紅肉火龍果成熟莖的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及蔗糖代謝相關(guān)基因分離

鄭乾明，王小柯，馬玉華

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)科學(xué)研究所， 貴陽(yáng) 550006)

【研究意義】紅肉火龍果(Hylocereuspolyrhizus)是仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)多年生果樹(shù)作物，其葉退化為短刺，肉質(zhì)莖是主要的源器官。植株具有耐旱的生理特點(diǎn)，已成為貴州喀斯特石漠化地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)作物。紅肉火龍果果實(shí)含有豐富的可溶性糖、有機(jī)酸、維生素C、類黃酮和甜菜苷色素等風(fēng)味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-6]。果實(shí)中積累的風(fēng)味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分均來(lái)自于源器官的光合作用合成，蔗糖作為最主要的光合產(chǎn)物，經(jīng)維管束韌皮部運(yùn)輸至果實(shí)中參與代謝和貯存[7]。研究紅肉火龍果植株源器官(成熟莖)的轉(zhuǎn)錄組模式，分離光合作用等重要代謝途徑的關(guān)鍵基因，有利于闡明紅肉火龍果植株蔗糖合成的分子機(jī)制，對(duì)改良果實(shí)品質(zhì)，提高果實(shí)商品價(jià)值具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】紅肉火龍果是近年發(fā)展的新興水果，目前尚無(wú)基因組序列發(fā)布。當(dāng)前僅有基于Illumina平臺(tái)的第二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)其果實(shí)或根開(kāi)展系列測(cè)序和研究。例如，對(duì)紅肉和白肉火龍果果實(shí)發(fā)育多個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和比較，獲得若干參與甜菜苷色素合成的基因[8]，以及1個(gè)潛在的候選MYB轉(zhuǎn)錄因子[9]；對(duì)紅肉火龍果根系在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，獲得一系列上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因[10]。針對(duì)紅肉火龍果成熟果實(shí)與成熟莖的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，獲得79 658個(gè)Unigene，平均長(zhǎng)度為690 bp，約44.11%的轉(zhuǎn)錄本在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋[11]。同時(shí)，還獲得若干在成熟莖中表達(dá)，參與蔗糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的Unigene，但均未獲得基因全長(zhǎng)。因此，目前針對(duì)紅肉火龍果的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)較少，僅有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均由Illumina平臺(tái)的第二代測(cè)序獲得，其序列長(zhǎng)度較短，難以獲得目標(biāo)基因的全長(zhǎng)序列。近年來(lái)，由Pacific Biosciences公司開(kāi)發(fā)的PacBio測(cè)序是應(yīng)用較為廣泛的第3代測(cè)序平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，具有長(zhǎng)讀長(zhǎng)，無(wú)PCR擴(kuò)增，無(wú)需拼接，較高的隨機(jī)錯(cuò)誤率等特點(diǎn)[12]。目前全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序主要用于構(gòu)建全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)、轉(zhuǎn)錄本可變剪接分析、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究和完善基因注釋等[13]。【本研究切入點(diǎn)】提取紅肉火龍果成熟莖的總RNA，進(jìn)行基于PacBio Sequel平臺(tái)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】獲得紅肉火龍果成熟莖的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列，根據(jù)功能注釋和分類結(jié)果篩選參與蔗糖合成和降解等重要代謝途徑的候選功能基因，為后續(xù)開(kāi)展基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2018年11—12月，在貴州省鎮(zhèn)寧縣的火龍果種植園，選擇紅肉火龍果品種“紫紅龍”。在成年結(jié)果植株上選取生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的健壯成熟莖，剪下后立即置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。用無(wú)水乙醇擦凈后晾干，然后切取莖組織液氮中速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 核酸提取

利用Trizol試劑提取成熟莖組織的總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳、紫外光分光光度計(jì)和Bioanalyszer 2100(Agilent Technologies)檢測(cè)其質(zhì)量與濃度。

1.3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析委托安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司開(kāi)展。首先富集含有Poly A的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后PCR擴(kuò)增合成cDNA。構(gòu)建SMRTbell文庫(kù)并進(jìn)行損傷修復(fù)和末端修復(fù)，片段兩端連接測(cè)序接頭，形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的插入片段測(cè)序文庫(kù)。利用PacBio Sequel(Pacific Biosciences)測(cè)序儀測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)。

原始數(shù)據(jù)過(guò)濾獲得Polymerase reads，去除接頭序列后獲得Subreads并進(jìn)行質(zhì)控，獲得高質(zhì)量的插入片段序列。對(duì)來(lái)源于同一條Polymerase read的Subreads片段進(jìn)行合并和糾錯(cuò)，獲得環(huán)狀一致性序列(Circular Consensus Sequencing，CCS)。分析CCS序列，根據(jù)是否含有完整接頭和poly A序列篩選獲得全長(zhǎng)非嵌合體(Full-length no chimera，F(xiàn)LNC)序列。使用ICA(isoform-level clustering algorithm)算法，對(duì)FLNC進(jìn)行相同結(jié)構(gòu)間的自我聚類和糾錯(cuò)，產(chǎn)生去冗余Consensus序列。將未測(cè)完整的插入片段序列比對(duì)到Consensus序列進(jìn)行糾錯(cuò)，獲得準(zhǔn)確度大于99%的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本。使用Blastn和Blastx程序在NCBI非冗余核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索注釋。

1.4 序列分析

利用Trans Decoder Release v3.0.1鑒定轉(zhuǎn)錄本序列中的編碼序列(Coding sequence，CDS)。對(duì)獲得的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本序列，在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(Nucleotide Sequence Database，NT)、NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Non-Redundant Protein Database，NR)、蛋白質(zhì)真核直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(Eukaryotic Orthologous Groups，KOG)、基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology，GO)、蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Families Database，Pfam)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋。通過(guò)與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(Plant Transcription Factor Database，Plant TFDB)比對(duì)查找轉(zhuǎn)錄因子。序列一致性計(jì)算使用DNAStar軟件的MegAlign程序，序列拼接使用BioEdit軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

從表1看出，通過(guò)PacBio Sequel測(cè)序，獲得聚合酶Reads數(shù)量740 069條，堿基數(shù)量為15.8 Gb。聚合酶Reads平均長(zhǎng)度為21 366 bp，N50長(zhǎng)度為42 865 bp。過(guò)濾后獲得插入片段(Subreads)數(shù)量共8 483 057條，堿基數(shù)據(jù)量為15.1 Gb。其平均長(zhǎng)度為1775 bp，N50長(zhǎng)度為2200 bp。將來(lái)源于同一環(huán)狀分子的Subreads聚類，獲得環(huán)狀一致序列(CCS)序列共計(jì)481 124條，其堿基數(shù)據(jù)量為1.1 Gb。CCS平均長(zhǎng)度為2378 bp，N50長(zhǎng)度為2623 bp，平均測(cè)序次數(shù)為13.87次。

表1 紅肉火龍果成熟莖的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

進(jìn)一步篩選獲得全長(zhǎng)非嵌合體(FLNC)數(shù)量為333 226條，堿基數(shù)據(jù)量為0.7 Gb，平均長(zhǎng)度為2071 bp，N50長(zhǎng)度為2250 bp。將來(lái)源于同一轉(zhuǎn)錄本的FLNC聚類獲得Consensus序列，并將非全長(zhǎng)序列對(duì)Consensus序列校正和去冗余，獲得轉(zhuǎn)錄本30 973條。大部分轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分布于1.8 kb，平均長(zhǎng)度為1846 bp(圖1)。其中準(zhǔn)確度大于99%的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為30 313條，平均長(zhǎng)度為1829 bp。

圖1 紅肉火龍果成熟莖的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組獲得的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分布

2.2 CDS預(yù)測(cè)

從表2可知，對(duì)30 313條高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行CDS預(yù)測(cè)，獲得CDS數(shù)量為40 255條。其長(zhǎng)度最短為297 bp，最長(zhǎng)為5202 bp，平均長(zhǎng)度為926 bp，N50長(zhǎng)度為1179 bp。統(tǒng)計(jì)其長(zhǎng)度分布表明，CDS長(zhǎng)度在200～600 bp的數(shù)量為14 372條，占35.70%；長(zhǎng)度在800～1200 bp的數(shù)量為15 253條，占37.89%；長(zhǎng)度為1200～2000 bp的數(shù)量有8456條，占21.01%；長(zhǎng)度大于2000 bp 的數(shù)量為2172條，占5.40%。

表2 預(yù)測(cè)CDS的數(shù)量或長(zhǎng)度分布

2.3 序列注釋

從表3看出，將30 313條高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列注釋，共計(jì)有13 939條轉(zhuǎn)錄本被注釋，占45.98%。在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(NR)中注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為13 789條，占所有轉(zhuǎn)錄本的45.49%。在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(NT)中注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為10 777條，占所有轉(zhuǎn)錄本的35.55%。在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為13 136條，占所有轉(zhuǎn)錄本的43.33%。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為7582條，占所有轉(zhuǎn)錄本的25.01%。

從表4可知，統(tǒng)計(jì)注釋到的相關(guān)物種上的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量依次為甜菜(Betavulgaris)、菠菜(Spinaciaoleracea)、葡萄(Vitisvinifera)、克里曼丁橘(Citrusclementina)、麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)和蓮(Nelumbonucifera)，其數(shù)量分別為9371條(50.95%)、4579條(24.90%)、436條(2.37%)、258條(1.40%)、205條(1.11%)和204條(1.11%)。

在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中共有13 059條轉(zhuǎn)錄本被注釋到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能等三類，占所有轉(zhuǎn)錄本的43.08%(表3)。生物學(xué)過(guò)程中注釋到24個(gè)類別，其中含有轉(zhuǎn)錄本最多的三類依次為細(xì)胞的過(guò)程(66.41%)、代謝過(guò)程(60.94%)和單一的生物過(guò)程(39.06%)。細(xì)胞成分中注釋到22個(gè)類別，其中含有轉(zhuǎn)錄本最多的三類依次為細(xì)胞組分(82.03%)、細(xì)胞器(54.69%)和細(xì)胞器組分(35.94%)。分子功能中注釋到19個(gè)類別，其中含有轉(zhuǎn)錄本最多的三類依次為結(jié)合(64.06%)、催化活性(51.56%)和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(6.25%)。

在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為10 018條，占所有轉(zhuǎn)錄本的33.05%(表3)。從圖2可知，注釋為僅通用功能預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄本最多，數(shù)量為1701條，占16.98%；其次為翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和伴侶蛋白，為1203條，占12.01%；其他較多的分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(901條，8.99%)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(656條，6.55%)，功能未知(580條，5.79%)，碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝(543條，5.42%)，轉(zhuǎn)錄(530條，5.29%)，RNA加工和修飾(526條，5.25%)，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸(518條，5.17%)。

表3 紅肉火龍果成熟莖全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄本注釋

2.4 轉(zhuǎn)錄因子家族預(yù)測(cè)

與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(Plant Transcription Factor Database，PlantTFDB)比對(duì)，共計(jì)有11 628條轉(zhuǎn)錄本注釋為轉(zhuǎn)錄因子。統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)錄因子家族表明，共含有56個(gè)家族，其含有轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較多的家族如表5所示。MYB_related家族的轉(zhuǎn)錄本最多，數(shù)量為1162條，占10%；其次為bHLH家族(basic/helix-loop-helix)，轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為1066條，占9.17%。NAC(NAM、ATAF和CUC)家族、WRKY家族和FAR1家族含有的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量依次為788、687和669條，分別占所有轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量的6.78%、5.91%和5.75%。

表4 NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的物種數(shù)量

A：RNA加工和修飾；B：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；C：能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；D：細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂和染色體分割；E：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；F：核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；G：碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝；H：輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；I：脂質(zhì)運(yùn)輸和新陳代謝；J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制、重組和修復(fù)；M；細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；N：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和伴侶蛋白；P：無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q：次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；R：僅通用功能預(yù)測(cè)；S：功能未知；T：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U：細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；V：防御機(jī)制；W：細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；Y：核結(jié)構(gòu)；Z：碳骨架A: RNA processing and modification; B: Chromatin structure and dynamics; C: Energy production and conversion; D: Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E: Amino acid transport and metabolism; F: Nucleotide transport and metabolism; G: Carbohydrate transport and metabolism; H: Coenzyme transport and metabolism; I: Lipid transport and metabolism; J: Translation, ribosomal structure and biogenesis; K: Transcription; L: Replication, recombination and repair; M: Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N: Cell motility; O: Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P: Inorganic ion transport and metabolism; Q: Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R: General function prediction only; S: Function unknown; T: Signal transduction mechanisms; U: Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V: Defense mechanisms; W: Extracellular structures; Y: Nuclear structure; Z: Cytoskeleton圖2 轉(zhuǎn)錄本的KOG注釋 Fig.2 KOG annotations of transcripts

表5 預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子家族和數(shù)量

2.5 蔗糖代謝相關(guān)基因克隆

根據(jù)紅肉火龍果成熟莖的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序注釋結(jié)果，篩選蔗糖代謝相關(guān)的基因(表6)。獲得一條與菠菜蔗糖磷酸合酶(sucrose-phosphate synthase，SPS)具有81.03%相似性的轉(zhuǎn)錄本Transcript 920，其長(zhǎng)度為3637 bp，含有3183 bp的CDS，編碼2060個(gè)氨基酸。獲得一條與紅莧菜蔗糖合酶(sucrose synthase，SUS)具有93.90%相似性的轉(zhuǎn)錄本Transcript 3494，其長(zhǎng)度為2719 bp，含有2 412 bp的CDS，編碼803個(gè)氨基酸。獲得一條與藜麥液泡酸性轉(zhuǎn)化酶(acid beta-fructofuranosidase，AINV)具有72.61%相似性的轉(zhuǎn)錄本Transcript 7574，其長(zhǎng)度為2229 bp，含有1935 bp的CDS，編碼644個(gè)氨基酸。

表6 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的蔗糖代謝相關(guān)基因及序列相似性

此前針對(duì)紅肉火龍果成熟莖和成熟果實(shí)果肉，利用基于Illumina平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行分析，獲得若干在莖中高表達(dá)的蔗糖代謝相關(guān)Unigene[11]。SPS相關(guān)的c49878_g1長(zhǎng)度為464 bp，與Transcript 920序列相似性為100.00%，其在成熟莖中的表達(dá)量約為成熟果實(shí)的3倍(表7)。SUS相關(guān)的c21997_g1長(zhǎng)度為614 bp，與Transcript 3494序列相似性為99.16%，其在成熟莖中的表達(dá)量約為成熟果實(shí)的45倍。AINV相關(guān)的c34087_g1和c24912_g1，長(zhǎng)度分別為665和320 bp。與Transcript 7574序列相似性分別為99.06%和99.08%，在成熟莖中的表達(dá)量分別約為成熟果實(shí)的27和72倍。

表7 蔗糖代謝基因與此前Illumina測(cè)序結(jié)果比較

3 討 論

對(duì)缺乏基因組序列的非模式作物開(kāi)展功能基因組學(xué)研究，其前提是獲得基因全長(zhǎng)序列。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠快速獲得大量基因的轉(zhuǎn)錄本序列，已在非模式作物中廣泛應(yīng)用。此前普遍利用基于Illumina平臺(tái)的第二代高通量測(cè)序，其讀長(zhǎng)較短，極難獲得基因全長(zhǎng)序列。基于PacBio Sequel平臺(tái)的第三代高通量測(cè)序具有顯著的長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，可用于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[14-15]。第三代高通量測(cè)序的主要缺點(diǎn)是錯(cuò)誤率較高，表現(xiàn)為插入、缺失或錯(cuò)配，均為隨機(jī)錯(cuò)誤，可進(jìn)行校正[16]。通過(guò)Subread聚類的自我校正，獲得的CCS可作為轉(zhuǎn)錄本的參考序列[17]。

此前利用基于Illumina平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)t肉火龍果成熟莖和成熟果實(shí)果肉進(jìn)行分析，獲得Unigene平均長(zhǎng)度為690 bp，長(zhǎng)度大于1000 bp的Unigene僅占18.66%[11]。本研究獲得30 313條高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度為1829 bp，顯著長(zhǎng)于Illumina測(cè)序。同時(shí)，長(zhǎng)度大于1000 bp的轉(zhuǎn)錄本占比為88.96%，大于2000 bp占比為41.50%。由此可見(jiàn)，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于Illumina測(cè)序，有利于獲得基因的全長(zhǎng)序列。

獲得紅肉火龍果成熟莖的30 313條高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本，僅有45.98%的序列在常見(jiàn)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋，注釋到的物種主要為藜科(Chenopodiaceae)的甜菜和菠菜。與近期一些非模式作物的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相比，其轉(zhuǎn)錄本的注釋率明顯偏低。例如，對(duì)禾本科(Gramineae)薏苡屬(Coix)薏苡(C.lacryma-jobiLinn.)苗期葉片開(kāi)展全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄本平均長(zhǎng)度為2318 bp，約91.50%轉(zhuǎn)錄本被注釋，物種為高粱、玉米、谷子、水稻和甘蔗等禾本科作物[18]。對(duì)薔薇科(Rosaceae)栒子屬(Cotoneaster)作物山東栒子(C.schantungensis)葉片、花和成熟果實(shí)進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，約98.86%轉(zhuǎn)錄本被注釋，物種為蘋(píng)果、白梨、桃、梅、野草莓和沙梨等薔薇科作物[19]。對(duì)?？?Moraceae)木波羅屬(Artocarpus)作物波羅蜜(A.heterophyllus)莖和葉進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得轉(zhuǎn)錄本平均長(zhǎng)度為1684 bp，約97.56%轉(zhuǎn)錄本被注釋，物種為同屬于?？频拇ㄉ?Morusnotabilis)[20]。上述作物在同一科內(nèi)均有其他作物的基因組序列發(fā)布，在其親緣關(guān)系較近的情況下注釋成功率極高。紅肉火龍果屬石竹目(Caryophyllales)仙人掌科，該科尚未有物種的基因組序列發(fā)布。目前僅石竹目藜科的甜菜和菠菜基因組序列發(fā)布，因而相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的注釋率較低。在未來(lái)仙人掌科作物基因組序列發(fā)布后，有必要對(duì)紅肉火龍果成熟莖的轉(zhuǎn)錄本序列重新注釋。

火龍果等仙人掌科作物的葉片退化為刺，其肉質(zhì)莖是主要的光合器官。研究成熟莖的轉(zhuǎn)錄組模式，分離光合作用代謝途徑的相關(guān)基因全長(zhǎng)，有助于研究蔗糖的合成、貯藏和轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而調(diào)控果實(shí)品質(zhì)形成。此前利用Illumina平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)t肉火龍果成熟莖和成熟果實(shí)果肉進(jìn)行分析，僅獲得若干參與成熟莖中蔗糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因部分序列[11]。本研究獲得蔗糖磷酸合酶SPS、蔗糖合酶SUS、液泡酸性轉(zhuǎn)化酶AINV等均參與蔗糖合成和降解等代謝[21]。與Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果綜合分析，其較短的Unigene序列與其相應(yīng)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本具有99%以上的核苷酸序列相似性，說(shuō)明來(lái)源于同一基因。這些較短Unigene的數(shù)字表達(dá)模式表明其主要在成熟莖中表達(dá)，推測(cè)其參與源器官中蔗糖代謝。下一步可根據(jù)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的基因全長(zhǎng)克隆該基因，開(kāi)展后續(xù)的功能驗(yàn)證等分析。

4 結(jié) 論

研究利用基于Pacbio Sequel平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)t肉火龍果成熟莖進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，獲得30 313個(gè)高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本，其長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于Illumina測(cè)序結(jié)果。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本，能結(jié)合Illumina測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄本序列和基因數(shù)字表達(dá)結(jié)果，快速篩選若干候選基因的全長(zhǎng)序列，為開(kāi)展基因功能研究提供有力基礎(chǔ)。