固定化米黑根毛霉脂肪酶的制備工藝優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)

彭思敏，肖 菁，吳衛(wèi)國，廖盧艷

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase，RML)是一種sn-1,3位專一性脂肪酶，可特異性地優(yōu)先水解處于三酰甘油1位和3位的脂肪酸。作為一種重要的工業(yè)酶制劑，米黑根毛霉脂肪酶被廣泛用于食品、制藥、生物新能源和環(huán)境治理等行業(yè)[1-2]。在油脂行業(yè)中，米黑根毛霉脂肪酶具有在油相中催化酯化和酯交換反應(yīng)的特性，可催化油脂中的游離脂肪酸與?；荏w反應(yīng)，使游離脂肪酸盡可能多地轉(zhuǎn)化為甘油酯或其他脂肪酸衍生物，從而降低油脂中游離脂肪酸的含量，達到降低成品油酸值和保障成品油品質(zhì)的目的。在各脂肪酶中，米黑根毛霉脂肪酶的比活力高、熱穩(wěn)定性強、溶劑耐受性好，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景[3-4]，但其在游離態(tài)下易受環(huán)境影響，難以被重復(fù)利用，且價格昂貴。因此，一般采用固定化方法對米黑根毛霉脂肪酶進行處理。

目前，吸附法、共價結(jié)合法、包埋法和交聯(lián)法[5]是常用的脂肪酶固定化方法。包埋法是指將酶蛋白分子包裹在溶膠-凝膠、有機聚合物、微膠囊和膜設(shè)備等含有多孔結(jié)構(gòu)的載體中的一種酶固定化方法[6]。包埋法實際操作簡單且適用范圍廣泛，對酶分子的高級結(jié)構(gòu)影響較小，固定化后的酶分子依然保持較高的酶活性。但包埋法弊端在于酶分子難以與大分子反應(yīng)底物接觸，因而被局限于反應(yīng)底物為小分子的酶催化反應(yīng)中[7]。交聯(lián)法是指利用有雙功能或多功能的交聯(lián)劑與酶蛋白分子之間形成共價鍵，將酶交聯(lián)聚集在一起的一種酶固定化方法[8]。交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑(如戊二醛、雙偶氮二聯(lián)苯胺、鞣酸及異氰酸衍生物等)與酶分子單一結(jié)合時會導(dǎo)致酶活力損失嚴重，因而常與包埋法結(jié)合起來，不僅可以提高交聯(lián)法制備的固定化酶的酶活力，同時也可以提高包埋法制備的固定化酶的重復(fù)使用性。羅少華等[9]采用包埋-交聯(lián)法固定化大腸桿菌細胞，用以工業(yè)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸。王妍等[10]采用包埋-交聯(lián)法對磷脂酶A1進行固定化，固定化磷脂酶A1的酶活力回收率可達80.2%，同時具有較好的熱穩(wěn)定性，重復(fù)使用7次后的酶活力為初始酶活力的65%。徐珊[11]以海藻酸鈉為載體，乙二醇縮水甘油醚為交聯(lián)劑固定化脂肪酶，結(jié)果表明，包埋-交聯(lián)處理后的固定化酶在65℃時仍能保持40%左右的相對酶活力，重復(fù)操作4次后酶活力為原來的50.32%，而游離酶只剩下10%左右的相對酶活力，并只能使用1次而無法回收?？梢姲?交聯(lián)處理后的固定化酶在熱穩(wěn)定性與操作穩(wěn)定性上均較游離酶得到了極大的提升。

載體是酶固定化的基礎(chǔ)，海藻酸鈉因其溶膠-凝膠的特性，溫和無毒、廉價易得的特點，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、工業(yè)等各領(lǐng)域[12-14]。近幾年關(guān)于海藻酸鈉復(fù)合載體在固定化酶方面的研究逐步增多。陳輝等[15]制備了菠蘿皮渣羧甲基纖維素/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠珠用于固定化菠蘿蛋白酶，優(yōu)化后的固定化酶比游離酶更耐熱、耐堿性環(huán)境，具有較好的重復(fù)使用性。張慧霞等[16]以海藻酸鈉-微孔淀粉制備固定化酯化酶，通過促進酯化反應(yīng)來縮短陳釀時間。虞鳳慧等[17]優(yōu)化了包埋法固定化高溫堿性脂肪酶的工藝，以海藻酸鈉與羧甲基纖維素鈉(CMC)為復(fù)合載體固定化后的酶活力回收率高達99.05%。目前，關(guān)于海藻酸鈉復(fù)合載體在脂肪酶方面的研究不多，有待進一步探究。

本研究以海藻酸鈉與CMC為復(fù)合載體，輔以戊二醛為交聯(lián)劑，優(yōu)化固定化米黑根毛霉脂肪酶工藝條件，并進行酶學(xué)性質(zhì)研究，以期達到降低成本，提高利用率和可回收率的目的，為米黑根毛霉脂肪酶固定化提供一種新思路，為實現(xiàn)酶法酯化脫酸在油脂工業(yè)生產(chǎn)中的自動化提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

米黑根毛霉脂肪酶(Palatase 2000L，酶活力10 075.68 U/mL)，丹麥諾維信公司;海藻酸鈉、CMC、聚乙烯醇(PVA)、阿拉伯膠、黃原膠、明膠、卡拉膠、橄欖油、無水醋酸銅、異辛烷、戊二醛、無水乙醇、吡啶、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、濃鹽酸等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；磁力攪拌器，德國IKA公司；水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱，天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；JRJ-300-I型乳化剪切攪拌機，上海標本模型廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪酶液的配制

取一定體積的米黑根毛霉脂肪酶，用0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液配成濃度分別為400、600、800、1 000、1 200 U/mL的脂肪酶液，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 脂肪酶的固定化

復(fù)合載體的制備：按一定質(zhì)量比分別向海藻酸鈉中添加阿拉伯膠、CMC、PVA、黃原膠、明膠和卡拉膠6種膠體，沸水浴加熱溶解并在燒杯中攪拌均勻，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL。

包埋法制備固定化脂肪酶：取5 mL復(fù)合載體溶液與2 mL脂肪酶液于燒杯中，攪拌均勻。用注射器將混合液逐滴加入到CaCl2溶液中形成直徑約為3 mm的顆粒狀物質(zhì)，并置于4℃冰箱中硬化一定時間(固定化時間)。隨后抽濾獲得規(guī)則、均勻的小顆粒，用去離子水沖去表面殘留溶液，得到固定化脂肪酶，保存在4℃冰箱中。

包埋-交聯(lián)法制備固定化脂肪酶：依據(jù)包埋法制備固定化脂肪酶的流程，在CaCl2溶液中加入一定質(zhì)量分數(shù)的戊二醛作為交聯(lián)劑，其余步驟保持不變，此時的固定化時間為交聯(lián)固定化時間。

1.2.3 脂肪酶活力及酶活力回收率測定

參照銅皂-分光光度法[18]測定脂肪酶活力。

游離酶活力的測定：按文獻[18]的方法制備橄欖油乳化液，取1 mL底物橄欖油乳化液、1.25 mL磷酸鹽緩沖溶液置于40℃水浴中預(yù)熱5 min，加入0.25 mL酶液(使用pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋)，混合搖勻，待反應(yīng)15 min后迅速加入0.5 mL 6 mol/L 的鹽酸溶液和3 mL 95%的乙醇終止反應(yīng)。隨后加入1.5 mL異辛烷，60℃反應(yīng)10 min后于室溫水中冷卻。待溶液冷卻后，移取0.5 mL上層溶液，依次加入2 mL異辛烷和0.5 mL銅鹽顯色劑，振蕩后靜置，取100 μL上層清液在714 nm波長下測定吸光度。再根據(jù)脂肪酸濃度-吸光度標準曲線方程(y=0.013 3x+0.002 4，式中：y為吸光度；x為脂肪酸濃度，μmol/L)的脂肪酸濃度。按下式計算酶活力(1 min 內(nèi)催化底物水解產(chǎn)生 1 μmol 脂肪酸所需的酶量為 1 個酶活單位(U))。

A=CV/(tm)

(1)

式中：A為脂肪酶活力，U/g；C為脂肪酸濃度，μmol/L；V為反應(yīng)液體積，L；t為反應(yīng)時間min；m為脂肪酶的加入量，g。

固定化酶活力的測定:將500 mg固定化酶浸入0.25 mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液中代替上述0.25 mL酶液，其余步驟相同。

相對酶活力是指在同組試驗中將酶活力最高者設(shè)為100%，其余組的酶活力與之相比。

固定化酶活力回收率(y)按式(2)計算。

y=A1/A0×100%

(2)

式中：A1為固定化酶的總活力；A0為用于固定化的酶的總活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 包埋法脂肪酶固定化條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 復(fù)合載體對固定化效果的影響

在脂肪酶液濃度800 U/mL、海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2%、膠體質(zhì)量分數(shù)2.5%、CaCl2質(zhì)量分數(shù)5%、固定化時間30 min條件下，考察復(fù)合載體對固定化效果的影響，結(jié)果見圖1。

注：A.海藻酸鈉；B.海藻酸鈉-阿拉伯膠；C.海藻酸鈉-PVA；D.海藻酸鈉-黃原膠；E.海藻酸鈉-明膠；F.海藻酸鈉-卡拉膠；G.海藻酸鈉-CMC。

從圖1可知，6種復(fù)合載體的固定化效果均優(yōu)于海藻酸鈉，其中海藻酸鈉-PVA、海藻酸鈉-CMC復(fù)合載體的固定化酶活力回收率較高，分別達30.29%、31.97%。這兩種復(fù)合載體處理下制得的凝膠顆粒光滑且均勻，達到了試驗所需要求。但試驗過程中，CMC比PVA易溶解，且無雜質(zhì)，因此選擇海藻酸鈉-CMC為最佳復(fù)合載體。

2.1.2 脂肪酶液濃度對固定化效果的影響

以海藻酸鈉-CMC為復(fù)合載體，在海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2%、CMC質(zhì)量分數(shù)0.75%、CaCl2質(zhì)量分數(shù)5%、固定化時間30 min條件下，考察脂肪酶液濃度對固定化效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 脂肪酶液濃度對固定化效果的影響

從圖2可知，隨著脂肪酶液濃度的增加，固定化酶的相對酶活力逐漸增大，但固定化酶活力回收率卻逐漸降低。造成該現(xiàn)象的原因是當脂肪酶液濃度較低(酶添加量較少)時，脂肪酶液被復(fù)合載體盡數(shù)包埋，使得固定化效率較高，但酶的總含量有限，酶活力無法繼續(xù)提高；隨著脂肪酶液濃度的增加，復(fù)合載體包埋的酶量逐漸達到飽和，脂肪酶液無法被繼續(xù)包埋，導(dǎo)致固定化效率逐漸降低[19]。因此，綜合考慮固定化酶的相對酶活力和酶活力回收率，選擇脂肪酶液濃度800 U/mL為最佳。

2.1.3 海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響

以海藻酸鈉-CMC為復(fù)合載體，在脂肪酶液濃度800 U/mL、CMC質(zhì)量分數(shù)0.75%、CaCl2質(zhì)量分數(shù)5%、固定化時間30 min條件下，考察海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響

研究表明，海藻酸鈉的分子鏈可與Ca2+發(fā)生交聯(lián)而形成固態(tài)凝膠，其質(zhì)量分數(shù)過低或過高均會影響固定化效果[20]。從圖3可知，隨著海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)的提高，固定化酶的相對酶活力先升高后降低。當海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為1%和3%時，固定化酶的相對酶活力僅分別為57.10%和52.91%。這是因為海藻酸鈉的質(zhì)量分數(shù)過低時，凝膠顆粒的光滑度和硬度較差，不利于酶在凝膠中的固定；當海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)過高時，凝膠溶液因黏度過大難以擠壓成球形，同時凝膠孔徑過小也使其與酶分子的接觸受阻，影響兩者的結(jié)合，使固定化效果下降[21-22]。因此，選擇海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2%為最佳。

2.1.4 CMC質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響

以海藻酸鈉-CMC為復(fù)合載體，在脂肪酶液濃度800 U/mL、海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2%、CaCl2質(zhì)量分數(shù)5%、固定化時間30 min條件下，考察CMC質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 CMC質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響

從圖4可知，隨著CMC質(zhì)量分數(shù)的提高，固定化酶的相對酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當CMC質(zhì)量分數(shù)較低時，CMC上的羧甲基能促使海藻酸鈉大分子上的基團相互交聯(lián)，增加了分子間的作用力，并在CMC質(zhì)量分數(shù)為0.75%時，效果達到最佳。但隨著CMC質(zhì)量分數(shù)的繼續(xù)增加，氫鍵作用隨之增大，使得CMC無法在凝膠中均勻分布，導(dǎo)致固定化效果下降[23]。因此，選擇CMC質(zhì)量分數(shù)0.75%為最佳。

2.1.5 CaCl2質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響

以海藻酸鈉-CMC為復(fù)合載體，在脂肪酶液濃度800 U/mL、海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2%、CMC質(zhì)量分數(shù)0.75%、固定化時間30 min條件下，考察CaCl2質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 CaCl2質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響

從圖5可知，隨著CaCl2質(zhì)量分數(shù)的增加，固定化酶的相對酶活力先增大后減小。這是因為CaCl2質(zhì)量分數(shù)較低(<5%)時，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)機械強度較差，使得較多酶分子流失在溶液中[24]；雖然CaCl2可以作為酶的激活劑，但當Ca2+濃度過高時，凝膠的通透性降低，影響了酶液的進入[25]。因此，選擇CaCl2質(zhì)量分數(shù)5%為最佳。

2.1.6 固定化時間對固定化效果的影響

以海藻酸鈉-CMC為復(fù)合載體，在脂肪酶液濃度800 U/mL、海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2%、CMC質(zhì)量分數(shù)0.75%、CaCl2質(zhì)量分數(shù)5%條件下，考察固定化時間對固定化效果的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 固定化時間對固定化效果的影響

從圖6可知，固定化酶的相對酶活力隨著固定化時間的延長呈先增大后減小的趨勢。在0～30 min時，凝膠得以充分反應(yīng)而逐步形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能更好地截留并包埋酶分子，使固定化效果增強[26]；當固定化時間大于30 min時，過度反應(yīng)導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)過于致密[27]，孔徑過小，阻礙了底物與酶分子接觸，使得固定化酶的相對酶活力降低。因此，選擇固定化時間30 min為最佳。

2.2 包埋法脂肪酶固定化條件優(yōu)化正交試驗

以海藻酸鈉-CMC為復(fù)合載體，固定脂肪酶液濃度為800 U/mL，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以固定化酶活力回收率(Y)為指標，采用L9(34)正交試驗對海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)(A)、CMC質(zhì)量分數(shù)(B)、CaCl2質(zhì)量分數(shù)(C)及固定化時間(D)4個因素進行優(yōu)化，確定最佳的固定化條件，每組試驗重復(fù)3次。正交試驗因素與水平見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素與水平

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

由表2可知，影響固定化酶活力回收率的因素主次排序為CMC質(zhì)量分數(shù)(B)>CaCl2質(zhì)量分數(shù)(C)>固定化時間(D)>海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)(A)，最佳組合為A3B3C2D3，即海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2.5%、CMC質(zhì)量分數(shù)1.5%、CaCl2質(zhì)量分數(shù)5%、固定化時間40 min。經(jīng)驗證試驗，在最佳條件下固定化酶活力回收率為35.93%。

2.3 包埋-交聯(lián)法脂肪酶固定化交聯(lián)條件的確定

2.3.1 戊二醛質(zhì)量分數(shù)的確定

在包埋法脂肪酶固定化正交試驗優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，考察戊二醛不同質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響(以不加交聯(lián)劑制備的固定化酶的酶活力為100%計)，結(jié)果見圖7。

圖7 戊二醛質(zhì)量分數(shù)對固定化效果的影響

從圖7可知，固定化酶的相對酶活力隨戊二醛質(zhì)量分數(shù)的增大先增大后減小。當戊二醛質(zhì)量分數(shù)較低時，許多酶分子未與交聯(lián)劑反應(yīng)，仍處于包埋狀態(tài)，一旦被洗滌即發(fā)生脫落，因此在一定范圍(0.01%～0.03%)內(nèi)隨著戊二醛質(zhì)量分數(shù)的增加，固定化效果也逐漸增強。值得注意的是，當戊二醛質(zhì)量分數(shù)大于0.03%后，固定化酶的酶活力驟降。這是由于過高含量的戊二醛會對酶分子活力產(chǎn)生影響，同時也會促使凝膠中的羥基充分交聯(lián)，固定過多的酶分子，造成網(wǎng)絡(luò)空隙擁堵[11,28]。因此，選擇戊二醛質(zhì)量分數(shù)0.03%為最佳。

2.3.2 交聯(lián)固定化時間的確定

在包埋法脂肪酶固定化正交試驗優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，添加質(zhì)量分數(shù)0.03%的戊二醛，考察交聯(lián)固定化時間對固定化效果的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 交聯(lián)固定化時間對固定化效果的影響

從圖8可知，固定化酶的相對酶活力隨著交聯(lián)固定化時間的延長先上升后下降。當交聯(lián)固定化時間短于30 min時，交聯(lián)劑暫未充分擴散進凝膠內(nèi)部，與酶分子結(jié)合不充分，故固定化效果會隨著交聯(lián)固定化時間的延長而逐步提升，并在30 min時達到最高，此時固定化米黑根毛霉脂肪酶活力為245.58 U/g。隨著交聯(lián)固定化時間的繼續(xù)延長，酶活力會因網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)過密而下降[25]。因此，30 min為最佳交聯(lián)固定化時間，與包埋法相比縮短了10 min。

2.4 包埋法與包埋-交聯(lián)法脂肪酶固定化效果的比較

將包埋法與包埋-交聯(lián)法最佳條件下制備的固定化米黑根毛霉脂肪酶，按照1.2.3的方法，在40℃和pH 8.5反應(yīng)條件下測定酶活力，然后過濾回收固定化酶，并用磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，繼續(xù)重新測定酶活力，共重復(fù)操作7次，考察不同方法制備的固定化酶的操作穩(wěn)定性，結(jié)果見圖9。

從圖9可知，重復(fù)使用2次后，經(jīng)包埋-交聯(lián)法制備的固定化酶重復(fù)利用性更好，其相對酶活力明顯高于包埋法制備的固定化酶，且最終殘余酶活力可達57.39%。這是因為酶蛋白分子經(jīng)過交聯(lián)處理后可形成共價鍵，其鍵能比其他作用力的鍵能高，使酶蛋白分子的穩(wěn)定性更強[29]。

圖9 固定化酶的操作穩(wěn)定性

將包埋法與包埋-交聯(lián)法最佳條件下制備的固定化米黑根毛霉脂肪酶存儲在4℃冰箱中，每隔7 d按照1.2.3的方法，在40℃和pH 8.5反應(yīng)條件下測定1次酶活力(連續(xù)7周)，考察不同方法制備的固定化酶的儲存穩(wěn)定性，結(jié)果見圖10。

圖10 固定化酶的儲存穩(wěn)定性

從圖10可知，與包埋法制備的固定化酶相比，包埋-交聯(lián)法制備的固定化酶的曲線更為平緩，且儲存7周后的相對酶活力仍可達61.89%。這說明交聯(lián)處理后的固定化酶儲存穩(wěn)定性更好，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.5 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

將最佳包埋-交聯(lián)法固定化條件下制備的固定化酶與游離酶，按照1.2.3的方法，在pH 8.5下于25～60℃范圍內(nèi)每隔5℃測定酶活力，確定了固定化米黑根毛霉脂肪酶和游離米黑根毛霉脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。將固定化酶和游離酶在不同溫度(25～60℃)下處理30 min，按1.2.3方法測定酶活力，考察固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖11。由圖11可知：在40℃時，固定化酶和游離酶的相對酶活力均最高，當溫度低于40℃時，二者的相對酶活力差別不大；但隨著溫度的繼續(xù)升高，兩者的相對酶活力均呈現(xiàn)降低趨勢，但固定化酶下降趨勢更平緩，具有更好的熱穩(wěn)定性。這是因為酶蛋白分子與載體之間存在多種作用力，對酶蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)具有保護作用[30]；同時在熱傳導(dǎo)過程中，由于載體溫度低于外部環(huán)境溫度，使得酶蛋白分子的催化活性中心得到保護，緩和了溫度對其活性的影響，擴大了對溫度的適應(yīng)性[31-32]。當溫度在25～55℃時，固定化酶的相對酶活力保持在69.13%以上。

圖11 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性

2.5.2 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

將最佳包埋-交聯(lián)法固定化條件下制備的固定化酶與游離酶，按照1.2.3方法，在40℃下于pH 6.0～11.0范圍內(nèi)每隔0.5測定酶活力，確定固定化米黑根毛霉脂肪酶和游離米黑根毛霉脂肪酶的最適pH均為8.5。將固定化酶和游離酶在不同pH(6.0～11.0)下處理30 min，按1.2.3方法測定酶活力，考察固定化酶和游離酶的pH穩(wěn)定性，結(jié)果見圖12。

圖12 固定化酶和游離酶的pH穩(wěn)定性

由圖12可知：在pH 8.5時，固定化酶和游離酶的相對酶活力均最高；當pH大于8.5時，二者的相對酶活力差別不大；而當pH為6.0～8.5時，兩者的相對酶活力均呈現(xiàn)增強的趨勢，但固定化酶的相對酶活力均高于游離酶的，呈現(xiàn)更好的pH穩(wěn)定性。這是因為酶蛋白分子經(jīng)過固定化處理后，通過共價鍵(氫鍵或范德華力)結(jié)合到凝膠載體上，酶蛋白分子的柔性降低，剛性增強，使得酶對pH的敏感度降低[33]。在pH 6.5～9.0時，固定化酶的相對酶活力保持在83.37%以上。

3 結(jié) 論

以海藻酸鈉-CMC為復(fù)合載體，戊二醛為交聯(lián)劑，采用包埋-交聯(lián)法固定化米黑根毛霉脂肪酶。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化包埋法固定化工藝條件，并在此基礎(chǔ)上研究了交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)和交聯(lián)固定化時間對固定化酶活性的影響。所得最佳固定化工藝條件為海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2.5%，CMC質(zhì)量分數(shù)1.5%，脂肪酶液濃度800 U/mL，CaCl2質(zhì)量分數(shù)5%，戊二醛質(zhì)量分數(shù)0.03%，交聯(lián)固定化時間30 min。在最佳條件下，固定化米黑根毛霉脂肪酶酶活力為245.58 U/g。同時，對比發(fā)現(xiàn)戊二醛可作為合適的交聯(lián)劑來提高米黑根毛霉脂肪酶固定化效果，且重復(fù)性好、穩(wěn)定性強。通過酶學(xué)特性分析，固定化米黑根毛霉脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為8.5，在高溫(40～60℃)和低pH(6.0～8.5)環(huán)境下的酶活力均高于游離酶的，具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。對于固定化米黑根毛霉脂肪酶，當溫度在25～55℃時，其相對酶活力保持在69.13%以上，在pH 6.5～9.0時，其相對酶活力保持在83.37%以上。由此可見，經(jīng)本試驗優(yōu)化的固定化米黑根毛霉脂肪酶穩(wěn)定性強，適用范圍廣，可以實現(xiàn)多次回收再利用，能夠更好地滿足酶法酯化脫酸在油脂工業(yè)生產(chǎn)中的自動化生產(chǎn)需求。