豬HIF-1α基因啟動(dòng)子區(qū)及編碼區(qū)的生物信息學(xué)分析

劉京鴿,吳結(jié)革,徐世永,陳 清,張金璧

(金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與食品工程學(xué)院,江蘇 南京 210038)

缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)是缺氧誘導(dǎo)因子1的活性亞基及調(diào)節(jié)亞基,在缺氧或低氧的條件下被誘導(dǎo)表達(dá),它參與動(dòng)物機(jī)體多種生理(如糖代謝、脂代謝、血管生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活等)及病理(如腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等)的調(diào)控過(guò)程[1]。HIF-1α基因的穩(wěn)定性和活性受到翻譯后的修飾(如羥基化、泛素化、乙?；土姿峄?調(diào)節(jié)[2-3]。在常氧條件下,氧依賴降解域(oxygen-depending degradation domain,ODDD)中的脯氨酸殘基的羥基化和賴氨酸殘基的乙酰化觸發(fā)HIF-1α基因與VHL(von hippel-lindau)蛋白相結(jié)合,并通過(guò)泛素化-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。在缺氧條件下,HIF-1α蛋白質(zhì)亞基變得穩(wěn)定,被移至細(xì)胞核中,與穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1β 蛋白質(zhì)相結(jié)合,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[4-6]。

卵泡的發(fā)育與血管密切相關(guān),每個(gè)卵泡可以獨(dú)立調(diào)節(jié)血管的生長(zhǎng)。在排卵前,始基卵泡和原始卵泡主要依靠間質(zhì)血管供血,此時(shí),微血管還未產(chǎn)生,待原始卵泡開(kāi)始發(fā)育后,微血管逐漸出現(xiàn)在卵泡膜層,并隨著卵泡直徑的增長(zhǎng)和原始卵泡的進(jìn)一步發(fā)育,卵泡周?chē)奈⒀艿拿芏群脱芊种б仓饾u增多[7-8],最終形成巨大的微血管網(wǎng),分布在卵泡膜層,并沒(méi)有突破基膜進(jìn)入到顆粒細(xì)胞層中,這給卵泡發(fā)育提供足夠的養(yǎng)分[9-11],對(duì)卵泡發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的減少能夠致使卵泡顆粒細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致卵泡閉鎖。卵泡閉鎖在卵泡發(fā)育的早期啟動(dòng),并且貫穿于整個(gè)卵泡的發(fā)育過(guò)程[6，12-13]。

研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因可通過(guò)VEGF路徑來(lái)調(diào)控卵泡膜表面血管的生成,進(jìn)而調(diào)控大卵泡的發(fā)育,表明HIF-1α基因與卵泡的發(fā)育和成熟密切相關(guān)。本研究對(duì)NCBI中公布的豬缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α基因5′端上游2 000 bp長(zhǎng)的候選啟動(dòng)子區(qū)和CDS區(qū)進(jìn)行了核心啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè);同時(shí)對(duì)HIF-1α基因所編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、高級(jí)結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。此為進(jìn)一步深入研究HIF-1α基因?qū)β雅莅l(fā)育的影響及HIF-1α基因參與卵泡發(fā)育的分子調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬HIF-1α基因5′端及編碼區(qū)序列來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為NC_010443.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

利用在線分析工具(表1)及MEGA軟件對(duì)豬HIF-1α基因的啟動(dòng)子區(qū)、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽及高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載人、小鼠、家兔等11個(gè)物種的HIF-1α基因編碼域序列(coding domain sequence,CDS)(表2),進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

表1 生物信息學(xué)分析軟件

續(xù)表1

表2 不同物種HIF-1α基因NCBI登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 豬HIF-1α基因的啟動(dòng)子區(qū)生物信息學(xué)分析

啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：豬HIF-1α基因的核心啟動(dòng)子區(qū)位于-1 793～-1 804 bp(表3)，并存在多個(gè)調(diào)控元件(表4)，可見(jiàn)真核生物啟動(dòng)子區(qū)的典型結(jié)構(gòu)為順式原件TATA盒(TATA box)和CAAT盒(CAAT box)。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：豬HIF-1α基因中存在4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中-572～-563 bp處的C/EBPA和-191～-182 bp處的Sp1可能性最大(表5)。CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：豬HIF-1α基因啟動(dòng)子中共存在4個(gè)CpG島(圖1、表6)。

表3 豬HIF-1α基因啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)果

表4 豬HIF-1α基因調(diào)控元件的預(yù)測(cè)結(jié)果

表5 豬HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

圖1 豬HIF-1α基因CpG島的預(yù)測(cè)結(jié)果

表6 豬HIF-1α基因CpG島的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 豬HIF-1α基因編碼區(qū)序列及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用NCBI中的ORF Finder對(duì)豬HIF-1α基因的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行定位，起始密碼子位于第148個(gè)核苷酸，終止密碼子位于第2 622個(gè)核苷酸。

由表7可知:豬HIF-1α蛋白的氨基酸共有824個(gè);其中亮氨酸(Leu)含量最高,達(dá)到9.7%;色氨酸(Trp)含量最低,僅為0.4%。

豬HIF-1α蛋白的分子式為C4 014H6 379N1 097O1 302S44,相對(duì)分子質(zhì)量為92 249.01,理論等電點(diǎn)為5.11,消光系數(shù)為48 790,不穩(wěn)定系數(shù)為54.86,說(shuō)明豬HIF-1α蛋白質(zhì)不穩(wěn)定,容易發(fā)生降解或變性。豬HIF-1α蛋白的脂溶性系數(shù)為74.31,平均親水性為-0.551,推測(cè)其為親水性蛋白。豬HIF-1α蛋白的N末端為甲硫氨酸(Met),在哺乳動(dòng)物生物體外的網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h。通過(guò)Protscale在線工具,利用Hphob./Kyte & Doolittle算法分析豬HIF-1α蛋白的親水性和疏水性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的值都小于0,再次證明該蛋白為親水性蛋白(圖2)。

表7 豬HIF-1α基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸組成

注:負(fù)值表示親水性,正值表示疏水性,絕對(duì)值越大表示性能越強(qiáng) 圖2 豬HIF-1α基因編碼的蛋白質(zhì)親/疏水性分析

2.3 豬HIF-1α基因編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

信號(hào)肽主要是負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引入到不同亞細(xì)胞器內(nèi),利用SignalP 4.1工具對(duì)豬HIF-1α蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果顯示原始剪切位點(diǎn)的得分(C)、信號(hào)肽的得分(S)、被結(jié)合剪切位點(diǎn)的得分(Y)均未達(dá)到信號(hào)肽的要求,說(shuō)明此豬HIF-1α蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽,為非分泌型蛋白。

二硫鍵預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,豬HIF-1α蛋白存在16個(gè)半胱氨酸(Cys),可以形成6對(duì)二硫鍵。利用在線網(wǎng)站TMHMM 2.0對(duì)豬HIF-1α蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其蛋白結(jié)構(gòu)上不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,由此推斷豬HIF-1α基因編碼的蛋白質(zhì)為非跨膜蛋白。

使用在線網(wǎng)站PSORT Ⅱ?qū)ωiHIF-1α基因編碼蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)現(xiàn),該蛋白分別位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、線粒體及分泌小泡上,占比分別為:73.9%、8.7%、8.7%、4.3%和4.3%。可見(jiàn)豬HIF-1α蛋白主要位于細(xì)胞核內(nèi)。

利用DNAMAN軟件對(duì)豬HIF-1α蛋白進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),結(jié)構(gòu)表明其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)卷曲、α-螺旋、鏈延伸和β-轉(zhuǎn)角組成(圖3),占比分別為48.91%、32.16%、15.05%、3.88%。可見(jiàn)無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋是豬HIF-1α蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)。

注:h:α-螺旋;e:鏈延伸;c:無(wú)規(guī)卷曲;t:β-轉(zhuǎn)角 圖3 豬HIF-1α基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 豬HIF-1α基因序列同源性比較和遺傳進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用Megalign和MEGA 7.0軟件對(duì)豬、牛、羊、雞、鼠等11個(gè)物種的HIF-1α基因進(jìn)行同源性分析及遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。從同源性分析結(jié)果(表8)來(lái)看,與豬HIF-1α基因同源性最近的是綿羊,其基因序列相似度達(dá)到95.4%,同源性最遠(yuǎn)的是原雞,相似度僅為78.5%,說(shuō)明HIF-1α基因編碼區(qū)在不同物種中具有較高的保守性。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)同源性分析具有相似的結(jié)果,與豬HIF-1α基因同源性最親近的是綿羊,同源關(guān)系最遠(yuǎn)的是原雞(圖4),進(jìn)一步說(shuō)明HIF-1α基因在不同物種之間既存在保守性,又存在一定程度的差異。

表8 11個(gè)物種中HIF-1α基因的同源性分析

圖4 11個(gè)物種HIF-1α基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論與討論

雌性動(dòng)物在性成熟后,卵巢在神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)下會(huì)出現(xiàn)周期性的卵泡成熟和排卵。伴隨著每次的卵泡成熟和排卵,卵巢會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)和機(jī)能的變化,同時(shí)動(dòng)物出現(xiàn)周期性的性行為,稱(chēng)為發(fā)情周期[16-17]。通常將其劃分為卵泡期和黃體期,排卵過(guò)程是卵泡期和黃體期的分界線。黃體是排卵后由卵泡迅速轉(zhuǎn)變成富有血管的腺體樣結(jié)構(gòu)[18]。排卵后殘留的卵泡壁塌陷,卵泡膜的結(jié)締組織、毛細(xì)血管等伸入到顆粒層,此時(shí)，卵泡在促黃體生成素(LH)的作用下演變成體積較大,富含毛細(xì)血管,并具有內(nèi)分泌功能的細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞團(tuán)新鮮時(shí)顯黃色,稱(chēng)黃體。黃體的細(xì)胞多為顆粒細(xì)胞,體積大,著色淺,分泌孕酮;泡膜黃體細(xì)胞小,細(xì)胞數(shù)量少,大部分位于黃體外周,分泌雌激素[19]。

卵泡發(fā)育效率制約著家畜的繁殖能力,而卵泡發(fā)育與血管生成是密不可分的,血管用來(lái)供給卵泡發(fā)育足夠的養(yǎng)分[20],血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是參與血管生成與微循環(huán)的重要因子[8]。HIF-1α蛋白是缺氧誘導(dǎo)因子1的活性亞基及調(diào)節(jié)亞基,在缺氧或低氧的條件下被誘導(dǎo)表達(dá),VEGF是其重要的下游靶向因子。Zimmermann等[21]研究表明HIF-1α基因可以通過(guò)調(diào)控VEGF的表達(dá)從而調(diào)控卵泡的發(fā)育。在此調(diào)控過(guò)程中,卵泡刺激素(FSH)通過(guò)結(jié)合受體來(lái)增加環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的量,從而激活蛋白激酶A和cAMP響應(yīng)元件[22]。HIF-1α基因通過(guò)抑制酪氨酸激酶(TK)來(lái)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)[23],同時(shí)它也刺激了磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的通路[24-25]。FSH通過(guò)PI3K信號(hào)通路調(diào)節(jié)多個(gè)靶向因子(如mTOR、MDM2等),從而刺激HIF-1α基因的信號(hào)通路,使其增加轉(zhuǎn)錄活性來(lái)調(diào)控VEGF。綜上所述，HIF-1α基因在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,因此對(duì)其表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究為探索豬HIF-1α基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了一定的理論依據(jù)。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),豬HIF-1α基因具有潛在核心啟動(dòng)子區(qū),其上存在多個(gè)順式作用元件,具備啟動(dòng)子區(qū)的典型結(jié)構(gòu),如控制轉(zhuǎn)錄起始的TATA盒及調(diào)控轉(zhuǎn)錄頻率的CAAT盒。該基因同時(shí)存在轉(zhuǎn)錄因子C/EBPA和Sp1結(jié)合位點(diǎn),它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始中具有重要作用。CpG島預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),啟動(dòng)子序列內(nèi)存在4個(gè)CpG島,此處序列容易發(fā)生甲基化修飾,從而調(diào)控基因的表達(dá)。豬HIF-1α基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)為2 475 bp,所編碼的蛋白質(zhì)含有20種共824個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為5.11,為親水性蛋白質(zhì),為非分泌型的、含硫非跨膜蛋白,主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、線粒體及分泌小泡等細(xì)胞器中。預(yù)測(cè)HIF-1α蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),其二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在大量α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲等多樣化結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)不同物種基因序列進(jìn)行同源性分析及遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建發(fā)現(xiàn),豬HIF-1α基因與綿羊同源性比較近,與原雞同源性較遠(yuǎn),可見(jiàn)HIF-1α基因保守性較高。