廣東地區(qū)羊源凝固酶陰性葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

羅靜龍，張凱川，賈榮榮，陳柳妃，賈 坤*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣東 廣州 510642；3.廣東省寵物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

葡萄球菌可分為凝固酶陽性葡萄球菌（Coagulase-positiveStaphylococcus，CPS）和凝固酶陰性葡萄球菌（CNS），其中CNS 包括松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌或腐生葡萄球菌等，它們通常定居在人類和動物的皮膚或粘膜上，是一種重要的條件性致病菌[1]。CNS 是臨床導致奶牛乳房炎的重要病原之一，常對畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[2]。CNS 是甲氧西林耐藥基因（mecA）的儲存庫，該基因位于一種稱為葡萄球菌盒式染色體的可移動遺傳元件上，通過編碼青霉素結(jié)合蛋白獲得甲氧西林抗性，使大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素完全失活。據(jù)報道，mecA基因可以在CNS 中進化，并水平轉(zhuǎn)移到其他易感的葡萄球菌中[3]。CNS 主要通過改變藥物的靶向位點、酶的失活、降低細胞膜的通透性以及外排泵獲得對抗生素的耐藥性[4]。耐藥菌株的不斷出現(xiàn)對動物健康及食品安全造成了巨大威脅，已報道在牲畜、肉末和散裝罐奶[3]、奶牛乳房炎[5]、零售雞肉[6]以及即食食品[7]中分離出多重耐藥的CNS。由于具有普遍的多重耐藥性以及難以預測的流行病學風險，并可能從動物傳播給人類，CNS 已成為具有重要臨床意義的病原菌。

呼吸道疾病是羊養(yǎng)殖中最常發(fā)生的疾病之一，占小反芻動物疾病總數(shù)的5.6%。近年來，隨著廣東養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，許多規(guī)模化羊場的呼吸道疾病發(fā)病率也明顯上升，對廣東養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。本研究以廣東各地采集的279 份羊鼻拭子樣品為研究對象，通過分離鑒定、藥敏試驗以及耐藥基因的檢測，對廣東地區(qū)羊源CNS 進行研究，為廣東省羊呼吸道疾病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料2018 年～2020 年本研究室分別從廣東省湛江、陽江、肇慶、梅州、河源5 個市的不同規(guī)?；B(yǎng)殖場采集有呼吸道疾病的羊鼻拭子樣品146 份、74 份、35 份、18 份、6 份，合計279份?；疾⊙蚓癯劣簦才P，咳嗽、流粘液性或膿性鼻液，部分羊流淚，眼分泌物增多，嚴重者表現(xiàn)為呼吸困難，且為腹式呼吸。

3 周齡昆明系小鼠由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。LB 肉湯、LB 營養(yǎng)瓊脂、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；高純度低電滲瓊脂糖購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；2×TaqPCR StarMix with Loading Dye、Sterile ddH2O 購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶、5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；F-DH5α 快速轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；快速革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 病原菌的分離及形態(tài)學觀察將采集的279 份鼻拭子樣品分別置于1 mL 滅菌LB 營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h 增菌。將過夜培養(yǎng)物接種于5%綿羊血平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取優(yōu)勢菌落進行純培養(yǎng)。將純化后的菌株接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基進行選擇培養(yǎng)，挑取單菌落至玻片上經(jīng)革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察。

1.3 分離菌16S rRNA 的PCR 擴增及序列分析利用16S rRNA 基因通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′/1492R： 5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′），引物由天一輝遠生物科技有限公司合成。提取各分離株基因組DNA 作為模板進行PCR 擴增，反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并經(jīng)天一輝遠生物科技有限公司測序，將測序所得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的已知序列對比分析，確定分離菌種類。

1.4 小鼠的致病性試驗隨機選取10 株CNS，采用平板菌落計數(shù)法計算菌液濃度，將菌液濃度稀釋為1×108cfu/mL。將小鼠隨機分成A、B 兩組（A 組，n=10，雌雄各半；B 組，n=2，雌雄各一只），A 組小鼠根據(jù)體質(zhì)量按0.02 mL/g 腹腔注射菌液，B 組小鼠注射同等量的無菌生理鹽水。每3 h 觀察小鼠的精神、飲食及死亡情況，剖檢死亡小鼠觀察病變，無菌采集心、肝、脾、肺、腎等臟器接種至LB 營養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng)24 h后選取優(yōu)勢菌進行革蘭氏染色及生化試驗，并與接種細菌對比，同時將采集的死亡小鼠臟器稱重，加入1 mL無菌生理鹽水研磨至勻漿，10倍倍比稀釋，分別吸取各稀釋度勻漿液200 μL 接種于LB 營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，重復3 次，計算各器官載菌量。對7 d 后仍未發(fā)病死亡的小鼠迫殺，觀察臟器是否發(fā)生病變。

1.5 分離菌的藥物敏感性試驗按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的標準，采用K-B 紙片擴散法檢測分離株對臨床19 種常見抗生素的敏感性。

1.6 分離菌主要耐藥基因的檢測參照文獻[8-12]并根據(jù)GenBank 登錄的各類耐藥基因序列，設(shè)計并合成β-內(nèi)酰胺類（CTX-M、TEM、SHV、mecA）、磺胺類（sul1、sul2、sul3）、喹諾酮類（qnrA、qnrB、qnrS、aac（6）-Ib-cr）、大環(huán)內(nèi)酯類（ermA、ermB、ermC、msrA）、四環(huán)素類（tetK、tetL、tetM、tetO）5 大類共19 對耐藥基因引物，以1.4 提取的各分離菌基因組DNA 為模板進行耐藥基因檢測。用于擴增以上基因的引物由天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.7 耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性分析將各分離菌的耐藥基因檢測結(jié)果與藥敏試驗結(jié)果進行比較，分別計算耐藥符合率、敏感符合率和總符合率，分析各分離菌耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性。

耐藥符合率（%）=耐藥基因陽性耐藥菌株數(shù)/（耐藥基因陽性耐藥菌株數(shù)+耐藥基因陰性耐藥菌株數(shù)）×100%；敏感符合率（%）=耐藥基因陰性敏感菌株數(shù)/（耐藥基因陽性敏感菌株數(shù)+耐藥基因陰性敏感菌株數(shù)）×100%；總符合率（%）=（耐藥基因陽性耐藥菌株數(shù)+耐藥基因陰性敏感菌株數(shù)）/（耐藥基因陽性菌株數(shù)+耐藥基因陰性菌株數(shù)）×100%。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌的分離鑒定結(jié)果279 份羊鼻拭子樣品經(jīng)血平板初次分離，結(jié)合鑒別培養(yǎng)基純化培養(yǎng)和16S rRNA 基因測序分析，結(jié)果顯示，分離菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上呈黃色或紅色菌落，革蘭氏染色陽性，菌體呈球形或橢圓形，排列成葡萄狀。16S rRNA 基因序列對比分析結(jié)果顯示共分離得到46株葡萄球菌，其中檢出41 株CNS，檢出率為14.7%（41/279），溶血葡萄球菌檢出率最高，為19.6%（9/41），其次為腐生葡萄球菌和科氏葡萄球菌，檢出率分別為15.2%（7/41）和13%（6/41）；CPS 的檢出率為12.2%（5/41）（表1）。結(jié)果表明，CNS 在羊呼吸道疾病中的檢出率較高，且種類多樣。

表1 葡萄球菌分離株數(shù)量及檢出率Table 1 Staphylococcus isolates and detection rate

2.2 小鼠的致病性試驗結(jié)果隨機選取10 株CNS，采用腹腔注射的方式感染小鼠，結(jié)果顯示：感染組小鼠在24 h 內(nèi)出現(xiàn)精神沉郁，被毛粗亂，個別小鼠震顫的癥狀，感染小鼠在注射后24 h～36 h 死亡，死亡率為30%（3/10），剖檢死亡小鼠可見肺臟有出血點、腎臟腫大等，從死亡小鼠臟器中分離到的細菌經(jīng)鑒定與注射細菌一致。經(jīng)小鼠器官載菌量檢測，結(jié)果顯示，CNS 分布于小鼠各個臟器，其中以脾臟和肺臟載菌量最多，心臟、肝臟和腎臟載菌量差異不大（表2），接種菌液未死亡的小鼠逐漸恢復正常，對照組小鼠則生長良好，剖檢臟器未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病變。表明分離的CNS 對小鼠具有較強的致病性。

表2 各組小鼠各臟器載菌量檢測結(jié)果（cfu/g）Table 2 Bacterial load in various organs(cfu/g)

2.3 藥物敏感性試驗結(jié)果采用K-B 紙片擴散法檢測41 株CNS 對19 種抗生素的敏感性。結(jié)果顯示：所有CNS 均對頭孢吡肟敏感，對青霉素耐藥率75.6%（31/41），對阿奇霉素、紅霉素、苯唑西林和克林霉素耐藥率分別為68.3%（28/41）、68.3%（28/41）、65.9%（27/41）和65.9%（27/41）（表3）；所有CNS 均存在不同程度的耐藥且至少對2 種抗生素耐藥，其中耐6 種抗生素和9種抗生素的比例各占14.6%（6/41），耐3種抗生素的比例占12.2%（5/41），此外，1株CNS耐14種抗生素，3 株CNS 耐13 種抗生素（圖1）。結(jié)果表明：41株CNS 耐藥性均較強，且多重耐藥現(xiàn)象嚴重。

圖1 41株CNS多重耐藥統(tǒng)計結(jié)果Fig.1 Statistics of multi-drug resistance of the 41 CNS strains

表3 41株CNS的藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of drug susceptibility test of 41 CNS strains

2.4 耐藥基因檢測結(jié)果利用PCR 對41 株CNS 的5大類藥物共19 對耐藥基因進行檢測。結(jié)果顯示：共檢測到4 類共9 種耐藥基因，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermC和msrA的檢出率較高，分別為46.3%（19/41）和24.4%（10/41），其次為β-內(nèi)酰胺類耐藥基因mecA，檢出率為31.7%（13/41）；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、SHV的檢出率較低，分別為7.3%（3/41）和4.9%（2/41）。未檢出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CTX-M、磺胺類耐藥基因sul2和sul3、喹諾酮類耐藥基因qnrA和qnrB、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermA及四環(huán)素類耐藥基因（表4）。結(jié)果表明，廣東羊源CNS 攜帶耐藥基因種類復雜。

表4 分離菌耐藥基因檢測結(jié)果Table 4 Detection results of drug resistance genes in isolates

2.5 耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性分析通過對耐藥基因陽性與陰性菌株的耐藥譜對比分析，并計算耐藥符合率、敏感符合率和總符合率。結(jié)果顯示：耐藥基因ermC、aac（6）-Ib-cr、mecA和sul1與耐藥表型的耐藥符合率較高，分別為50%、45.5%、40.7%和40%，所有耐藥基因與耐藥表型的敏感符合率均較高，為71.4%～100%。綜合耐藥符合率和敏感符合率，耐藥基因ac（6）-Ib-cr和sul1與耐藥表型的總符合率最高，均為85.4%，其次為qnrS和aadA，耐藥基因與耐藥表型的總符合率分別為80.5%和70.8%（表5）?？傊蛛x菌對磺胺類、喹諾酮類的耐藥表型與耐藥基因基本相符，β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥表型與耐藥基因相關(guān)性較低。結(jié)果表明，41 株CNS 的耐藥表型和耐藥基因之間存在一定的相關(guān)性。

3 討 論

羊的呼吸道疾病是發(fā)病率最高的疾病之一，對養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。由于廣東各地羊養(yǎng)殖場呼吸道疾病頻發(fā)，本研究從患呼吸道疾病的羊鼻拭子中共分離41 株CNS，分離率為14.7%。目前對動物中CNS 的研究主要基于乳房炎，對CNS 在動物鼻中的定植知之甚少。有研究報道，通過對80 只上呼吸道感染的馬駒和20 只健康的馬駒鼻腔進行病原分離鑒定，結(jié)果顯示患病動物組中有18 只（22.5%）分離到致病菌，其中CNS 和不動桿菌為優(yōu)勢菌，分別占100%和45%[13]。而在一項針對野豬鼻腔CNS 的研究中，CNS 的檢出率為36.6%（136/371）[14]。在歐洲野兔中也分離到CNS，其中檢出率最高的為福氏葡萄球菌[15]。Abdel-Moein 等研究發(fā)現(xiàn)，由CNS 導致的綿羊和山羊呼吸道疾病發(fā)病率分別為10.3%和18.8%[16]。

本研究對41 株羊源CNS 進行臨床常用藥物敏感性試驗后發(fā)現(xiàn)，分離菌對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類及林可酰胺類抗生素耐藥現(xiàn)象嚴重，該結(jié)果與我國東北地區(qū)[17]、呼倫貝爾地區(qū)[18]牛源CNS 對這幾種受試藥物的耐藥率基本一致。研究報道，通過對西班牙某屠宰場的117 只家畜鼻拭子樣品進行研究，結(jié)果顯示，共分離得到47 株CNS，其中22 個分離株（47%）至少對其中一種抗生素耐藥，對四環(huán)素、克林霉素、紅霉素、青霉素和復方新諾明耐藥率分別為23.4%、19.1%、10.6%、4.3%和2.1%，耐藥水平均低于本研究[19]。在一項針對住院患者鼻腔CNS 的研究中，分離菌對青霉素、紅霉素及克林霉素的耐藥率分別為91.7%、91.7%和50%，耐藥水平與本研究相近[20]。Vasileiou 等對分離自隱性乳房炎的142 株葡萄球菌進行耐藥性分析，結(jié)果顯示，分離株對青霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為22.5%和18.3%[21]。通過對耐藥基因陽性菌株與陰性菌株的耐藥譜分析，41 株CNS 對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥表型和耐藥基因總符合率較低，可能是由于其β-內(nèi)酰胺類抗生素中青霉素類和頭孢菌素類耐藥程度的不同，且隨著頭孢菌素類抗生素代數(shù)的增加，受試菌的耐藥性逐漸降低所致。另外，耐藥表型和耐藥基因相關(guān)性較低，也可能是細菌通過其他耐藥機制獲得對抗生素的耐藥性。

綜上所述，廣東省羊源CNS 的耐藥情況較為嚴重，許多分離菌均呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，對青霉素高度耐藥，耐藥菌株占75.6%。因此，需合理使用抗生素，用藥前根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇藥物，減少預防性用藥，嚴禁使用人用抗生素。另外，應加強對本地區(qū)的耐藥監(jiān)測，掌握細菌的耐藥趨勢，防止耐藥基因的擴散與流行。