鹽脅迫下3種外源物對高羊茅生理指標的影響

林之林，郝 田，于景金，楊志民

（南京農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院, 江蘇 南京 210095）

鹽脅迫作為非生物脅迫之一，是限制作物生長的一個重要的環(huán)境因素[1-2]，導(dǎo)致草類植物發(fā)育不良和秋季早衰[3]。隨著人類對土壤的不合理利用，土壤鹽漬化已成為世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最大的環(huán)境威脅之一[4]。預(yù)計到2050年，將有50%可耕地嚴重鹽堿化[5]。鹽脅迫對植物的傷害主要體現(xiàn)在兩個方面，分別為滲透脅迫和離子毒害。鹽脅迫使植物細胞水勢降低，限制根系對水分的吸收，同時因攝入過量的鈉離子(Na+)和氯離子(Cl-)使膜的完整性和功能受到干擾[6]。經(jīng)過長期進化，植物可以通過形態(tài)的變化和生理機制的改變等途徑，耐受一定程度的鹽脅迫[7]。比如通過調(diào)控小分子有機物(脯氨酸、甜菜堿以及一些多糖分子物質(zhì))[8]和無機離子(Na+、Cl-、K+等)的濃度維持細胞內(nèi)膨壓，穩(wěn)定酶分子活性，使鹽離子在不直接傷害植物細胞的同時，還可形成相對穩(wěn)定的吸水能力[9-10]。然而，在重度鹽脅迫條件下，單靠植物自身調(diào)節(jié)難以維持其正常的生命活力。

目前研究表明，可以通過改良土壤和改進灌溉技術(shù)控制土壤中鹽分積累，或借助系統(tǒng)選育、輻射誘變、分子標記輔助育種等手段選育耐鹽品種[11]，但利用外施化學物質(zhì)對植物進行耐鹽性調(diào)控的方法更加簡便有效。前人研究發(fā)現(xiàn)外源施用鉀鹽可在一定程度上彌補鹽脅迫下小麥(Triticum aestivum)體內(nèi)K+虧缺引起的離子失衡，使小麥得以維持相對正常的生理活動[12]；外源甜菜堿可通過調(diào)節(jié)紫花苜蓿(Medicago sativa)體內(nèi)抗氧化酶的活性保持細胞膜的穩(wěn)定性，最終達到緩解鹽脅迫的目的[13]；外源抗壞血酸使黃芩(Scutellaria baicalensis)體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量積累，從而增強黃芩的滲透調(diào)節(jié)能力，進一步緩解鹽脅迫對其造成的傷害[14]。

高羊茅(Festuca arundinace)是禾本科羊茅屬的多年生草本植物，因適應(yīng)性強、產(chǎn)量高、綠期長而被作為草坪草和飼草廣泛應(yīng)用[15]。由于近年來土壤鹽漬化的問題愈發(fā)嚴重，如何提高高羊茅在鹽脅迫下的適應(yīng)能力，對今后草坪的建植和管理具有重要的現(xiàn)實意義。因此，本研究以高羊茅為試驗材料，探討3種外源物質(zhì)K2SO4、GB和AsA緩解高羊茅鹽害的生理機制，以期為高羊茅在鹽堿地的應(yīng)用和管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗在南京農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院人工氣候室進行，供試材料選用高羊茅(F.arundinace‘Arid 3’)。選擇均勻一致的種子按3.0 g·m-2的播種量播于PVC管(深度50 cm，直徑11 cm)中，基質(zhì)為長江水洗沙。播種后每2 d澆灌去離子水1次，每次每盆500 mL，生長期間按照1/3原則定期修剪，修剪高度為5 cm。材料經(jīng)3個月預(yù)培養(yǎng)，待健康狀況良好、生長均勻一致后開始處理。

1.2 試驗設(shè)計

在材料處理期間，生長室環(huán)境條件為25 ℃/18 ℃(晝/夜)，相對濕度為70%，810 μmol·(m2·s)-1光照，處理期間不修剪。所有試驗材料保持每日澆灌，每次每管澆灌250 mL去離子水或NaCl水溶液于基質(zhì)中，避免溶液接觸葉片。為避免鹽激傷害，鹽脅迫各處理的鹽濃度從0開始，以每天50 mmol·L-1濃度逐漸增加，直至達到預(yù)定濃度250 mmol·L-1。試驗分別在非鹽脅迫(CK)及鹽脅迫處理下設(shè)置3個外源噴施處理：3.27 mmol·L-1的K2SO4、100 mmol·L-1甜菜 堿(glycine bataine, GB)[16]和20 mmol·L-1抗 壞 血酸(ascorbate, AsA)[17]，3種 化 學 物 質(zhì) 的 濃 度 通 過 前期濃度梯度篩選試驗確定。每7 d進行一次葉面噴施[17]，每次每管20 mL，并保證均勻噴施至藥液呈水滴狀自然落下。第一次葉面噴施為正式試驗前3 d的 17:00，之后每次均在取樣后同一時間噴施。每個處理4個重復(fù)，分別在鹽處理開始的0、7、14、21、28、35 d觀測并隨機選取完全展開葉用于后續(xù)測定。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 形態(tài)指標的測定

采用目測法評定草坪質(zhì)量(turf quality, TQ)，以全美草坪草評價體系(The National Turfgrass Evaluation Program, NTEP)為參考標準[18]。

1.3.2 生理指標的測定

參考Barrs和Weatherley[19]的方法測定葉片相對 含水量(relative water content, RWC)；采用Vapor Pressure Osmometer 5520滲透儀(Wescor, Inc., Logan,UT)測定滲透調(diào)節(jié)(osmotic ajustment, OA)；電解質(zhì)滲漏率(electronic leakage, EL)通過電導(dǎo)率儀測定并計算[20]；利用巴比妥酸顯色法測定葉片中丙二醛(MDA)含量[20]；葉片中過氧化氫(H2O2)含量通過二氨基聯(lián)苯胺水溶液(DAB, pH 5.8)染色鑒定。

1.3.3 Na+、K+含量及抗氧化物酶的測定

剪取并稱量大約1.0 g完全展開葉，葉片用去離子水沖洗干凈后裝袋烘干。將干樣磨碎并稱取0.1 g，微波消解后用電感藕合等離子體發(fā)光光譜分析(ICP)測量對應(yīng)離子含量。過氧化氫酶(catalase, CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性的測定分別參考Aebi[21]和Nakano[22]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0程序分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢測，平均數(shù)間采用Fisher最小顯著差數(shù)法(LSD)檢測差異，顯著水平P＜ 0.05。用SigmaPlot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種外源物質(zhì)對鹽脅迫下高羊茅草坪質(zhì)量的影響

非鹽脅迫下噴施3種外源物對高羊茅的草坪質(zhì)量影響差異不顯著(P＞ 0.05) (圖1、圖2)。在鹽脅迫下，高羊茅的草坪質(zhì)量總體上隨著處理時間延長而下降，葉片逐漸枯黃。鹽脅迫處理35 d時，噴施去離子水、K2SO4、GB、AsA處理的草坪質(zhì)量相較于0 d分別下降了69.94%、57.41%、38.42%、47.85%，葉面噴施K2SO4、GB和AsA處理的草坪質(zhì)量與去離子水處理相比分別顯著升高了19.72%、30.09%和24.14%(P＜ 0.05)。這表明噴施3種外源物質(zhì)后，均可以顯著抑制鹽脅迫下高羊茅草坪質(zhì)量的下降。

圖1 鹽脅迫下3種外源物對高羊茅表型的影響Figure 1 Effect of three substances on phenotype of tall fescue under salt stress

圖2 非鹽脅迫和鹽脅迫下3種外源物對高羊茅草坪質(zhì)量的影響Figure 2 Effect of three substances on the turf quality of tall fescue under non-salt stress and salt stress

2.2 3種外源物質(zhì)對鹽脅迫下高羊茅葉片相對含水量的影響

鹽脅迫下，各處理葉片相對含水量均隨著鹽處理時間的增加而持續(xù)下降(圖3)。0和7 d的葉片相對含水量均無明顯變化，14 d時葉面噴施K2SO4和GB處理比同時期去離子水處理分別升高了4.91%和5.67% (P＜ 0.05)。35 d時噴施AsA、K2SO4和GB處理比同時期去離子水處理分別顯著升高了6.89%、2.61%和8.77%。未受鹽脅迫時，噴施K2SO4、GB、AsA對其相對含水量的影響均沒有顯著差異。

圖3 非鹽脅迫和鹽脅迫下3種外源物對高羊茅相對含水量的影響Figure 3 Effect of three substances on the relative water content of tall fescue under non-salt stress and salt stress

2.3 3種外源物質(zhì)對鹽脅迫下高羊茅滲透調(diào)節(jié)的影響

在鹽脅迫下，高羊茅葉片滲透壓隨時間增加呈現(xiàn)上升的趨勢(圖4)。鹽脅迫7 d時，僅噴施GB的高羊茅葉片滲透壓與去離子水處理呈顯著差異(P＜0.05)；35 d時，噴施GB、K2SO4和AsA的高羊茅葉片滲透壓分別比噴施去離子水處理顯著高出171.74%、89.13%和93.47%。

圖4 鹽脅迫下3種外源物對高羊茅滲透壓的影響Figure 4 Effect of three substances on the osmotic adjustment of tall fescue under salt stress

2.4 3種外源物質(zhì)對鹽脅迫下高羊茅電解質(zhì)滲漏率的影響

高羊茅在正常環(huán)境下，各處理間電解質(zhì)滲漏率均無顯著差異(P＞ 0.05) (圖5)。在鹽脅迫下，各處理高羊茅葉片的電解質(zhì)滲漏率均隨鹽處理時間增加而升高，而噴施K2SO4、GB、ASA后電解質(zhì)滲漏率均有一定程度的下降。鹽脅迫14 d時噴施GB和AsA處理比同時期的去離子水處理的電解質(zhì)滲漏率分別下降了19.89%和19.32%，35 d時則分別下降了41.84%和27.42% (P＜ 0.05)，噴施K2SO4處理僅在鹽處理28 d時顯著低于去離子水。

圖5 非鹽脅迫和鹽脅迫下3種外源物對高羊茅電解質(zhì)滲漏率的影響Figure 5 Effect of three substances on the electrolyte leakage of tall fescue under non-salt stress and salt stress

2.5 3種外源物質(zhì)對鹽脅迫下高羊茅離子含量的影響

正常環(huán)境下葉面噴施去離子水、K2SO4、GB、AsA，對其葉片Na+濃度均無顯著影響(P＞ 0.05) (圖6)。而在鹽脅迫下，葉片Na+濃度隨處理時間的增加而增加，噴施3種外源物質(zhì)可以明顯抑制Na+濃度的上升。各處理間7 d時葉面噴施K2SO4、AsA和GB處理相比同時期去離子水處理的Na+濃度分別顯著降低了36.67%、55.85%和69.07% (P＜ 0.05)，35 d時分別顯著降低了34.64%、43.49%和37.15%。

在正常環(huán)境下，噴施去離子水、K2SO4、GB和AsA對高羊茅葉片K+濃度影響均無明顯差異(P＞ 0.05)(圖6)。在鹽脅迫下，只有葉片噴施K2SO4處理的高羊茅葉片K+濃度呈現(xiàn)明顯上升趨勢，35 d時葉片中K+濃度比0 d上升102.55%，其余3個處理的葉片K+濃度均未隨處理時間延長而變化。

高羊茅葉片在正常環(huán)境下，各處理高羊茅葉片Na+/K+均無明顯變化(P＞ 0.05) (圖6)。而在鹽脅迫下，隨處理時間增加逐漸上升。其中葉面噴施去離子水處理的高羊茅葉片Na+/K+上升最為明顯，35 d時，葉面噴施K2SO4、GB和AsA處理的葉片Na+/K+較之去離子水處理分別顯著降低了59.65%、51.54%和38.99% (P＜ 0.05)，但3個處理間無明顯差異。

圖6 非鹽脅迫和鹽脅迫下3種外源物對高羊茅離子含量的影響Figure 6 Effect of three substances on the ion content of tall fescue under non-salt stress and salt stress

2.6 3種外源物質(zhì)對鹽脅迫下高羊茅丙二醛含量的影響

在正常環(huán)境下，葉面噴施去離子水、K2SO4、GB、AsA后高羊茅葉片丙二醛含量均無明顯變化(P＞0.05) (圖7)。在鹽脅迫下，各處理高羊茅葉片的丙二醛含量均隨鹽處理時間的延長而逐漸增加，噴施3種外源物質(zhì)可以抑制丙二醛的積累。28 d時葉面噴施K2SO4、GB和AsA處理相比同時期去離子水處理的MDA含量分別顯著降低了32.54%、32.76%和36.84% (P＜ 0.05)，35 d時葉面噴施GB和AsA處理相比去離子水處理的丙二醛含量顯著降低了32.01%和28.67%，而噴施K2SO4處理丙二醛含量無顯著差異。

圖7 非鹽脅迫和鹽脅迫下3種外源物對高羊茅丙二醛含量的影響Figure 7 Effect of three substances on the MDA content of tall fescue under non-salt stress and salt stress

2.7 3種外源物質(zhì)對鹽脅迫下高羊茅抗氧化酶活性的影響

正常條件下，高羊茅葉片經(jīng)過DAB染色后，顏色沒有明顯變化(圖8)。而在鹽脅迫下，葉片噴施去離子水處理的葉片經(jīng)DAB染色后，處理7 d的葉片顏色開始明顯加深，這一趨勢一直持續(xù)到35 d。噴施K2SO4和AsA處理7 d時葉片顏色沒有明顯變化，二者均在14 d時顏色加深。相比之下，噴施GB處理的葉片經(jīng)DAB染色后，直到21 d才開始出現(xiàn)顏色加深的現(xiàn)象。鹽脅迫處理35 d時，噴施去離子水處理葉片顏色最深，K2SO4次之，噴施GB處理的葉片顏色最淺。

圖8 非鹽脅迫和鹽脅迫下3種外源物對高羊茅葉片DAB染色觀察Figure 8 Effect of three substances on the DAB staining observed in tall fescue under non-salt stress and salt stress

正常條件下，葉面噴施去離子水、K2SO4、GB、AsA處理的高羊茅葉片CAT酶活性并無明顯變化，處理間也無顯著差異(P＞ 0.05) (圖9)。在鹽脅迫初期，由于受到NaCl脅迫，各處理高羊茅葉片CAT活性均明顯上升，而后隨鹽脅迫時間的延長而逐漸下降。其中噴施K2SO4、GB、AsA處理后葉片CAT含量均在14 d時達到峰值，相較于0 d分別上升了55.45%、61.81%和51.92%，而后明顯下降；噴施去離子水處理的葉片CAT含量在21 d達到峰值，相較于0 d上升了53.09%，后隨之下降。鹽脅迫處理35 d時，葉面噴施去離子水或K2SO4的高羊茅葉片CAT活性相較于28 d分別驟降40.93%和34.09%，而GB、AsA處理分別下降了7.92%和7.44%。

圖9 非鹽脅迫和鹽脅迫下3種外源物對高羊茅CAT活性的影響Figure 9 Effect of three substances on the CAT activity of tall fescue under non-salt stress and salt stress

正常條件下各處理高羊茅葉片APX酶活性均在1.21～1.23 nmol·(mg·min)-1，且處理間無顯著差異(P＞ 0.05) (圖10)。在鹽脅迫初期，APX活性受到NaCl誘導(dǎo)上升，而后隨著鹽脅迫時間的延長逐漸下降。其中葉面噴施去離子水、K2SO4和AsA處理均在14 d達到峰值，相較于0 d分別上升了52.81%、57.09%和62.53%，但4個處理間并無顯著差異。葉面噴施GB處理在21 d達到峰值，相較于0 d上升了63.00%。自21 d開始直至處理結(jié)束，噴施去離子水處理與其他3種處理相比均表現(xiàn)為差異顯著(P＜0.05)。鹽脅迫下，35 d時各處理之間APX活性較之峰值均明顯下降。值得注意的是，鹽脅迫下噴施去離子水和K2SO4處理的高羊茅在35 d時APX活性均低于0 d，而噴施GB、AsA處理則明顯高于0 d。

圖10 非鹽脅迫和鹽脅迫下3種外源物對高羊茅APX活性的影響Figure 10 Effect of three substances on the APX activity of tall fescue under non-salt stress and salt stress

3 討論

3.1 3種外源物質(zhì)可以改善鹽脅迫下高羊茅的生長狀態(tài)

在自然環(huán)境中，干旱、高溫和鹽害等非生物脅迫對植物生長造成不利的影響[23]，而草坪質(zhì)量能夠直觀反映草坪受鹽脅迫的程度。本研究中，高羊茅在250 mmol·L-1NaCl的脅迫下生長緩慢，葉片逐漸枯黃、老化，外源噴施GB、AsA和K2SO4均可延緩鹽脅迫下葉片枯黃，從而維持較好的草坪質(zhì)量。其中以噴施GB效果最佳，AsA次之，K2SO4最差，說明相對于其他兩個處理，噴施GB對鹽脅迫下高羊茅的生長發(fā)育的促進作用更明顯。

植物體內(nèi)進行正常的生理生化反應(yīng)均需水的參與，水分虧缺勢必會影響植物的正常生長。因而，葉片相對含水量通常可以用來衡量植物在逆境中的生長情況，在鹽脅迫條件下提高植物的持水能力尤為重要[24]。本研究中，隨著鹽脅迫時間的增加，高羊茅葉片含水量持續(xù)下降，而噴施GB、AsA和K2SO4均可有效延緩鹽脅迫中相對含水量的下降，且噴施GB后葉片相對含水量下降速度慢于其他兩個處理，與草坪質(zhì)量表現(xiàn)一致，這表明GB處理在緩解植物由于水分缺失引起的生理代謝失調(diào)效果更好，此結(jié)果在彎葉畫眉草(Eragrostis curvula)[25]和小麥[26]等植物中也得到了證實。

3.2 3種外源物質(zhì)可以促進鹽脅迫下高羊茅的滲透調(diào)節(jié)能力和離子平衡

滲透調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對逆境時重要的生理調(diào)節(jié)機制之一[27]。根據(jù)本研究結(jié)果，葉面噴施GB、K2SO4、AsA均可以顯著提高鹽脅迫下高羊茅的滲透勢，其中噴施GB效果最佳，可能由于甜菜堿本身是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，同時可以誘導(dǎo)可溶性糖、脯氨酸等物質(zhì)積累，從而提高滲透調(diào)節(jié)作用[26]。細胞質(zhì)膜是隔開細胞與外界環(huán)境的一道屏障。鹽脅迫下，由于細胞質(zhì)膜透性增大而導(dǎo)致大量電解質(zhì)外排，故電解質(zhì)滲漏率通?？梢苑从臣毎さ耐暾院椭参锸苊{迫的程度[28]。本研究中，高羊茅的電解質(zhì)滲漏率隨著鹽處理時間的增加而顯著上升，這與江生泉等[29]對高羊茅耐鹽性的研究結(jié)果相似，說明鹽脅迫下高羊茅細胞質(zhì)膜的完整性和穩(wěn)定性受到嚴重破壞。噴施GB后葉片電解質(zhì)滲漏率增加程度低于噴施AsA和K2SO4，說明甜菜堿對鹽脅迫下植物葉片的細胞膜有較強的保護作用，在棉苗(Gossypium hirsutum)上也有類似的結(jié)果[30]。

離子毒害也是NaCl傷害植物的一種主要形式[31]，鹽脅迫下，Na+等離子在植物體內(nèi)大量積累，K+濃度降低，破壞植物體內(nèi)的水分和離子平衡，最終對植株造成傷害[32]，因此在鹽脅迫條件下重建離子穩(wěn)態(tài)是提高植物耐受鹽脅迫的策略之一。本研究在鹽處理期間，葉面噴施K2SO4、GB和AsA后，葉片中Na+積累速度變緩，這和鹽脅迫下雜交狼尾草(Pennisetum americanum)的試驗結(jié)果一致[33]。本研究中僅噴施K2SO4處理葉片K+濃度顯著上升，在蔣喬峰等[34]對溝葉結(jié)縷草(Zoysia matrella)的研究中，鹽脅迫導(dǎo)致葉片中K+濃度明顯降低。這可能由于噴施K2SO4提供大量的K+，促進植物葉片對K+的吸收。以上結(jié)果說明在一定濃度的鹽脅迫中，葉面噴施GB在抑制高羊茅葉片Na+濃度的增加引起的離子毒害作用以及維持葉片中離子平衡方面效果更佳。

3.3 3種外源物質(zhì)可以提高鹽脅迫下高羊茅的抗氧化能力

H2O2是葉綠體中光電子傳遞與酶反應(yīng)的產(chǎn)物，與自由基結(jié)合形成的·OH可以直接引發(fā)脂質(zhì)過氧化，進而破壞植物細胞的結(jié)構(gòu)和功能。同時，H2O2在植物體中累積導(dǎo)致AsA含量降低，嚴重影響植物體內(nèi)正常代謝[35-36]，因此H2O2的含量可以直接反映植物體受脅迫的程度。研究結(jié)果表明葉面噴施3種物質(zhì)均可以顯著抑制鹽處理下葉片中H2O2的積累，證明噴施K2SO4、GB和AsA可以緩解鹽脅迫對高羊茅葉片造成的氧化損傷。另外，噴施GB葉片顏色淺于噴施K2SO4和AsA的葉片，由此可知，高羊茅在鹽脅迫條件下，葉面噴施GB緩解鹽脅迫的效果優(yōu)于K2SO4和AsA。

植物受到脅迫時，體內(nèi)活性氧的過量積累會造成細胞結(jié)構(gòu)和功能的紊亂甚至導(dǎo)致其死亡，其自身形成的保護酶體系可以使植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡[37]。因此，逆境下植物體內(nèi)的抗氧化酶活性被視為評價植物抗逆性的重要指標之一[38]。CAT可以催化H2O2分解，APX可以利用抗壞血酸作為電子供體清除H2O2[39-40]，因此，CAT和APX活性的增強可以顯著提高植物體的抗逆性[41]。本研究中，CAT和APX活性均隨著鹽脅迫時間的增加表現(xiàn)出先增強后下降的趨勢。這是由于在鹽脅迫初期，植物體內(nèi)產(chǎn)生了較多的H2O2，誘導(dǎo)高羊茅CAT和APX活性增強，但隨著鹽脅迫時間的增加，當鹽脅迫超過了植物所能忍受的“閾值”后，這兩種酶活均顯著降低。葉面噴施GB和AsA均顯著提升了CAT和APX酶活性，這個結(jié)果在紫花苜蓿(Medicago sativa)、油菜(Brassica napus)種子中得到了證實[13,42]，說明GB和AsA可以增強鹽脅迫下高羊茅的抗氧化酶活性，進而提升高羊茅的耐鹽性，且噴施GB效果更佳。然而葉面噴施K2SO4的研究結(jié)果與鄭延海等[12]對小麥的研究結(jié)果不符，究其原因可能是K2SO4對鹽脅迫的緩解并非通過抗氧化途徑實現(xiàn)，而是通過提高K+濃度達到離子平衡實現(xiàn)的。

4 結(jié)論

綜合高羊茅在試驗過程中的生理生態(tài)指標發(fā)現(xiàn)，外源噴施GB可以提升高羊茅在鹽脅迫下的草坪質(zhì)量、葉片相對含水量，降低電解質(zhì)滲漏率，并通過提高滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化酶活性在一定程度上緩解鹽脅迫的傷害，效果優(yōu)于噴施K2SO4和AsA。