兩株耐錳菌的篩選及其生物學性能研究

何園園，薛林貴*，劉映彤

(1. 蘭州交通大學 生物與制藥工程學院，蘭州 730070；2. 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，蘭州 730000)

鐵尾礦中存在多種重金屬元素污染，如Fe、Mn、Zn、Cu、Pb等，這些元素超過一定的環(huán)境容納限度[1]，就會危害人體健康和植物生長[2].錳在地球中含量豐富，是一種必需的微量元素[3].但錳過量會引發(fā)人體慢性疾病，如典型帕金森綜合癥[4]，食用錳超標的水和食物可導致生物機體神經(jīng)毒性、生殖毒性，也可導致肝臟、肺和其他器官損傷[5].對植物體來說，錳過量會誘導植物各種形態(tài)變化、導致進行不良的生理和生化反應、造成直接或間接的功能障礙，從而產(chǎn)生各種有害影響[6-7]，如引起植物根部組織缺氧，使植物生長嚴重受阻等.研究結(jié)果表明，釋放到環(huán)境中的錳等重金屬不易被降解和消除[8].因此，防止錳對環(huán)境的污染、有效治理錳污染土壤和水體是當前十分緊迫的任務.

目前去除環(huán)境中污染錳的方法有錳沙吸附過濾法、氧化法、離子交換法、混凝法等，但此類方法治理大面積污染非常有限，并且耗費時間、人力、財力巨大[9].錳在環(huán)境中通常是不能被生物降解的，只能通過多種形態(tài)的轉(zhuǎn)換而降低其毒性[10].1998年張杰首次提出錳的生物固定和錳去除理論，指出Mn(II)在中性條件下的氧化是生物氧化[11].許多微生物尤其細菌已被報道能夠去除錳(II)，如芽孢桿菌SG-1[12]、惡臭假單胞菌MnB1[13]、Pedomicrobiumsp.ACM 3067[14]、GB-1[15].微生物對污染環(huán)境中錳的去除和環(huán)境修復具有操作技術(shù)簡單、速度快、處理成本低、對環(huán)境友好不會造成二次污染、對低濃度的錳污染環(huán)境處理效果好等優(yōu)點而備受青睞[16].

在微生物修復錳污染過程中，篩選到性能優(yōu)良的錳耐受菌是微生物修復錳污染土壤的基礎(chǔ)工作[17].本研究通過對張掖市臨澤縣東小口子鐵尾礦采集樣本進行分析，其中錳含量超標最嚴重，質(zhì)量比達到45 373 mg/kg，超過中國背景土壤值66倍；從鐵尾礦分離篩選到能夠耐受高濃度Mn2+的土著細菌，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并研究細菌的除錳能力及其對其他重金屬的耐受性，為今后進一步開展錳污染環(huán)境的治理提高菌種資源，為鐵尾礦污染環(huán)境的生態(tài)修復提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤樣本采集

供試土壤樣品采自張掖市臨澤縣東小口子鐵尾礦渣堆積廢棄地表層5～10 cm的土壤，研究分析結(jié)果顯示，其中鐵尾礦中錳濃度最高達到45 373 mg/kg.裝入無菌的滅菌密封袋中，-4 ℃冰箱保存，作為抗性菌株篩選樣本.

1.1.2 主要儀器及試劑

主要儀器：實驗儀器如表1所列.

表1 實驗儀器

主要試劑：實驗試劑如表2所列.

表2 實驗試劑

1.1.3 培養(yǎng)基

主要培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分如表3所列.

表3 培養(yǎng)基成分

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化

鐵尾礦土樣過篩取5 g，加入至45 mL濃度為0.9%的無菌生理鹽水中，置于搖床震蕩1 h，靜置后取5 mL上清液，接到500 mg/L Mn2+的液體培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)48 h；取0.1 mL菌液梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的菌懸液，取濃度為10-4、10-5、10-6倍的菌懸液0.025 mL分別涂布在500 mg /L Mn2+的固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取生長狀況良好的菌株，轉(zhuǎn)接到1 000 mg/L Mn2+的新鮮液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h.

1.2.2 優(yōu)良菌株的篩選與馴化

根據(jù)崔馨文[18]的方法，將上述分離純化獲得的菌株轉(zhuǎn)接到1 000 mg/L Mn2+的液體培養(yǎng)基中，在恒溫30 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，淘汰未生長的菌株,選取長勢較好的菌繼續(xù)轉(zhuǎn)接到1 500 mg/L Mn2+的液體培養(yǎng)基中，依次逐步提高錳離子濃度為2 000 mg/L、2 500 mg/L、3 000 mg/L、3 500 mg/L、4 000 mg/L進行篩選、淘汰與馴化.在4 000 mg/L Mn2+液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)馴化后,于相應的固體培養(yǎng)基上挑選長勢較好，且菌落形態(tài)不一樣的一批菌株，在LB固體培養(yǎng)基中進行分離純化，對分離出來的菌株進行編號，并用甘油凍凍存于-80 ℃冰箱.

1.2.3 菌株的鑒定

菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)特征，對菌體進行革蘭氏染色試驗.采用通用引物27 F和1492 R進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物序列由上海生工公司進行測序；通過NCBI進行序列相似性比對，并用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株與物種的親緣相似性.

1.2.4 菌株培養(yǎng)條件研究

以接種量1%、pH=7、30 ℃、150 r/min恒溫搖床、LB培養(yǎng)基培養(yǎng)為基礎(chǔ)條件，研究不同溫度、不同pH、不同接種量對菌株生長的影響.

溫度：將溫度梯度分別設(shè)置為25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，設(shè)置三組平行，其他均為基礎(chǔ)條件，分別于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、54 h和60 h取樣，測定OD600的值，繪制生長曲線.

pH：將pH梯度分別設(shè)置為4、5、6、7、8，設(shè)置三組平行，其他均為基礎(chǔ)條件，分別于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、54 h和60 h取樣，測定OD600的值，繪制生長曲線.

接種量：將接種量梯度分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%，設(shè)置三組平行，其他均為基礎(chǔ)條件，分別于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、54 h和60 h取樣，測定OD600的值，繪制生長曲線.

1.2.5 不同濃度Mn2+對菌株生長的影響

菌株在固體LB培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)至長出菌落后，挑選單菌落至液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min恒溫搖床培養(yǎng)至OD600約0.8.菌株以1%的接種量分別接入添加不同濃度Mn2+(1 000 mg/L、3 000 mg/L、5 000 mg/L、7 000 mg/L、9 000 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，每個濃度各3個重復，各組均設(shè)置30 ℃、150 r/min恒溫搖床震蕩培養(yǎng)至60 h，以空白液體培養(yǎng)基為對照，用OD600的數(shù)值表征培養(yǎng)液中的菌體濃度.

1.2.6 菌株在最適培養(yǎng)條件下對不同濃度錳的去除效果研究

將菌株培養(yǎng)至OD600為0.8左右，分別接入含Mn2+濃度為1 000 mg/L、3 000 mg/L、5 000 mg/L的液體LB培養(yǎng)基中.根據(jù)上述最適培養(yǎng)條件培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h后取樣，8 000 r/min離心5 min取上清液，測定上清液Mn2+的濃度.

采用ICP-MS測定，采用公式(1)計算重金屬去除率

(1)

其中：η為去除率;Co表示處理前溶液中重金屬濃度;Ce表示處理后溶液中重金屬濃度.

1.2.7 不同重金屬離子對菌株生長的影響

菌種的活化和種子液的制備同1.2.6.菌株以1%的接種量，分別接種于含Mn2+濃度為100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、900 mg/L、1 100 mg/L、1 300 mg/L、1 500 mg/L不同重金屬離子的液體LB培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min，各三組平行，于24 h取樣，測定OD600的值，繪制生長曲線，以此表征菌株在不同濃度的重金屬離子下菌體的生長狀況.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

通過分離純化從張掖市臨澤縣宏鑫鐵尾礦篩選到兩株耐錳的細菌，編號HF-1、HZ-1.

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

當培養(yǎng)溫度為30 ℃，在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，進行革蘭氏染色，耐錳菌株HF-1、HZ-1的菌落形態(tài)如圖1所示，HF-1菌落呈橢圓形，灰色，表面光滑濕潤；HZ-1菌落形狀呈圓形，表面粗糙，扁平，邊緣不規(guī)則.經(jīng)革蘭氏染色結(jié)果顯示，菌株HF-1為革蘭氏陰性菌，HZ-1為革蘭氏陽性菌.

2.2.2 16S rRNA 基因序列分析

利用NCBI中的BLAST工具，將測序得到的兩株細菌的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性較高的菌株進行同源性比對，用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示.HF-1與Enterobacterasburiaestrain BSP4(KF 360066.1)親緣關(guān)系最接近，置信度為100%，HZ-1則與Bacilluspumilusstrain 13(MH 910117.1)親緣關(guān)系最接近，置信度為100%.因此，HF-1菌株被鑒定為Enterobacterasburiae，HZ-1菌株被鑒定為Bacilluspumilus.

圖1 菌株HF-1、HZ-1的菌落形態(tài)及其革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Colony morphology and gram staining results of HF-1 and HZ-1 strains

圖2 菌株HF-1、HZ-1基于16s rRNA序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.2 Phylogenetic tree map of HF-1、HZ-1 strains based on 16s rRNA sequence

2.3 菌株培養(yǎng)條件

2.3.1 不同溫度對菌株HF-1、HZ-1生長的影響

溫度是影響微生物生長的一個重要因子.不同溫度對菌株HF-1、HZ-1生長的影響見圖3，HF-1、HZ-1隨著培養(yǎng)時間的延長，其OD600逐漸升高再降低.當HF-1培養(yǎng)溫度在35 ℃、48 h后其生長量達到最高，即OD600為6.33，HF-1在低于35 ℃時，菌株生長狀況基本良好，當溫度為40 ℃時，HF-1的生長受到明顯的抑制；HZ-1培養(yǎng)溫度在30 ℃、36 h后其生長量達到最高，即OD600為7.71；HZ-1的溫度低于30 ℃時，菌株生長隨著時間的延長，OD600越高,并且其OD600最高均達到6；當溫度高于30 ℃時，菌株生長出現(xiàn)下降，當溫度為40 ℃時，菌株生長受到明顯抑制.因此兩株菌的最適溫度均在中溫，溫度過高或過低均會抑制菌株生長.這是由于溫度的改變會影響生物體內(nèi)所進行的許多生化反應，因而影響生物的代謝活動；在一定溫度范圍內(nèi)，生化反應速率隨溫度上升而加快，超過一定限度，細胞功能就會下降以致死亡；綜上，不同溫度對菌株HF-1生長的影響：35 ℃>30 ℃>25 ℃>20 ℃>40 ℃；不同溫度對菌株HZ-1生長的影響：30 ℃>25 ℃>30 ℃>20 ℃>40 ℃.

圖3 溫度對菌株HF-1、HZ-1生長的影響Fig.3 Effects of temperature on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

2.3.2 不同pH對菌株HF-1、HZ-1生長的影響

微生物的生命活動、物質(zhì)代謝與pH值有密切關(guān)系，不同pH對菌株HF-1、HZ-1生長的影響見圖4，HZ-1、HF-1隨著pH的增加、培養(yǎng)時間的延長，菌株的OD600均先增大而后逐漸減小；當pH為7時，HF-1、HZ-1的OD600達到最高，分別為5.33和7.71；pH為4時，HZ-1不生長，而HF-1最高OD600達到4.05，故酸性條件下，HF-1比HZ-1的生長更具有優(yōu)勢.可以看出，當pH大于5時，HZ-1、HF-1的生長狀況良好，且HZ-1較HF-1生長狀況較好.

圖4 pH對菌株HF-1、HZ-1生長的影響Fig.4 Effects of pH on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

2.3.3 不同接種量對菌株HF-1、HZ-1生長的影響

不同接種量對菌株HF-1、HZ-1生長的影響見圖5，由圖5可見，接種量對菌株的生物量影響不大.但相比之下，接種量為1%時，菌株的生長最好.菌株HF-1、HZ-1在接種量為1%時，OD600達到最高，分別在36 h時OD600值為5.33、6.91；接種量分別在2%、3%、4%時，OD600值反而降低，可能由于菌體生長過快，使得培養(yǎng)基粘度增加，造成溶氧不足，抑制菌體生長；故菌株HF-1、HZ-1的最適接種量均為1%.

圖5 接種量對菌株HF-1、HZ-1生長的影響Fig.5 Effects of inoculation amount on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

2.4 不同濃度Mn2+對菌株HF-1、HZ-1生長的影響

為了分析不同濃度Mn2+對菌株HF-1、HZ-1生長的影響(見圖6)，從圖6中可以看出，菌株HF-1隨著Mn2+濃度增高，OD600在36 h內(nèi)逐漸增高，54 h后逐漸降低；菌株HZ-1隨著Mn2+濃度增高、時間的增加，OD600逐漸升高；當Mn2+濃度為1 000 mg/L時，菌株HF-1、HZ-1的OD600達到最高值，分別是5.74、7.56.而兩株菌均能在Mn2+濃度為9 000 mg/L生長，即菌株HF-1、HZ-1對Mn2+的耐受濃度可達9 000 mg/L.

圖6 不同濃度Mn2+對菌株HF-1、HZ-1生長的影響Fig.6 Effects of Mn2+ on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

2.5 菌株在最適條件下對不同濃度錳的去除效果研究

菌株對不同濃度Mn2+(1 000 mg/L、3 000 mg/L、5 000 mg/L)去除效果如圖7所示，隨培養(yǎng)時間的增加，菌株錳(Ⅱ)去除能力也逐漸增加；當Mn2+濃度為1 000 mg/L，菌株HF-1在24 h時錳(Ⅱ)去除率為72.34%，隨著時間的延長，到72 h時，其錳去除率達到94%；菌株HZ-1在24 h時錳(Ⅱ)去除率為71.34%，72 h時錳(Ⅱ)去除率達到97%；隨后，菌株隨著Mn2+離子濃度增加，其去除率逐漸減少；當在48 h時，菌株HF-1在Mn2+1 000 mg/L的錳去除率為85.67%，而在Mn2+5 000 mg/L的錳去除率為54.96%，菌株HZ-1在Mn2+1 000 mg/L錳去除率為88.67%，在Mn2+5 000 mg/L的錳去除率為67.83%.

圖7 菌株HF-1、HZ-1對Mn2+的去除效果Fig.7 Mn2+ removal effect of HF-1 and HZ-1 strains

2.6 不同重金屬離子對菌株HF-1、HZ-1生長的影響

菌株分別接種于添加有100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、900 mg/L、1 100 mg/L、1 300 mg/L、 1 500 mg/L不同金屬離子的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后如圖8所示，當Cd2+濃度為300 mg/L時，菌株HF-1OD600值為0.84，隨著Cd2+濃度增加，其OD600逐漸降低，當Cd2+濃度為700 mg/L時，HF-1不生長；當As3+濃度為300 mg/L時，菌株HF-1OD600值為1.52，當As3+濃度為700 mg/L時，HF-1緩慢生長，OD600值為0.8，當As3+濃度為900 mg/L時，HF-1不生長；當Cu2+濃度為900 mg/L時，菌株HF-1生長狀況良好，其OD600值為1.02；菌株HF-1對Pb2+耐受較好，當Pb2+濃度為1 500 mg/L時，OD600值為3.21；當Cd2+濃度為300 mg/L時，菌株HZ-1OD600值為1.23，當 Cd2+濃度為900 mg/L時，HZ-1不生長；當As3+、Zn2+濃度為300 mg/L時，菌株HZ-1OD600值分別為1.62、1.73，當As3+、Zn2+濃度為900 mg/L時，菌株HZ-1不在生長；當Cu2+濃度為700 mg/L時，菌株HZ-1OD600值為2.69，隨著Cu2+濃度增加，其OD600值逐漸降低；當Pb2+濃度為1 200 mg/L后，菌株HZ-1OD600值逐漸降低至不生長.故菌株HF-1能夠耐700 mg/L As3+、1 500 mg/L Pb2+、600 mg/L Zn2+、100 mg/L Cd2+、800 mg/L Cu2+,菌株HZ-1能夠耐500 mg/L As3+、1200 mg/L Pb2+、600 mg/L Zn2+、100 mg/L Cd2+、800 mg/L Cu2+.

圖8 不同濃度的重金屬對菌株HF-1、HZ-1生長的影響Fig.8 Effects of different concentrations of heavy metals on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

3 討論

本研究從鐵尾礦土壤分離篩選出兩株高耐錳菌，其中兩株菌對錳的耐受濃度可達9 000 mg/L.田美娟等[19]從太平洋海底泥樣品中富集、篩選到50株錳抗性菌株，其中短小芽孢桿菌(B.pumilus)M12對Mn2+的耐受能力最好，最高Mn2+耐受濃度為130 mmol/L.黃慧敏[20]從湖南湘潭錳礦區(qū)的礦渣中分離出的三株耐Mn2+菌株，其中Ralstoniapickettistrain HM8對Mn2+的耐受能力最好，最高Mn2+耐受濃度為10 000 mg/L；田群等[21]從松桃的錳冶煉區(qū)寨英鎮(zhèn)采集的土樣中分離得到7株耐錳能力達到1 800 mg/L的細菌，其中S7和S16兩株菌對錳的耐受能力高達2 200 mg/L.此外，本研究對其他重金屬也具有較高的耐受性.目前關(guān)于鉛、鎘、銅、砷、鋅等重金屬離子耐受性細菌已經(jīng)報道的許多，李同靈等[22]從重金屬污染土壤中分離得到了一株大腸桿菌(Escherichia)P15，最高可耐受1 200 mg/L Pb2+；Sodbaatar等[23]從蒙古國Zaamar金礦土壤中篩選到6株重金屬耐受菌株，其中菌株Z1對Pb2+、Cu2+、Zn2+耐受性最好，分別能夠耐受8 mmol·L-1Pb2+、8 mmol·L-1Zn2+、2 mmol·L-1Cu2+；康薇等[24]從湖北大冶銅綠山銅鐵礦廢棄露采場污染土壤中分離得到一株芽孢桿菌屬(Bacillussp.)TLSB2-K，最高銅耐受濃度為700 mg/L；Shakya等[25]從尼泊爾的Terai分離出的9株耐Mn2+菌株，其中對As3+的耐受性分別為1 000 mg/L和749 mg/L以上.而本研究的兩株菌可單獨耐受1 200 mg/L Pb2+、800 mg/L Cu2+、100 mg/L Cd2+、500 mg/L As3+、600 mg/L Zn2+，在重金屬污染土壤修復中具有潛在的應用價值.

從張掖市臨澤縣東小口子鐵尾礦篩選得到的兩株菌株在Mn2+濃度為1 000 mg/L時，錳去除率最高分別達到97%和94%，這兩株菌均能夠去除培養(yǎng)液中的錳，一方面是由于錳是菌株代謝相關(guān)酶類的輔助因子，細菌吸收錳用于自身代謝；另一方面菌株將溶液中低價態(tài)的錳轉(zhuǎn)化成高價態(tài)的錳氧化物或復合物，或者通過細菌表面的吸附作用、胞內(nèi)積累作用來減輕高濃度錳對于菌體的毒害，從而降低低價態(tài)錳的濃度和毒性.崔罄文[18]篩選到的錳氧化菌株能夠高效地催化Mn(II)轉(zhuǎn)化成Mn(IV)，使可溶性 Mn(II)形成沉淀，因而可以去除水體中的錳.Zhang等[26]篩選到嗜水氣單胞菌DS02對可溶性Mn(II)的去除率達到近90.0%(495 mg·L-1)，經(jīng)過擬合XPS數(shù)據(jù)表明，82.0%的Mn(IV)是錳氧化物的主要成分；而菌株對Mn(II)的吸附在很大程度上被證明是一種協(xié)同效應，Ding等[27]從重金屬污染土壤篩選到耐錳菌株LLDRA6在水溶液中表現(xiàn)出了較高的Mn(II)生物吸附能力，并利用FT-IR紅外光譜分析表面細胞壁參與吸附的官能團有O-H、N-H、C-H、C-N、O-C-O、C-O；目前，發(fā)現(xiàn)耐錳的微生物種類繁多，各種微生物對于錳的去除能力各異.田美娟等[19]篩選到一株食烷菌屬M59在28 ℃、pH=7的條件下,對Mn2+濃度為30 mmol/L的去除率達到99%，而在相關(guān)錳(Ⅱ)去除菌報道中，最高的錳去除菌也要培養(yǎng)40 h以上才可以達到錳去除率在95%以上[28-29]；姚遠等[30]在選擇培養(yǎng)基中篩選到的兩株菌株，在含Mn2+濃度為65 mg/L的液體培養(yǎng)基中，對Mn2+的去除率達到85%以上；彭小偉等[14]通過從電解金屬錳廢渣中篩選出一株耐錳性強的霉菌A5，在28 ℃，接種量為2%，搖瓶轉(zhuǎn)速150 r/min，200 mg/L Mn2+條件下培養(yǎng)47 h，A5霉菌對錳的去除率達到97.1%.本研究得到的兩株耐錳菌均能去除環(huán)境中高濃度錳，對于重金屬污染土壤的生物修復提供了微生物菌種資源.

4 結(jié)論

本研究從張掖市臨澤縣東小口子鐵尾礦采集土壤的樣品中，分離篩選得到兩株耐錳性較高的菌株HF-1、HZ-1，它們分別能耐受Mn2+濃度9 000 mg/L；通過16S rRNA序列分析，鑒定為阿氏腸桿菌(Enterobacterasburiae)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus).兩株菌的培養(yǎng)條件和重金屬耐受性的研究表明：

1) HZ-1的最適生長條件為30 ℃、pH 7、接種量為1%；HF-1的最適生長條件：35 ℃、pH 7、接種量1%；

2) 菌株HZ-1錳去除率最高達到97%，HF-1錳去除率最高達到94%.兩株菌均可以去除環(huán)境中含量較高的錳；

3) 根據(jù)重金屬耐受性實驗顯示，菌株可單獨在500 mg/L As3+、1 200 mg/L Pb2+、600 mg/L Zn2+、100 mg/L Cd2+、800 mg/L Cu2+的環(huán)境中生長，在微生物修復其他重金屬離子污染土壤的修復中有較好的應用前景.