶，接入2%七氟烷+ 50%空氣氧氣混合氣體（氧流量2 L/min）4 h，等待大鼠蘇醒后重新放回飼養(yǎng)箱，隨機分為Sevoflurane組、PNS組、PNS聯(lián)合ML385組，各10只；Blank 組麻醉箱不接入七氟烷揮發(fā)罐，其余操作同建模大鼠。

1.4 干預(yù)方式

參考文獻(xiàn)［6-7］，建模結(jié)束后次日，PNS 聯(lián)合ML385組大鼠腹腔注射PNS生理鹽水溶液（75 mg/kg），2 h 后腹腔注射溶于DMSO 的ML385（20 mg/kg）；PNS組大鼠腹腔注射PNS 生理鹽水溶液（75 mg/kg），2 h 后腹腔注射等量DMSO；Blank組、Sevoflurane組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，2 h 后腹腔注射等量DMSO。每日1次，持續(xù)14 d。

1.5 T迷宮實驗檢測認(rèn)知功能

末次干預(yù)結(jié)束后，進(jìn)行T 迷宮實驗，在左右兩臂任一臂末端放置少量食物，將大鼠放置于T迷宮入口處，觀察大鼠行為，若其可一次性選擇正確方向并進(jìn)食視作成功，若無法一次性選擇正確方向視為失??；成功則將食物放置另一臂重新測試，失敗則不改變食物位置重新測試，直至其選擇成功再改變食物位置，每只大鼠連續(xù)實驗20次，計算成功率。

成功率（%）=選擇成功次數(shù)/20×100%

1.6 組織取材

T 迷宮實驗結(jié)束后，各組大鼠禁食、禁水12 h，麻醉后抽取腹主動脈血，脫頸處死，隨機選取5 只剝離完整腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，使用切片機切為4 μm 厚切片用于HE染色，剩余5只采集腦組織海馬區(qū)，置-80 ℃冰箱保存待測。

1.7 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD檢測

取腹主動脈血注入離心管內(nèi)，冰上3 000 r/min 離心12 min（離心半徑8 cm），取其上清，按照試劑盒說明書要求，使用TBA 法檢測MDA 水平，比色法檢測GSH活性水平，羥胺法檢測SOD活性水平。

1.8 腦組織海馬區(qū)病理變化

取腦組織切片常規(guī)脫蠟、水化，蒸餾水浸泡，蘇木素浸染5 min，自來水沖洗2 min，加入分化液分化，自來水沖洗，移入促藍(lán)液浸泡，自來水沖洗，伊紅液浸染2 min，自來水沖洗，階梯濃度酒精脫水，二甲苯透明，封片劑封片，置于光鏡下觀察腦組織海馬區(qū)病理變化，并拍照記錄。

1.9 腦組織中Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)水平

取冷凍保存的腦組織，剪碎并充分研磨，加入PBS勻漿，移至離心管，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，冰上10 000 r/min 離心8 min（離心半徑10 cm），經(jīng)BCA 試劑盒定量蛋白。取50 μg 待測蛋白，以1∶4 體積比與Loading Buffer 緩沖液融合，金屬浴煮沸5 min 變性蛋白，同條件離心取其上清，恒壓下進(jìn)行凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST 洗膜，與工作濃度1∶500的兔抗大鼠Keap1、Nrf2混合，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，加入發(fā)光液顯色，置于暗室內(nèi)曝光，凝膠成像分析儀拍照并分析結(jié)果，以Keap1、Nrf2 蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值代表Keap1、Nrf2 蛋白相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計量資料，以多因素方差分析檢驗多樣本計量資料，方差齊采用LSD-t檢驗分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組T迷宮實驗成功率比較

Blank、Sevoflurane、PNS、PNS 聯(lián)合ML385 組大鼠T迷宮實驗成功率分別為（95.00 ± 1.27）%、（50.00 ±5.68）%、（75.00 ± 6.92）%、（65.00 ± 6.39）%，與Blank 組比較，Sevoflurane 組大鼠T 迷宮實驗成功率降低（P＜0.05）；與Sevoflurane 組比較，PNS 組大鼠T 迷宮實驗成功率升高（P＜0.05）；與PNS 組比較，PNS 聯(lián)合ML385組大鼠T迷宮實驗成功率降低（P＜0.05）。

2.2 各組血清MDA水平與GSH、SOD活性比較

與Blank組比較，Sevoflurane組血清MDA水平升高、GSH、SOD 活性降低（P＜0.05）；與Sevoflurane 組比較，PNS 組血清MDA 水平降低、GSH、SOD 活性升高（P＜0.05）；與PNS組比較，PNS聯(lián)合ML385組血清MDA水平升高、GSH、SOD活性降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組血清MDA水平與GSH、SOD活性比較（±s）

表1 各組血清MDA水平與GSH、SOD活性比較（±s）

注：與Blank 組比較，aP ＜0.05；與Sevoflurane 組比較，bP ＜0.05；與PNS組比較，cP ＜0.05。

組別Blank組Sevoflurane組PNS組PNS聯(lián)合ML385組n 10 10 10 10 MDA（mmol/g）0.92±0.11 1.98±0.19a 1.22±0.26b 1.57±0.15c GSH（μmol/g prot）358.82±45.21 168.34±20.31a 236.52±27.82b 196.41±26.41c SOD（μmol/g prot）89.42±10.24 39.65±5.27a 62.39±7.35b 48.52±5.98c

2.3 各組腦組織海馬區(qū)病理變化情況比較

HE 染色結(jié)果顯示，Blank 組腦組織海馬區(qū)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，神經(jīng)元輪廓清晰，胞核大而圓，染色較淺；Sevoflurane 組腦組織海馬區(qū)結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞排列疏松，大量神經(jīng)元縮小壞死，胞核固縮呈多邊形，染色深；PNS 組、PNS 聯(lián)合ML385 組腦組織海馬區(qū)結(jié)構(gòu)破壞程度較低，細(xì)胞排列不均，部分神經(jīng)元腫脹、變性，胞核腫大，染色較深，PNS組比PNS聯(lián)合ML385組病理改善更明顯。見圖1。

圖1 HE染色觀察各組腦組織海馬區(qū)病理變化圖（HE，×200，標(biāo)尺50 μm）

2.4 各組腦組織Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)比較

與Blank 組比較，Sevoflurane 組大鼠腦組織Keap1 蛋白表達(dá)降低，Nrf2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與Sevoflurane 組比較，PNS組大鼠腦組織Keap1 蛋白表達(dá)降低，Nrf2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與PNS 組比較，PNS 聯(lián)合ML385 組大鼠腦組織Keap1 蛋白表達(dá)升高，Nrf2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 Western Blot法檢測腦組織Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)

表2 各組腦組織Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組腦組織Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與Blank 組比較，aP ＜0.05；與Sevoflurane 組比較，bP ＜0.05；與PNS組比較，cP ＜0.05。

組別Blank組Sevoflurane組PNS組PNS聯(lián)合ML385組n5 5 5 5 Keap1 0.96±0.12 0.63±0.07a 0.15±0.03b 0.37±0.04c Nrf2 0.12±0.02 0.32±0.04a 0.52±0.06b 0.40±0.05c

3 討論

認(rèn)知功能障礙是麻醉引發(fā)的中樞神經(jīng)功能紊亂綜合征，可導(dǎo)致術(shù)后患者記憶力降低、活動受限，由于老年人各項生理功能的退化，機體調(diào)節(jié)能力隨之降低，使大腦對麻醉藥物的敏感性增強，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［8］。年齡、手術(shù)類型、麻醉、基礎(chǔ)代謝疾病是術(shù)后認(rèn)知功能障礙的主要危險因素［9］。目前關(guān)于其發(fā)病機制尚未完全闡明，多認(rèn)為與氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)加劇、海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)異常等因素有關(guān)，其中氧化應(yīng)激損傷是引發(fā)認(rèn)知功能障礙的重要機制［10］。七氟烷麻醉可使機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過量氧自由基，從而造成氧化應(yīng)激損傷。LIU 等［11］研究認(rèn)為，七氟烷可增強幼鼠海馬組織氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)海馬組織神經(jīng)元凋亡。因此，探究高效、安全的抑制氧化應(yīng)激損傷的藥物或手段，對于降低老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)生率、改善預(yù)后具有積極作用。

中醫(yī)古籍中對麻醉引起的認(rèn)知功能障礙無明確記載，現(xiàn)代學(xué)者通常將其歸于“健忘”“癡呆”“癲狂”等范疇，其病機主要為年老體弱、腎精虧虛，以致髓海失充、腦失所養(yǎng)、血氣不足、氣滯血瘀、腦絡(luò)痹阻，以致發(fā)病，故治療應(yīng)以活血化瘀、益氣健脾、滋陰養(yǎng)血為主［12］。三七是我國云南道地藥材，取自五加科人參屬植物三七的干燥根，性溫，味甘、微苦，歸肝經(jīng)、胃經(jīng)，可活血祛瘀、消腫止痛。清末名醫(yī)張錫純所著《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中記載：“三七善化瘀血，又善止血妄行，為吐衄要藥，病愈后不至于瘀血留于經(jīng)絡(luò)”［13］。本研究結(jié)果顯示，與Sevoflurane組比較，PNS組大鼠T迷宮實驗成功率，血清GSH、SOD 活性升高，血清MDA 水平降低，提示PNS 可改善七氟烷麻醉后大鼠認(rèn)知功能障礙，抑制其氧化應(yīng)激反應(yīng)。PNS是自三七中提取的多種單體皂苷及微量元素、多糖等多種活性成分的組分，其含量是判斷三七品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)［14］。LIU等［15］研究認(rèn)為，PNS可保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元，逆轉(zhuǎn)Aβ1-42誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知障礙，提升其學(xué)習(xí)能力及記憶力，提示PNS具有神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用。

Keap1/Nrf2 信號通路是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要的抗氧化防御性通路，可抵御細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，在神經(jīng)性疾病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［16］。Nrf2 是CNC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是抗氧化反應(yīng)核心轉(zhuǎn)錄因子，Keap1 是Kelch 家族重要阻遏蛋白，是一種Nrf2 抑制多肽。正常生理條件下，Nrf2 與Keap1 在Neh2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合后存在于細(xì)胞質(zhì)中，非激活狀態(tài)Nrf2 被泛素化進(jìn)而降解，當(dāng)機體發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2 被激活與Keap1 解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件（antioxident response element，ARE）對應(yīng)位點結(jié)合，激活通路下游抗氧化酶、解毒酶基因轉(zhuǎn)錄，與相關(guān)因子共同作用提升細(xì)胞抗氧化能力［17］。YAN 等［18］研究認(rèn)為，激活Keap1/Nrf2 通路可減少細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，改善線粒體功能障礙，抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)組織，對阿爾茨海默病大鼠產(chǎn)生治療作用，提示Keap1/Nrf2 通路可作為神經(jīng)類疾病潛在治療靶點。本研究結(jié)果顯示，與Sevoflurane 組比較，PNS 組大鼠腦組織Keap1 蛋白表達(dá)降低，Nrf2 蛋白表達(dá)升高，且在PNS 基礎(chǔ)上增用Keap1/Nrf2 信號通路抑制劑ML385 可減弱PNS 對七氟烷麻醉后大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用，提示PNS 可能通過介導(dǎo)該通路，抑制腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對七氟烷麻醉后認(rèn)知功能障礙大鼠產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，PNS 可改善七氟烷麻醉后大鼠認(rèn)知功能障礙，抑制腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，推測其作用機制可能與激活Keap1/Nrf2信號通路有關(guān)。