豬源抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化的研究進展

師帥兵，陳亮亮，王曉利，廖成水

（1.河南科技大學動物科技學院獸醫(yī)生物制品工程重點實驗室，河南 洛陽 471023；2.河南科技大學基礎醫(yī)學院，河南 洛陽 471023）

抗生素的大量使用甚至濫用導致細菌耐藥性的產(chǎn)生和藥物殘留，進而對畜禽和人類健康造成了嚴重危害[1-2]。解決細菌耐藥性和藥物殘留問題已成為世界各國科學家們的重要課題。我國農(nóng)業(yè)部于2020年全面禁止飼料端抗生素的使用，后抗生素危機已經(jīng)到來，開展新型抗菌藥物的研究已迫在眉睫?？咕木哂袕V譜抗菌活性、快速殺菌效應、獨特的抗菌機制及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，吸引了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[3-5]。豬源抗菌肽是從豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的固有免疫效應因子，其結(jié)構(gòu)多樣化，具有廣譜、高效的抑菌作用和多種生物學功能，是一類具有廣泛應用前景的抗菌肽。目前以優(yōu)良的豬源抗菌肽為模板經(jīng)人工改造為新型抗菌藥物的研究成為熱點。本文重點綜述了豬源抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略的研究進展，以期為新型抗菌肽的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 豬源抗菌肽的分類及其抗菌機制

目前，在豬體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種不同的抗菌肽（表1），這些抗菌肽分子量均小于10 ku，空間結(jié)構(gòu)不同，且對多種微生物有殺滅作用。根據(jù)豬源抗菌肽前體的基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列特征可以將其分為Cathelicidin 家族、防御素家族以及皂苷家族。屬于天蠶素（Cecropin）中的一種抗菌肽Cecropin P1 最初是從豬腸道分離出來，后來證實其來源于寄生在豬腸道的蛔蟲[6]。豬源Cathelicidin 家族抗菌肽主要從豬白細胞中分離或從骨髓組織的cDNA 序列推斷而來，分別是富含脯氨酸的線性抗菌肽PR-39、Prophenin-1（PF-1）、Prophenin-2（PF-2），線性的豬髓源性抗菌肽（Porcine myloid antimicrobial peptides，PMAPs）PMAP-23、PMAP-36、PMAP-37 以及富含半胱氨酸的環(huán)形抗菌肽Protegrin-1（PG-1）、Protegrin-2（PG-2）、Protegrin-3（PG-3）、Protegrin-4（PG-4）、Protegrin-5（PG-5）。PR-39 和PFs 分別具有重復的“X-P-P-X”和“FPPPNFPGPR”氨基酸序列，形成了不同于α 螺旋或β 折疊結(jié)構(gòu)的伸展性聚脯氨酸Ⅱ型螺旋結(jié)構(gòu)[7-8]。PR-39 通過穿過細菌細胞膜，進入細胞內(nèi)破壞細菌DNA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以非裂解細菌細胞膜的方式誘導細菌死亡，達到殺滅細菌的目的[9]。PMAP-23、PMAP-36 和PMAP-37 具有典型的兩親性α 螺旋結(jié)構(gòu)，均通過“毯式模型（Carpet model）”的破膜裂解方式發(fā)揮抗菌活性，破壞細菌的細胞膜并使其溶解，繼而導致細菌死亡[10-12]。研究表明PMAP-36 也可以穿過細菌細胞膜并與細胞內(nèi)的DNA 相互作用，進而證明破膜裂解方式并不是PMAP-36 致細菌死亡的唯一作用機制[13]。PGs 具有由C1～C4 和C2～C3 形成的2 個二硫鍵維持的反平行β折疊結(jié)構(gòu)。PG-1 是以“桶-板模型（Barrel-stave model）”破膜裂解的方式殺滅細菌[14]。防御素家族抗菌肽共有幾十種，大多數(shù)由1 個α 螺旋和3 個β 折疊結(jié)構(gòu)組成[15]。在抗菌肽pBD2 殺滅細菌過程中，其中大部分肽分子作用于細菌細胞膜發(fā)揮抗菌活性，而部分肽分子則穿過細菌細胞膜，進入細胞內(nèi)與DNA 相互作用，因此pBD2 可能同時具有多種殺滅細菌的方式[16-17]。目前僅發(fā)現(xiàn)NK-lysin 1 條皂苷家族抗菌肽，其具有5 個兩親性的α 螺旋結(jié)構(gòu)，以“環(huán)孔模型（Toroidal pore model）”破膜裂解的方式發(fā)揮抗菌作用[18]。因此，豬源抗菌肽主要以破膜裂解方式或非裂解細菌細胞膜的方式殺滅細菌。除此之外，在豬體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了一些其它種類的抗菌肽，如在肝臟中高度表達的Hepcidin 抗菌肽和LEAP-2 抗菌肽，這兩種抗菌肽均富含半胱氨酸，Hepcidin 還是一種鐵調(diào)節(jié)激素，既有抗菌活性，又有鐵調(diào)節(jié)活性[19]。還有在骨髓、腸道、肝臟、脾、腎臟等多種組織中均有表達的肽聚糖識別蛋白抗菌肽（PGRPs）等[20]。目前，對這些豬源抗菌肽的研究較少。適量的正電荷和疏水性是豬源抗菌肽發(fā)揮抗菌活性的關(guān)鍵，抗菌肽通過其所攜帶的正電荷與細菌細胞膜表面的負電荷之間的靜電引力吸附于細菌細胞膜表面。隨后，抗菌肽的疏水性區(qū)域插入細菌細胞膜形成跨膜通道造成細菌內(nèi)容物流失，進而導致細菌死亡。以非裂解細菌細胞膜方式殺滅細菌的抗菌肽則是通過與細菌細胞內(nèi)特定的分子靶標相互影響而起作用。

表1 豬源抗菌肽的氨基酸序列

2 豬源抗菌肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化

豬源抗菌肽因較廣的抗菌譜和特有的抗菌機制吸引了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。雖然豬源抗菌肽具有替代傳統(tǒng)抗生素的潛力，但因其抗菌活性低、代謝穩(wěn)定性差及體內(nèi)潛在的毒性阻礙了對其進一步的研究與應用。因此，優(yōu)化豬源抗菌肽的結(jié)構(gòu)，克服其所存在的缺陷與不足具有重要的現(xiàn)實意義。目前對豬源抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化的策略主要包括α 螺旋優(yōu)化、β 折疊優(yōu)化、正電荷優(yōu)化、疏水性優(yōu)化、兩親性優(yōu)化、雜合肽優(yōu)化、截短優(yōu)化和脂肪酸修飾。

2.1 α 螺旋優(yōu)化大多數(shù)α 螺旋型的抗菌肽在水溶液中是無序的，當其與細菌細胞膜相互作用時或在模擬膜環(huán)境中才呈現(xiàn)高度有序的螺旋構(gòu)象，這種形成α 螺旋結(jié)構(gòu)的傾向?qū)咕陌l(fā)揮抗菌活性至關(guān)重要。它們大部分不是嚴格意義上的α 螺旋型結(jié)構(gòu)，而是通常由幾個α 螺旋結(jié)構(gòu)共同組成，其N 端或C端也存在非α 螺旋區(qū)域。誘導抗菌肽形成α 螺旋的傾向，有利于增強抗菌肽的抗菌活性，然而，完全的α 螺旋并非最佳，往往會導致其對靶細胞失去選擇性[21]。Wang 等通過對PMAP-36 結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的分析，將色氨酸（W）或賴氨酸（K）取代PMAP-36 aa25 和aa26 的脯氨酸（P）形成了PMAP-36PW 和PMAP-36PK 2 條抗菌肽，延長了抗菌肽的α 螺旋區(qū)域?？咕钚院头€(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)PMAP-36PW 和PMAP-36PK 較親本肽的抗菌譜更廣，體外抗菌活性和耐酸堿環(huán)境的能力更強。此外，將這2 條衍生肽通過腹腔接種于豬霍亂沙門菌C78-1 和單增李斯特菌CICC 21533 感染的小鼠，采用熒光定量PCR 法檢測小鼠肺臟和肝臟的載菌量，結(jié)果顯示，PMAP-36PW 和PMAP-36PK 可以殺滅小鼠體內(nèi)感染的細菌，并且減輕了小鼠肺臟和肝臟組織的炎癥損傷，進而降低了小鼠死亡率，表現(xiàn)出較好的治療效果[22]。Wang 等對PMAP-36 的截短肽PMAP-GI24 進行序列分析，通過延伸PMAP-GI24 的α 螺旋區(qū)域，設計合成了2 條衍生肽PMAP-24KK 和PMAP-24WW。PMAP-24KK 和PMAP-24WW 不僅在體內(nèi)外的抗菌活性高于PMAP-GI24，而且還表現(xiàn)出更廣的抗菌譜[5]。這些研究表明延長抗菌肽的α 螺旋區(qū)域是提高抗菌肽抗菌活性的有效策略，為設計其他高效的抗菌肽提供參考依據(jù)。

2.2 β 折疊優(yōu)化大多數(shù)β 折疊型的抗菌肽在水溶液或模擬膜的環(huán)境中呈現(xiàn)出β 折疊構(gòu)象[23]。兩親性β 折疊型的抗菌肽通常具有很強的抗菌潛力和細胞選擇性[24]。Shan 等通過對PG-1 的序列分析，以PG-1 的β 折疊模板RR（XY）2XDPGX（YX）2RR-NH2（X 代表I、W、V 或F；Y 代表H）為基礎，設計產(chǎn)生了HI2、HW2、HV2 和HF2 4 條衍生肽。這些衍生肽在模擬膜環(huán)境中形成了更多的β 折疊結(jié)構(gòu)。其中，抗菌肽HV2 對革蘭氏陰性菌有較強的抗菌活性，對正常細胞幾乎無毒性，表現(xiàn)出較好的療效[25]。因此，根據(jù)β 折疊型抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征，設計并研發(fā)能夠取代抗生素的新型β 折疊結(jié)構(gòu)抗菌肽很有必要。

2.3 正電荷優(yōu)化抗菌肽所具有的正電荷在抗菌過程中發(fā)揮重要作用，大多數(shù)陽離子兩親性抗菌肽的凈正電荷范圍為+2～+9，抗菌肽則通過正負電荷的相互作用吸附于細菌細胞膜表面[26]。此外，抗菌肽中帶正電荷的精氨酸與其穩(wěn)定性也密切相關(guān)[27]。Wang 等通過分析抗菌肽PMAP-37 的結(jié)構(gòu)和氨基酸組成，將帶正電荷的精氨酸（R）對PMAP-37 aa9 和aa34 非極性的苯丙氨酸（F）替換得到PMAP-37（F9-R）、PMAP-37（F34-R）和PMAP-37（F9/34-R）3 條衍生抗菌肽。與親本肽相比，PMAP-37 的衍生肽在抗菌活性、熱穩(wěn)定性以及耐酸堿環(huán)境的能力均有所提高，其中PMAP-37（F9-R）和PMAP-37（F9/34-R）的抗菌譜更廣，但這二者的抗菌活性并無顯著差異。在小鼠感染模型中，則是PMAP-37（F34-R）的療效較好[28]。同時，Wang 等將精氨酸（R）對PMAP-23 aa5 的亮氨酸（L）替換得到了攜帶更高正電荷的衍生肽PMAP-23R。與親本肽PMAP-23 相比，PMAP-23R 的抗菌活性和穩(wěn)定性更高[29]。Huang 等利用精氨酸（R）或賴氨酸（K）取代了pBD2 的8 個氨基酸殘基，得到了8 條結(jié)構(gòu)相似，且攜帶更高正電荷的衍生肽。pBD2 的衍生肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表現(xiàn)出不同的抗菌活性，其中I4R 的抗菌活性最強，且所有pBD2 的衍生肽均表現(xiàn)出較低的溶血性[30]。因此，引入帶正電荷的氨基酸能夠增強豬源抗菌肽的抗菌活性，但其抗菌活性并不與正電荷氨基酸的數(shù)量成正相關(guān)。

2.4 疏水性優(yōu)化抗菌肽的疏水性區(qū)域在抗菌過程中發(fā)揮重要作用，在抗菌肽吸附于細菌細胞表面后，其疏水性區(qū)域能夠插入細菌細胞膜，破壞細菌細胞膜的正常結(jié)構(gòu)，繼而致細菌死亡[31]。Lee 等在不改變PMAP-23 螺旋結(jié)構(gòu)的前提下，對其aa10、aa13和aa14 的氨基酸用色氨酸（W）替換得到了疏水性更高的衍生肽（P1～P6），且所有衍生肽的抗菌活性均有所提高，其中P6 的抗菌活性最高[32]。Wang 等對PMAP-37 aa13 的精氨酸（R）、aa20 和aa27 的賴氨酸（K）用非極性的異亮氨酸（I）替換得到PMAP-37（R13-I）和PMAP-37（K20/27-I）2 條抗菌肽，不僅增強了親本肽的疏水性，而且PMAP-37 衍生肽的抗菌活性、熱穩(wěn)定性以及耐酸堿環(huán)境的能力均增強，其中PMAP-37（K20/27-I）的抗菌譜更廣，抗菌活性更高，對感染小鼠的療效也較好[33]。此外，Wang 等對PMAP-23 aa19 的蘇氨酸（T）用異亮氨酸（I）替換得到PMAP-23I，不僅增強了親本肽的疏水性，且PMAP-23I的抗菌活性和穩(wěn)定性也更高[29]。因此，在一定范圍內(nèi)抗菌肽的疏水性越高，其抗菌活性越強。

2.5 兩親性優(yōu)化疏水性和親水性氨基酸在抗菌肽分子結(jié)構(gòu)上所形成的兩親性對其發(fā)揮生物活性至關(guān)重要[34]。完美兩親性是指親水性氨基酸集中分布在抗菌肽螺旋輪結(jié)構(gòu)的一側(cè)，疏水性氨基酸則集中分布在另一側(cè)，但完美兩親性通常會導致抗菌肽的抗菌活性和細胞毒性同時增加[35]。因此，在不改變抗菌肽其它結(jié)構(gòu)的前提下，可以通過氨基酸的取代或截短進行兩親性的優(yōu)化。PMAP-36“N”端由16 個氨基酸組成的RI16 是1 條完美兩親性的抗菌肽。Shan等根據(jù)α 螺旋蛋白的折疊原理，利用色氨酸（W）取代位于RI16 兩親性結(jié)構(gòu)中成對的賴氨酸（K），優(yōu)化了RI16 的完美兩親性結(jié)構(gòu)，設計出4 條衍生肽PRW3、PRW4、PRW5 和PRW6。結(jié)果表明4 條衍生肽比RI16 的抗菌活性更強，而溶血性并未發(fā)生變化，保持了較好的生物安全性[36]。因此，通過適度優(yōu)化抗菌肽的兩親性對抗菌制劑的開發(fā)具有較高的參考價值。

2.6 雜合肽優(yōu)化雜合肽優(yōu)化是通過基因重組技術(shù)將不同抗菌肽的功能片段進行拼接，構(gòu)建具有更高抗菌活性抗菌肽的優(yōu)化技術(shù)[37]。Park 等利用基因重組技術(shù)將來源于噬菌體P22 的溶菌酶與PMAP-36 的“N”端連接獲得了雜合肽PMAP36-P22。PMAP36-P22 不僅抗菌活性較高，且溶血活性大幅度降低[38]。Li 等通過化學合成法將PG-1 與脂多糖（LPS）的結(jié)合域雜交，設計了1 條新型雜合肽SynPG-1。結(jié)果表明SynPG-1 比PG-1 的抗菌活性和血清穩(wěn)定性均更高[39]。Shan 等利用來源于PMAP-36 的PRW4 分別與Fowlicidin-2（aa1～aa15）的兩親性螺旋區(qū)域、PG-3(aa6～aa16)的β 折疊區(qū)域和Tritrpticin 中富含色氨酸（W）的活性中心連接，通過固相合成法設計合成了3 條雜合肽PR-FO、PR-PG 和PR-TR，這些雜合肽不僅比親本肽的抗菌譜更廣，抗菌活性、穩(wěn)定性和殺菌效率更高，且在宿主紅細胞和細菌細胞之間，其對細菌細胞的選擇性更高，因而對宿主的殺傷性很小[40]。這些研究表明雜合肽優(yōu)化是開發(fā)新型抗菌藥物的非常有前景的一種優(yōu)化方式。

2.7 截短優(yōu)化抗菌肽的肽鏈通過分子內(nèi)的氫鍵作用保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，進而更好的發(fā)揮抑菌作用[41]?？咕牡碾逆溸^長會增加其對細胞的毒性，肽鏈過短則會降低其形成兩親性結(jié)構(gòu)的趨勢和破膜能力，進而降低其抗菌活性。因此，合適的肽鏈長度對抗菌肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和抗菌活性至關(guān)重要[41]。Shan 等根據(jù)抗菌肽PMAP-36 的結(jié)構(gòu)特點，通過截短PMAP-36的氨基酸序列設計合成了GI24、GK12、RI12 和PG12 衍生肽，抗菌活性的測定結(jié)果顯示，與親本肽相比，GI24 的抗菌活性較高，GK12 和RI12 的抗菌活性顯著降低，PG12 則失去了對所有測試菌的抗菌活性，且PMAP-36 與GI24 的溶血活性相似，而GK12 和RI12 均未顯示出溶血活性[11]。Park 等使用固相合成法合成了PR-39 和具有其“N”端前35 個氨基酸序列的PR-35，通過測定其抗菌活性和細胞毒性發(fā)現(xiàn)，PR-35 不僅與PR-39 的抗菌活性相似，且對細胞的毒性更低[42]。因此，截短肽對抗菌活性的影響依賴于親本肽的活性區(qū)域，且截短肽對細胞的毒性更低。截短優(yōu)化為開發(fā)具有更高細胞選擇性的抗菌藥物提供了新思路。

2.8 脂肪酸修飾脂肪酸是生物膜磷脂的重要成分，具有高疏水性[43]。脂肪酸修飾不僅不會改變抗菌肽原有的作用方式，而且可以在提高抗菌肽疏水性的同時，增加其α 螺旋含量，穩(wěn)定其α 螺旋結(jié)構(gòu)[44-45]。脂肪酸修飾可以增強抗菌肽與細菌細胞膜的相互作用，進而提高其抗菌活性[45-46]。然而，隨著脂肪鏈長度的增加，抗菌肽的抗菌活性和溶血性將同時增加[45]。因此，選擇合適的脂肪酸修飾對于提高抗菌肽的抗菌活性至關(guān)重要。Wang 等將PMAP-23RI 的“C”端與癸酸共價連接得到1條新型抗菌肽PMAP-23RI-Dec。與PMAP-23RI 相比，PMAP-23RI-Dec的抗菌活性和熱穩(wěn)定性更高，而溶血性和對細胞的毒性基本未變，且在小鼠的刀傷、膿腫和腹膜炎模型中，PMAP-23RI-Dec 的細菌清除能力和療效均比PMAP-23RI 更強[47]。Wang 等將肉豆蔻酸與PMAP-36PW 的“N”端共價連接得到1 條新型抗菌肽Myr-36PW。肉豆蔻酸的修飾提高了PMAP-36PW 的抗菌活性，但其溶血性和對細胞的毒性并未改變。同時，Myr-36PW 還表現(xiàn)出較高的熱、酸堿、鹽離子和血清穩(wěn)定性，在小鼠的刀傷、膿腫、肺炎和腹膜炎模型中，Myr-36PW 的療效均更好[48]。因此，脂肪酸修飾能夠提高抗菌肽的抗菌活性和穩(wěn)定性，是一種非常有潛力的抗菌肽優(yōu)化方式。

3 小結(jié)與展望

豬源抗菌肽具有分子量小、抗菌譜廣等優(yōu)點，是構(gòu)成豬免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵因子。目前，已在豬體內(nèi)鑒定出幾十種抗菌肽，其多樣化的結(jié)構(gòu)使抗菌肽具有不同的生物學功能，相信隨著質(zhì)譜和色譜技術(shù)的廣泛應用和研究的深入，將會發(fā)現(xiàn)越來越多的豬源抗菌肽，進一步豐富豬源抗菌肽的種類。由于全球都亟需尋找抗生素的替代品，對于豬源抗菌肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化成為當前開發(fā)新型抗菌藥物的研究熱點。本研究室多年從事天然抗菌肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究，尤其對豬源抗菌肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究得較為深入，證明了正電荷優(yōu)化、疏水性優(yōu)化、α 螺旋優(yōu)化、脂肪酸修飾等是有效的抗菌肽優(yōu)化策略，且通過各種優(yōu)化可以提高豬源抗菌肽的抗菌活性、穩(wěn)定性，拓寬其抗菌譜，為豬源抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化的深入研究奠定了基礎[3,4,5,22,28,33]。隨著蛋白質(zhì)修飾技術(shù)的快速發(fā)展，抗菌肽的抗生素偶聯(lián)、金屬修飾、聚乙二醇化和糖基化也取得了一些進展[44]。但這些結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略在豬源抗菌肽上的研究尚未見報道。隨著蛋白質(zhì)修飾技術(shù)的發(fā)展和對豬源抗菌肽研究的進一步深入，豬源抗菌肽的結(jié)構(gòu)、功能、優(yōu)化策略和體內(nèi)的代謝分布等薄弱環(huán)節(jié)的研究將會有新的突破。本文為豬源抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略的選擇和新型高效抗菌肽的研發(fā)提供了理論參考。