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    一種基于全自動多重裂解濾膜法的研究應(yīng)用

    2022-04-24 09:58:46王傳海李湘秦王偉妮尹路羅深恒
    警察技術(shù) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:精子細(xì)胞檢材濾膜

    王傳海 李湘秦 王偉妮 尹路 羅深恒

    1. 廣東省深圳市公安局 2. 廣州高盛智造科技有限公司

    引言

    隨著司法體系的不斷完善及對違法行為打擊力度的加強(qiáng),我國性侵類案件占比呈逐年下降趨勢,但每年仍有超過10000宗的案件量產(chǎn)生。在性侵類案件中,混合斑是最常見同時也是極為重要的物證類型。經(jīng)過不斷發(fā)展,混合斑中精子細(xì)胞DNA的分離提取技術(shù)趨于成熟[1]。目前主流的分離提純方法有差異裂解法和濾膜法,此外還有免疫磁珠法[2,3]、細(xì)胞分選法[4,5]等技術(shù)。其中,差異裂解法主要根據(jù)精子細(xì)胞膜及細(xì)胞核表面含硫醇蛋白的特殊性,使用不同成分的裂解液進(jìn)行兩步裂解,去除女性成分后進(jìn)行精子細(xì)胞的回收及提取[6];而濾膜法則是根據(jù)精子細(xì)胞與其他細(xì)胞尺寸上的差異,使用特定孔徑的消化纖維素或尼龍濾膜將精子細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。前者耗時長,常需要過夜處理樣本,且回收率低。濾膜法成本低、耗時短,對單細(xì)胞狀態(tài)的樣本效果優(yōu)異,但對于精子細(xì)胞出現(xiàn)聚集的樣本則效果不佳。為了縮短混合斑樣品的處理時間,并使其更加符合法醫(yī)物證領(lǐng)域自動化趨勢,結(jié)合差異裂解法及濾膜法,開發(fā)出全自動多重裂解濾膜法。該方法首先在濾膜柱中進(jìn)行兩次裂解,充分去除女性成分,精子細(xì)胞則被截留在經(jīng)優(yōu)化篩選的專用濾膜上,經(jīng)深度裂解后釋放DNA,然后通過磁珠法進(jìn)行提取純化。此外,該方法在微量DNA自動提取工作站上實現(xiàn)了全自動化工藝并得到了實際應(yīng)用驗證,可在180min內(nèi)同時完成24個混合斑樣本的分離提純。

    一、材料與方法

    (一)材料

    收集12例來自實驗室日常受理的性侵類案件檢材,類型包括安全套、陰道拭子以及其它相關(guān)檢材等,進(jìn)行方法的開發(fā)及優(yōu)化測試。統(tǒng)計實際應(yīng)用案件檢材223例,樣本進(jìn)行PSA檢測,選取陽性檢材進(jìn)行檢出率統(tǒng)計;樣本類型包括安全套、陰道拭子、紙巾、內(nèi)褲、床單及其他紡織品等。

    (二)樣品分離提純

    1. 手工分離提純方法

    (1)取適量檢材,用PSA膠體金試劑條對樣本進(jìn)行預(yù)實驗檢測;

    (2)將適量檢材放置于上層管內(nèi),先用裂解液A于56℃震蕩孵育15min,離心后收集液體,可用于女性成分STR分析;上層管中加入清洗液清洗1次,離心后加入裂解液B于56℃震蕩孵育15min,離心后再清洗一次,此時精子細(xì)胞仍保留在上層管內(nèi)(如圖1A所示);

    (3)上層管中加入裂解液C,56℃震蕩孵育30min,離心得含精細(xì)胞DNA的裂解產(chǎn)物;

    (4)裂解產(chǎn)物依據(jù)TraceMag微量DNA磁珠純化試劑盒(型號:TM-MU-K50)使用說明書進(jìn)行提取純化。

    2. 自動化分離提純方法

    多重裂解濾膜法的自動化工藝在U-PURE 48微量DNA自動提取工作站基礎(chǔ)上進(jìn)行改造優(yōu)化,最終整合升級為全自動精斑分離系統(tǒng),該系統(tǒng)可兼容混合斑樣本的分離提?。?4通量)及普通案件檢材的提取純化(48通量)。進(jìn)行混合斑分離提純時,將檢材放置于專用裂解板內(nèi),按指示(如圖1B所示)擺放好配套試劑耗材(型號:TM-SPK24)后,選擇相應(yīng)程序,即可自動完成混合斑的分離提純操作。

    (三)STR擴(kuò)增及電泳分析

    STR擴(kuò)增試劑盒為PowerPlex 21 System試劑盒,使用ProflexTMPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,DNA模板為luL,擴(kuò)增體系與擴(kuò)增參數(shù)參照PowerPlex 21 System試劑盒操作手冊。擴(kuò)增產(chǎn)物使用3500XL測序儀進(jìn)行電泳分析,最終使用GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行統(tǒng)計,獲得樣品STR圖譜。

    二、結(jié)果

    (一)方法開發(fā)

    通過顯微鏡觀察陰道上皮細(xì)胞消化程度,本研究發(fā)現(xiàn)在56℃條件下,采用裂解并清洗2次,每次15min的裂解方式可最大程度消化陰道上皮細(xì)胞或僅殘留少量無核的完全角化的陰道上皮細(xì)胞。同時裂解液中還加入了DNA消化酶,可以進(jìn)一步去除女性成分,提高分離效率。而截留精細(xì)胞的濾膜孔徑大小,則影響混合斑提取的靈敏度。本研究采用模擬混合精斑樣本(正常人一次射精的精子濃度約1500萬/mL,稀釋至100個/μl,取約500個精子細(xì)胞與500μl TNS混合后56℃處理30min,加入到離心濾管4500rpm離心5min,再加入500μl TNE清洗 3次后正常裂解),進(jìn)行熒光定量PCR 后獲得孔徑分別為10μm、5μm、2μm以及1μm的濾膜對精子的截留率。經(jīng)測試,當(dāng)選取孔徑為2μm濾膜的離心套管時,可獲得對精細(xì)胞的最大截留效果,平均可達(dá)93.26%(見表1)。當(dāng)濾膜孔徑為1μm時,雖然對精細(xì)胞的截留率與2μm濾膜接近(見表1),但因孔徑過小容易導(dǎo)致堵塞,影響分離提純。因此綜合考慮,最終選取孔徑為2μ m的濾膜,滿足有效截留精細(xì)胞要求的同時還可兼容各種不同類型的案件檢材,防止雜質(zhì)堵塞或漏入下層管。

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    (二)方法驗證

    選取保存良好的12例PSA檢測呈陽性且已知STR檢測結(jié)果的性侵類案件檢材,類型包括安全套、陰道拭子、紙巾等,分別用常規(guī)差異裂解法及多重裂解濾膜法進(jìn)行手工提取,通過比對測試結(jié)果對新方法進(jìn)行驗證。如表2及圖2所示,對于不同類型案件檢材,多重裂解濾膜法普遍可以得到更多的位點以及更高的峰值,各位點最高峰值平均高于常規(guī)裂解法30%~50%左右。如圖3所示,得益于多重裂解濾膜法兼顧靈敏度及提純效果的特殊體系,各STR位點峰值之間的均衡性更優(yōu)于常規(guī)差異裂解法。尤其對于含精子量較少或陳舊的樣本,多重裂解濾膜法效果更佳(圖2 樣本2/8/9;圖3a/c/e)。

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    (三)應(yīng)用統(tǒng)計

    全自動多重裂解濾膜法工藝建立后,在若干公安單位建立了應(yīng)用示范點。截至2021年4月,總計檢測了223份性侵案件檢材,全部進(jìn)行PSA膠體金檢測,并選擇陽性樣本進(jìn)行統(tǒng)計,總共得到98份陽性檢材(詳見表3)。其中,83份樣本檢出STR位點數(shù)(丟失位點數(shù)≤3),平均檢出率高達(dá)84.7%。對樣本進(jìn)行分類后,統(tǒng)計出該方法對陰道拭子樣本檢出率高達(dá)92.6%,斑跡擦拭物樣本檢出率為72.7%,避孕套樣本的檢出率為85%,內(nèi)褲樣本檢出率為100%,包括紙巾、床單、衣物等在內(nèi)的其它樣本檢出率平均可達(dá)83.1%。結(jié)果表明,全自動多重裂解濾膜法工藝適用于多種類型的性侵類案件檢材,包括常見的陰道拭子、避孕套、內(nèi)褲及其它織物等,普遍具有較高的檢出率。

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    三、討論

    混合斑的處理方法不斷得到改進(jìn)和完善[7,8],但相比其他技術(shù),差異裂解法仍是目前最常用的混合斑處理方法。該方法耗時極長效率低下,雖經(jīng)韓海軍[9]、 張子陽[10]等的改良優(yōu)化后,第一步裂解時間仍超過2小時。對于微量或陳舊的樣本,長時間的裂解可能造成精子細(xì)胞DNA的損失或降解。相比之下,濾膜法耗時少且回收率較高,有利于快速辦案。但在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn),混合斑檢材中的細(xì)胞常因死亡或外界環(huán)境的影響而發(fā)生聚團(tuán),導(dǎo)致濾膜法無法有效對精細(xì)胞進(jìn)行分離,降低了檢出率。在此基礎(chǔ)上,多重裂解濾膜法同時兼具了兩者的優(yōu)點。經(jīng)驗證,在56℃條件下,在專用上層管中對混合斑樣本進(jìn)行多次(2次)短時(15min)裂解及清洗操作,即可有效去除女性陰道上皮細(xì)胞。同時,精子細(xì)胞則被孔徑2μm的消化纖維素膜截留在上層管內(nèi),等待最終的深度裂解及DNA提純。此外,相比其它具有自動化潛質(zhì)的混合斑分離技術(shù)[11,12,13],多重裂解濾膜法更易于實現(xiàn)自動化操作。

    目前,自動化多重裂解濾膜法已在多個公安單位得到應(yīng)用。結(jié)果顯示,該方法對于常見性侵類案件檢材的平均檢出率高達(dá)84.7%,對于常見的檢材,如陰道拭子、內(nèi)褲、避孕套等具有優(yōu)異的效果。對結(jié)果進(jìn)行整理時,優(yōu)先選取了PSA膠體金測試呈陽性的樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析。對于PSA陽性但不能檢出男性分型的樣品,推測有如下原因:(1)采集樣本時帶入了前列腺抗原但未剪取或擦拭到精子細(xì)胞;(2)樣本中精子數(shù)量稀少,有免疫反應(yīng)但無法有效提取精子DNA,例如先天性少精或無精的男性;(3)PSA呈弱陽性結(jié)果可能為假陽性[14]。

    另外,對部分PSA陰性樣本進(jìn)行分離提純時,也會有一定比例出現(xiàn)完整男性分型。經(jīng)分析,推測有如下可能性:(1)樣本暴露時間較長,前列腺抗原受條件影響降解,但精子細(xì)胞仍有留存;(2)檢測時未剪取或擦拭到前列腺抗原,但分離提純時有精細(xì)胞存在;(3)因樣本中抗原量少導(dǎo)致的PSA檢測假陰性[15]。當(dāng)樣本中存在大量女性上皮細(xì)胞甚至微小組織塊,或者細(xì)胞因死亡等因素形成大量聚團(tuán)時,仍有可能出現(xiàn)因消化不充分導(dǎo)致的混合分型結(jié)果,對于此種情況,可先根據(jù)鏡檢結(jié)果進(jìn)行評估,對提取純化流程進(jìn)行微調(diào),比如增加裂解次數(shù)或時間等,以達(dá)到最優(yōu)檢測結(jié)果。

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