知母多糖對甲亢熱證大鼠肝臟代謝的影響

趙金椽，南洋，陳平平，劉樹民

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

中藥藥性是對中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)和對病證治療作用的高度概括［1］。但由于中藥成分具有多途徑、多靶點協(xié)同作用的復(fù)雜性，很難通過常規(guī)研究來詮釋中藥整體寒、熱藥性的科學(xué)內(nèi)涵，這成為中藥藥性理論研究工作中的難點［2］。而借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，中藥的藥性歸屬有望通過動物實驗以及系統(tǒng)生物學(xué)等方法予以科學(xué)闡釋［3］?，F(xiàn)代研究表明，寒性中藥對機體基礎(chǔ)代謝率有抑制作用，對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、物質(zhì)能量代謝系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)均可產(chǎn)生不同程度的影響［4］。同時，現(xiàn)代生物學(xué)研究認為，熱證的本質(zhì)是由于中樞興奮性神經(jīng)細胞的激活，啟動了神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，使內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)的物質(zhì)能量代謝發(fā)生不同程度的提升［5］。由于熱證模型與物質(zhì)能量代謝息息相關(guān)，因此通過觀察寒性藥物對熱證模型代謝產(chǎn)物的干預(yù)效果，可以完善中醫(yī)證候物質(zhì)基礎(chǔ)和寒性中藥藥性的評價方法，進一步豐富和詮釋中藥性味理論的科學(xué)內(nèi)涵［6］。

知母是臨床常用的寒性藥，其藥性歸屬已從神經(jīng)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和物質(zhì)能量代謝干預(yù)等方面被證實［7］，然而其藥效發(fā)揮的具體作用機制與藥性表征的核心物質(zhì)基礎(chǔ)仍有待研究。多糖是細胞表面信號識別、抗原抗體反應(yīng)、細胞間信息的傳遞和感受的關(guān)鍵因子，對于具有生物活性的多糖的研究日益受到重視［8］。知母多糖（Rhizoma Anemarrhenae polysaccharide，RAPS）是知母的主要活性成分之一［9］。藥理學(xué)研究顯示，RAPS 具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降血糖等多種作用［10］。為進一步總結(jié)知母的藥性歸屬并深入研究其藥理作用，筆者觀察了RAPS 對典型熱證模型［11］大鼠肝臟代謝的干預(yù)作用，以期從物質(zhì)能量代謝角度揭示中醫(yī)熱證的實質(zhì)和RAPS 及知母對機體作用的內(nèi)在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠24 只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，SPF 級，體質(zhì)量（220 ± 20）g，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（黑）3013-004，使用許可證號：SYXK（黑）2013-012。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22 ± 2）℃，相對濕度55%～65%，9 時—21 時人工燈光照明，標準大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實驗。實驗動物的飼養(yǎng)和使用經(jīng)院內(nèi)動物保護委員會許可。

1.2 實驗藥物、制備及主要試劑

知母生藥材購自世一堂中藥材有限公司，產(chǎn)地為河北安國，批號：130916；優(yōu)甲樂左甲狀腺素鈉片（優(yōu)甲樂，德國默克公司）；乙腈（色譜級，Dikma 科技公司）；甲酸（色譜級，Dikma 科技公司）；亮氨酸-腦啡肽（美國Sigma-Aldrich公司）。

RAPS 提取參照知母拆分組分制備方法［12］，將知母生藥材與純化水按照體積比1∶10 浸泡12 h 后，95 ℃回流浸提3 次，每次1 h，合并藥液后，用80%乙醇過夜沉淀3 次，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏，過D101 大孔樹脂，經(jīng)水洗脫得RAPS 水溶液，總提取率2.3%，凍干粉于4 ℃存放；用研缽將優(yōu)甲樂研成細粉，純凈水溶解混勻，配成濃度為12 mg/mL 的優(yōu)甲樂混懸溶液。

1.3 實驗儀器

AL204 電子天平（Mettler Toledo 儀器上海有限公司）；AcquityTMUPLC 超高液相色譜儀、Premier LCT XE 型TOF-MS 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組、造模、給藥

將24只大鼠隨機分為3組：對照組（K 組）、模型組（M 組）和RAPS 給藥組（D 組），每組8 只。于每日9 時給予M 組和D 組大鼠優(yōu)甲樂混懸液進行造模，優(yōu)甲樂給藥劑量為120 mg/kg，K 組給予等體積蒸餾水；同時于每日17 時給予D 組大鼠RAPS 24.8 mg/kg，相當(dāng)于生藥1 080 mg/kg（2020 版《中華人民共和國藥典》中記載的臨床最高日劑量生藥量），K 組和M 組給予等體積蒸餾水，連續(xù)15 d。

1.4.2 肝臟樣品采集

末次給藥后禁食12 h，用20%烏拉坦將大鼠麻醉，于相同部位取各組大鼠肝臟，迅速置于液氮中冷凍，用預(yù)冷生理鹽水制成10%肝組織勻漿。

1.4.3 代謝物分析

1.4.3.1 色譜柱

BEHC18 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，Waters），流動相：A 為乙腈（0.1%甲酸），B 為水（0.1%甲酸），柱溫：40 ℃，進樣量：2.00 μL；梯度洗脫條件見表1。

式中，Mijk為存儲在第k排貨架，第i列、第j行貨位的貨物的質(zhì)量；h為貨位高度；xijk為判斷貨位是否為空的決策變量。

表1 UPLC洗脫條件

1.4.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件見表2。準確質(zhì)量校正采用亮氨酸-腦啡肽（［M + H］+= 556.277 1，［M - H］-= 554.261 5），校正溶液進樣速度為100 μL/min，校正頻率為15 s，采集范圍為m/z 50～1 500 Da。

表2 質(zhì)譜條件

1.4.3.3 代謝組數(shù)據(jù)分析

本研究采用Progenesis QI 軟件，導(dǎo)入代謝組數(shù)據(jù)后，對各組數(shù)據(jù)進行非監(jiān)督主成分分析（PCA）和監(jiān)督型主成分分析（OPLS-DA），然后選取各組變量重要性投影（VIP）＞1，組間差異P＜0.05 的代謝物。經(jīng)HMDB 數(shù)據(jù)庫比對，對各組所得差異代謝物進行定性，并運用MetaboAnalyst 5.0 平臺［13］對代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 代謝物分析

三組PCA分析結(jié)果見圖1。正、負離子模式下均可見各組間明顯分離，各組內(nèi)高度聚集，表明各組代謝物主成分差異顯著。分別將M組與K組（M/K組）、D組與M組進行比對（D/M組），得到M組與D組的顯著差異代謝物，經(jīng)與HMDB數(shù)據(jù)庫比對后鑒定得到M/K組差異代謝物共11個，D/M組共10個，兩組共有6個。見表3。

表3 組間比對差異代謝物

圖1 三組PCA結(jié)果圖

2.2 代謝通路分析

將M/K組和D/M 組差異代謝物分別進行代謝通路顯著性分析，選擇數(shù)據(jù)庫代表物種為大鼠，富集分析運用超幾何分布檢驗，拓撲學(xué)分析運用中介中心算法。代謝通路顯著性分析結(jié)果見圖2。兩組結(jié)果均顯示甘油磷脂代謝（glycerophospholipid metabolism）最為顯著（P＜0.001），且磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酸（PA）同時參與此途徑。進一步分析發(fā)現(xiàn)，M/K組結(jié)果中M 組PC 下調(diào)，PE 和PA 上調(diào)；同時，D/M 組結(jié)果中D 組PC 上調(diào)，PE 和PA 下調(diào)。可見其所引起的主要代謝通路變化為互逆過程。此外，由PC參與的亞油酸代謝（linoleic acid）在兩組變化均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 差異代謝物通路顯著性分析氣泡圖

3 討論

PC、PE與PA皆為甘油磷脂代謝的核心節(jié)點，且三者可通過不同途徑互相轉(zhuǎn)化［14］。甘油磷脂是機體內(nèi)含量最多的一類磷脂，與許多代謝類疾病相關(guān)，其異常變化是肝臟代謝異常的特征之一［15］。在肝臟，脂質(zhì)通過與膽堿親合，促進脂肪以磷脂的形式由肝臟通過血液向外輸送，并增強脂肪酸在肝臟的利用，這是熱證機體物質(zhì)能量代謝提升的一大表現(xiàn)［16］。由實驗結(jié)果可知，熱證模型大鼠肝臟中PC 下調(diào)，PE 和PA 上調(diào)，表明PC的利用增強，向PE和PA發(fā)生了轉(zhuǎn)化，并由此引發(fā)甘油磷脂代謝的異常，這也是熱證的一種特征表現(xiàn)［2，16-17］；而給予RAPS 的大鼠PC 上調(diào)，PE 和PA 下調(diào)，逆轉(zhuǎn)了此代謝通路的變化，是RAPS 藥效發(fā)揮與寒性藥性在代謝層面的具體體現(xiàn)；此外，由PC 表達量變化引起的亞油酸代謝的顯著改變可知，PC 是整個代謝通路的關(guān)鍵節(jié)點。見圖3。

圖3 知母多糖對模型甘油磷脂代謝調(diào)節(jié)示意圖