不同力竭運動對大鼠紋狀體背外側神經(jīng)元電活動的影響及調節(jié)機制研究

崔書強 劉曉莉 喬德才

1 北京市體育科學研究所（北京100075）

2 北京師范大學體育與運動學院（北京100875）

運動疲勞是人們從事競技運動訓練或體育鍛煉時經(jīng)常出現(xiàn)的一種生理功能暫時下降的現(xiàn)象，與中樞的調節(jié)密切相關[1，2]，但其調節(jié)機制尚不十分清楚。紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)的重要核團，其背外側主要接受來自初級運動皮層（M1）的輸入，與軀體感覺運動的調節(jié)功能有關[3，4]。有研究發(fā)現(xiàn)，運動訓練可引起紋狀體背外側谷氨酸能傳遞和中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neuron ，MSN）興奮性突觸的長時程增強[5]。紋狀體絕大多數(shù)為MSN[6]，紋狀體MSN 的放電與運動速度密切相關[7]，其放電受到GABA能快放電中間神經(jīng)元的強有力的調節(jié)[8-10]，這類中間神經(jīng)元是表達鈣結合蛋白的小清蛋白神經(jīng)元（PV），其參與了行為任務學習中MSN電活動的調節(jié)[11，12]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠運動疲勞后初級運動皮層、紋狀體的局部場電位的α及β振蕩的同步性增強[13，14]，紋狀體神經(jīng)元自發(fā)放電頻率升高[15]，但其升高的原因除與黑質多巴胺能神經(jīng)元投射有關外[16]，對來自初級運動皮層的調節(jié)并不清楚，推測這可能與PV神經(jīng)元的功能活動有關。為此，本研究采用在體多通道陣列微電極結合同步記錄技術，分析大鼠一次力竭運動和重復性力竭運動過程中神經(jīng)元電活動的變化，結合免疫熒光的方法，進一步探討紋狀體背外側在運動疲勞中樞調節(jié)中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

實驗采用健康雄性Wista 大鼠，8 周齡，體重250～300 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。大鼠購進后分籠飼養(yǎng)，自由飲食，自然光照，室溫24℃± 1℃，相對濕度50% ±5%。隨機分為安靜對照組（CG 組）、一次力竭運動組（EG組）和重復力竭運動組（REG組），每組24只。各組分別進行電生理實驗6只和免疫熒光染色實驗18只。

1.2 實驗方案

實驗前先讓EG 組和REG 組大鼠進行3 天適應性跑臺訓練，跑臺速度：第1 天為8 m/min，第2 天為12 m/min，第3 天為15 m/min，每天訓練10 min。之后各組做電生理實驗的大鼠進行電極植入手術，恢復1 周后各組大鼠正式開始實驗，實驗方案如圖1 所示。CG組不進行運動，EG 組進行一次力竭跑臺運動，REG 組進行連續(xù)7天的力竭跑臺運動。跑臺運動方案采用本實驗室依據(jù)Bedford 漸增負荷改進的運動方案[17]，共分三級負荷：Ⅰ級跑速為8.2 m/min、運動15 min；Ⅱ級為15 m/min、運動15 min；Ⅲ級為20 m/min，直至力竭，記錄大鼠運動的時間和距離。力竭標準以大鼠不能跟上跑速，滯留跑道后1/3達3次以上，刺激驅趕無效，刺激后無反應，判斷為力竭[17]。電生理實驗記錄安靜狀態(tài)、一次力竭運動后和7 天重復運動后（REG）的電信號。免疫熒光實驗組中CG組不進行運動，在大鼠購進飼養(yǎng)7 天后取材，EG 組在一次力竭跑臺運動后即刻，REG組進行連續(xù)7天的力竭運動后即刻進行取材。

1.3 在體多通道電信號記錄

1.3.1 電極植入手術

各組做電生理實驗的大鼠使用6%水合氯醛腹腔注射麻醉（350 mg/kg），剃除頭頂毛發(fā)并用酒精碘伏消毒，然后將其固定于腦立體定位儀（RWD，深圳）上。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[18]選取紋狀體背外側部（前囟前0.5～1.4 mm，旁開2.5～3.5 mm）的矩形區(qū)域為開顱區(qū)，在顯微鏡下（WPI，USA）剝離硬腦膜，將16 通道陣列電極（Glo-Bio，USA，電極直徑35 μm、間距200 μm）采用電動微推器（Kofe，USA）在顯微鏡觀察下緩慢植入腦組織（圖1 左），同時打開Central 軟件觀察神經(jīng)元的放電情況，當看到有較大幅值的神經(jīng)元放電且有3 個以上通道出現(xiàn)較穩(wěn)定的放電時，停止推進電極（深度約為3.5 mm～4 mm）。用生物硅膠封住暴露的大腦皮層，待生物硅膠固定后（3～5 min），用牙科水泥固定電極，在腦部皮膚表面用碘伏消毒。為防止術后感染，每日腹腔注射一次青霉素，連續(xù)3 d，恢復一周后進行電生理實驗。

圖1 實驗流程圖

電生理實驗結束后，用4%多聚甲醛灌流固定，取出腦后放入30%蔗糖溶液，4℃保存，待腦沉底后進行冰凍切片，用尼氏染色并對照圖譜確認記錄電極位置（圖2右）。

圖2 電極植入位置及尼氏染色定位圖

1.3.2 電信號的采集與分析

在大鼠安靜狀態(tài)、一次力竭運動和7 天重復力竭運動后即刻，使用Cerebus-128多通道信號系統(tǒng)（Blackrock Microsystems，USA）采集30 min 的電信號。采樣頻率為1000 Hz，采用lowpass 250 Hz濾波獲得局部場電位。利用Neuromotive 系統(tǒng)（Cyberkinetics，USA）同步追蹤記錄大鼠的行為活動。

通過Offline Sorter（Plexon）軟件采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法提取Spike 的波形特征，根據(jù)神經(jīng)元放電集群和神經(jīng)元放電波形選定每類神經(jīng)元集群中心對神經(jīng)元放電進行分類，分類標準是：①所記錄的電生理數(shù)據(jù)信噪比＞3.0；②峰峰間隔＜1 ms 的Spike 不得多于0.1%。分類后的電生理數(shù)據(jù)導入Neuronexploer5.0 對神經(jīng)元放電頻率以及神經(jīng)元鋒電位（Spike）個數(shù)進行分析，最后將數(shù)據(jù)導入到excel進行分析。采用Neuroexplorer 5分析軟件去除50 Hz的工頻干擾（見圖3），然后分析局部場電（LFP）、功率譜密度（power spectral density）和γ頻段（30～80 Hz）。

圖3 對記錄到的LFP去除50 Hz工頻干擾

1.4 PV神經(jīng)元及NMDAR2B陽性神經(jīng)元表達的免疫熒光染色實驗

各組大鼠分別在安靜狀態(tài)、一次力竭運動后和7天力竭運動后即刻進行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水，然后灌注4%多聚甲醛（PFA）至四肢僵直，再剝離取出全腦，放入4%PFA 的30%的蔗糖溶液固定，4℃保存。待腦組織沉底后，參考大鼠腦立體定位圖譜[19]選取紋狀體部位，進行連續(xù)冠狀冰凍切片，厚度40 μm，每6 片選取1 張進行組織免疫熒光雙重染色。

免疫熒光雙重染色：切片置于0.1 M 的PB 中洗1次，3%羊血清室溫封閉30 min；加一抗PV（來源小鼠的單克隆抗體，Abcam，貨號:ab64555）稀釋濃度為1∶1000，一抗NMDAR2B（來源于兔的多克隆抗體，Abcam，貨號:Ab65783 ）稀釋濃度為1∶500，兩種一抗一塊加入并4℃孵育24 h，0.1 M 的PB 洗3 次，每次5 min，二抗采用Alexa Fluor?594 標記的羊抗小鼠IgG（Invitrogen，貨號A-11005）和Alexa Fluor?488 標記的羊抗兔IgG（Invitrogen 貨號：A-11034），二抗稀釋濃度為1∶500，二抗同時加入室溫孵育2 h（避光），0.1 M 的PB 洗3 次，將切片在0.02 M 的PB 中貼于載玻片上，中性甘油封片，Olympus 熒光顯微鏡（DP-73，日本）對大鼠紋狀體背外側部位進行圖像的拍攝，每組大鼠的相同層面中選取6 張腦片進行統(tǒng)計，記錄20 倍鏡下每張片子的陽性細胞的個數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，對各組大鼠的運動時間、運動距離、神經(jīng)元放電頻率與放電個數(shù)、功率譜密度值以及陽性神經(jīng)元個數(shù)等指標，采用單因素方差分析進行差異顯著性檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的運動距離和運動時間

一次力竭運動組和重復力竭運動組大鼠的平均運動距離和平均運動時間見圖4。通過圖4 可以看出重復力竭運動組隨著訓練時間的延長，大鼠平均運動距離和運動時間均呈現(xiàn)出增加趨勢，但與一次力竭運動組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 大鼠運動時間和運動距離

2.2 大鼠紋狀體背外側MSN 和PV 神經(jīng)元放電頻率的特征變化

記錄了不同狀態(tài)下大鼠紋狀體背外側神經(jīng)元的放電，通過Offline Sorter 軟件采用K-means 方法對神經(jīng)元放電進行3D集群分類，并進一步根據(jù)神經(jīng)元放電波形的半波寬度和放電頻率對神經(jīng)元進行分類：神經(jīng)元放電頻率＞5 Hz，半波寬度＜0.2 ms的神經(jīng)元為PV神經(jīng)元；神經(jīng)元放電頻率＜10 Hz，0.2 ms＜半波寬度＜0.6 ms的神經(jīng)元為MSN神經(jīng)元[20]。在紋狀體背外側部我們共記錄到369個神經(jīng)元放電，其中249個神經(jīng)元的放電波幅較寬，放電頻率較低，這種放電模式是典型的MSN神經(jīng)元；其中有81個神經(jīng)元，放電波幅較窄，放電頻率明顯很高，這種放電模式的神經(jīng)元為PV 神經(jīng)元；剩余27個神經(jīng)元為放電波幅大、頻率低的膽堿能神經(jīng)元。MSN 和PV 神經(jīng)元鋒電位波形圖及峰峰間隔直方圖見圖5。對MSN 和PV 神經(jīng)元放電頻率統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，MSN神經(jīng)元放電頻率在7天重復力竭運動后與安靜狀態(tài)下相比出現(xiàn)了顯著性升高（P＜0.01），見圖6A；PV 神經(jīng)元放電頻率在重復力竭運動后有所升高，但與各組相比不具有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖6B。

圖5 MSN、PV神經(jīng)元放電波形及鋒電位間隔直方圖及自相關圖

圖6 MSN和PV神經(jīng)元放電頻率圖（n=6）

2.3 大鼠紋狀體背外側局部場電位的變化

大鼠在不同狀態(tài)下的功率頻譜和功率譜密度見圖7，由大鼠紋狀體背外側功率頻譜圖可以看出重復力竭運動后較一次力竭運動后各頻段的能量值有所增強。

圖7 三組大鼠紋狀體功率譜密度和功率頻譜圖

大鼠安靜狀態(tài)下、一次和7 天重復力竭運動后紋狀體背外側LFP 的功率譜密度對比見圖8A，通過對比可以看出7天重復力竭運動后30～80 Hz的γ頻段的功率譜密度有所升高。進一步對γ頻段的功率譜密度進行分析發(fā)現(xiàn)一次和重復力竭運動后與安靜狀態(tài)下相比均出現(xiàn)了明顯升高（P＜0.01），7天重復力竭運動后升高更加明顯且與一次力竭運動后相比也明顯升高（P＜0.05），見圖8B。

圖8 紋狀體背外側LFP的功率譜密度

2.4 力竭運動前后大鼠紋狀體背外側PV 陽性神經(jīng)元及NMDAR2B陽性神經(jīng)元的表達

通過圖9a可以看出REG組紋狀體背外側PV陽性神經(jīng)元表達最明顯，EG組次之，CG組表達最弱。通過對各組PV 陽性神經(jīng)元個數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，EG 組較CG 組PV陽性神經(jīng)元個數(shù)有顯著性增加（P＜0.05），REG 組較CG組PV陽性神經(jīng)元個數(shù)增加更加顯著（P＜0.01）。EG組和REG組NMDAR2B陽性神經(jīng)元在紋狀體背外側均有較明顯的表達，但EG組和REG組NMDAR2B陽性神經(jīng)元個數(shù)與CG 組相比無顯著性差異（P＞0.05）。在REG 組PV 陽性神經(jīng)元與NMDAR2B 陽性神經(jīng)元共表達明顯，REG組共表達神經(jīng)元個數(shù)與CG組相比具有顯著性差異（P＜0.01）。

圖9 紋狀體背外側PV和NMDAR2B陽性神經(jīng)元的表達（n=8）

3 討論

3.1 一次力竭和7 天重復力竭對紋狀體背外側神經(jīng)元電活動的影響

本研究結果顯示，一次力竭運動后紋狀體背外側MSN 放電頻率并未出現(xiàn)顯著性改變，在7 天重復力竭運動后紋狀體背外側MSN的放電頻率均出現(xiàn)了顯著升高，PV 神經(jīng)元的放電頻率在7 天重復力竭運動后也出現(xiàn)了升高。Yin 等發(fā)現(xiàn)大鼠在進行轉棒訓練的初期大鼠的背內側紋狀體有短暫的激活，而紋狀體背外側沒有顯著性改變[5]，提示一次急性運動未能明顯激活紋狀體背外側。Costa 等發(fā)現(xiàn)大鼠在進行轉棒訓練過程中和經(jīng)過過度訓練后，大鼠紋狀體神經(jīng)元放電的數(shù)量和頻率也都出現(xiàn)了增加[21]。本研究中大鼠經(jīng)過了7 天的力竭性跑臺訓練，與轉棒訓練所引起的神經(jīng)元放電的改變相一致，這提示7 天重復力竭運動與過度訓練所引起的神經(jīng)元的激活可能存在共同的神經(jīng)調節(jié)機制。

經(jīng)過7天重復力竭運動后紋狀體背外側MSN神經(jīng)元放電頻率出現(xiàn)了顯著性增加，Kim 等也發(fā)現(xiàn)在小鼠糖水獎賞實驗中紋狀體MSN 和PV 神經(jīng)元的放電頻率與頭的運動速度呈正相關關系[6]，7 天重復力竭運動運動時間和距離的增加與紋狀體背外側MSN電活動的改變有密切相關。研究發(fā)現(xiàn)任務訓練可引起與任務相關的神經(jīng)元放電的增加以及非任務相關的神經(jīng)元放電得到抑制，這種神經(jīng)元放電模式的變化與行為表現(xiàn)高度相關[19]。長期運動訓練及應激可引起紋狀體背外側的激活，在行為決策和表現(xiàn)中更傾向于習慣化[3]。由此我們推測長期訓練引起的疲勞與紋狀體背外側電活動的改變有關。

紋狀體PV神經(jīng)元雖然相對較少，但對MSN神經(jīng)元的興奮性輸出起重要的調控作用，對神經(jīng)網(wǎng)絡的可塑性，抑制非任務相關的神經(jīng)元放電起重要作用。紋狀體背外側PV 神經(jīng)元主要是來自初級運動皮層和軀體感覺皮層的GABA 能投射[22]，紋狀體PV 神經(jīng)元可以將皮層的感覺運動信息通過前饋抑制對MSN神經(jīng)元進行調節(jié)[23]。Lee等發(fā)現(xiàn)PV神經(jīng)元影響了大鼠最初的條件性獎賞反應的表現(xiàn)，PV神經(jīng)元對MSN活性的調節(jié)較為敏感，而隨著訓練的增加這種調節(jié)作用出現(xiàn)了降低[11]。由此來看，一次急性力竭運動導致的疲勞，來自皮層對紋狀體背外側的抑制性調節(jié)更加敏感，而7 天重復力竭后皮層向紋狀體的這種抑制性投射有所增強。本研究中發(fā)現(xiàn)在一次力竭運動后PV 神經(jīng)元放電有所降低，可能與MSN對PV神經(jīng)元的抑制作用較為敏感有關，而在7天重復力竭運動后PV 神經(jīng)元放電頻率出現(xiàn)了一定升高，重復力竭運動后PV神經(jīng)元對MSN的抑制作用增強，提示重復力竭運動后皮層的抑制性信息傳入增強。局部場電位（LFP），更能反映神經(jīng)元集群的放電效應，對紋狀體背外側LFP 分析發(fā)現(xiàn)一次力竭運動后和7 天重復力竭運動后γ頻段功率譜密度均出現(xiàn)了顯著性升高。Thron 等對紋狀體背外側的神經(jīng)元放電頻率和局部場電進行了同步記錄，結果發(fā)現(xiàn)PV神經(jīng)元呈現(xiàn)出任務相關和訓練相關電變化與對應的MSN的相一致[20]。這與本研究中7 天重復力竭運動引起了MSN放電頻率的升高以及局部場電位γ頻段功率譜密度升高相一致。MSN放電頻率的增高一方面可能是來自皮層的谷氨酸能興奮性傳入增強，引起MSN興奮性升高，導致MSN的放電頻率增強，另外MSN也接受來自黑質多巴胺的投射，在力竭后DLS區(qū)多巴胺D2受體的減少[14]，引起直接通路和間接通路調節(jié)失衡從而可能導致了MSN 的過渡激活。MSN 的突觸在PV 神經(jīng)元上尚未發(fā)現(xiàn)，但PV神經(jīng)元與MSN形成了廣泛的突觸聯(lián)系。PV神經(jīng)元在力竭后產(chǎn)生的γ波的增強，這種增強更多表現(xiàn)出皮層與紋狀體聯(lián)系的增強，同時MSN 也出現(xiàn)了放電的增加。MSN也接受來自PV的抑制性輸入，在重復力竭后這種抑制增強，但與皮層的興奮性輸入增強相比，皮層的興奮性輸入對MSN起更大作用（見圖10）。

圖10 PV神經(jīng)元對MSN調節(jié)模式圖

3.2 一次力竭和7 天重復力竭對DLS 區(qū)PV 神經(jīng)元及NMDAR2B表達的影響

NMDA受體的變化可以直接影響神經(jīng)元電活動的變化。NR2B 亞型是NMDA 受體重要的功能亞型。谷氨酸激活NMDA受體的NR2B亞型，可引起Ca2+的內流和K+外流，持續(xù)的突觸傳遞活動可以通過激活NMDA受體，進而通過Ca2+的信使途徑使得AMPA 受體磷酸化，導致AMPA受體通透性增加，甚至使突觸后胞漿內的AMPA 受體轉運到突觸后膜上，從而導致突觸后膜對谷氨酸的敏感性增加，引起突觸可塑性改變。PV神經(jīng)元為與鈣結合的神經(jīng)元，它的激活與鈣離子的變化也有關。NMDAR2B 的激活可引起對鈣離子的通透增加[24]，并且NMDA 受體對PV 神經(jīng)元的γ振蕩起重要作用[25]。本研究中一次力竭運動后紋狀體背外側NMDAR2B 在一次力竭運動后有明顯表達，提示來自皮層的谷氨酸的興奮性投射更加敏感，重復力竭運動后NMDAR2B表達明顯，提示運動疲勞后紋狀體背外側對來自皮層的谷氨酸的興奮性投射更加敏感，更容易受到興奮性毒作用和氧化應激的損害[26]。研究發(fā)現(xiàn)紋狀體NMDAR2B參與了靈活性行為的調節(jié)[27]，前期研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠前額葉皮層NMDAR2B 的表達與大鼠的運動距離呈負相關關系[28]。重復力竭運動后PV 陽性神經(jīng)元在紋狀體背外側有較為明顯的表達，這也進一步證實，重復力竭運動后紋狀體背外側PV陽性神經(jīng)元調節(jié)作用增強。而對局部場電位分析發(fā)現(xiàn)，一次和重復力竭運動后γ頻段均出現(xiàn)了增加，這與PV 神經(jīng)元在紋狀體背外側的表達相一致，腦內高強度的γ波參與了興奮性和抑制性神經(jīng)元之間相互反饋。PV 神經(jīng)元活性的調節(jié)受到來自谷氨酸能興奮性的調節(jié)，并且研究發(fā)現(xiàn)阻斷NMDA 受體可明顯的破壞γ波振蕩的產(chǎn)生，NMDA 受體對PV 神經(jīng)元的興奮性起很重要的調節(jié)作用[29]。NMDAR2B 參與了中間神經(jīng)元興奮性以及神經(jīng)環(huán)路功能的調節(jié)，并且NMDAR2B抑制劑可以影響γ振蕩的產(chǎn)生[30]。由此我們推測在重復力竭運動中紋狀體PV神經(jīng)元可能通過NMDAR2B對神經(jīng)環(huán)路的前饋及反饋抑制調節(jié)起重要作用。重復力竭運動后紋狀體背外側PV 神經(jīng)元呈顯著激活狀態(tài)，重復力竭運動后PV 神經(jīng)元在紋狀體背外側的高表達提示PV 神經(jīng)元對MSN的調節(jié)作用出現(xiàn)增強，從而在一定程度上降低谷氨酸對MSN的興奮性毒作用和氧化損傷。

由以上可以看出隨著訓練的時間的延長，疲勞程度加深，紋狀體背外側PV神經(jīng)元通過前饋抑制對MSN神經(jīng)元的調節(jié)作用增強。PV 神經(jīng)元主要是接受來自初級運動皮層的投射，在感覺運動的整合中起主要作用，這提示紋狀體背外側的感覺運動的整合有一定增加。綜上可以看出長時間訓練引起的疲勞可以使紋狀體背外側顯著激活，且NMDAR2B 對紋狀體背外側神經(jīng)元的激活起了介導作用。

4 總結

一次力竭運動后紋狀體背外側神經(jīng)元電活動未出現(xiàn)顯著性改變，7天的力竭性跑臺訓練引起了紋狀體背外側MSN 神經(jīng)元放電頻率明顯增加，局部場電位也出現(xiàn)了γ頻段功率譜密度的增強，PV 神經(jīng)元也出現(xiàn)明顯表達，這提示7 天的力竭性跑臺訓練引起了紋狀體背外側被明顯激活，對軀體感覺運動調節(jié)作用加強。本研究還發(fā)現(xiàn)NMDAR2B 有明顯表達且與PV 神經(jīng)元共表達，提示NMDAR2B 介導了紋狀體背外側PV 神經(jīng)元對MSN的興奮性調控。重復力竭運動引起的疲勞的產(chǎn)生與一次性運動疲勞的產(chǎn)生在中樞調節(jié)中有所不同，紋狀體背外側在重復力竭運動疲勞的中樞調節(jié)中的作用增強。