一種基于全自動多重裂解濾膜法的研究應(yīng)用

王傳海 李湘秦 王偉妮 尹路 羅深恒

1. 廣東省深圳市公安局 2. 廣州高盛智造科技有限公司

引言

隨著司法體系的不斷完善及對違法行為打擊力度的加強(qiáng)，我國性侵類案件占比呈逐年下降趨勢，但每年仍有超過10000宗的案件量產(chǎn)生。在性侵類案件中，混合斑是最常見同時也是極為重要的物證類型。經(jīng)過不斷發(fā)展，混合斑中精子細(xì)胞DNA的分離提取技術(shù)趨于成熟[1]。目前主流的分離提純方法有差異裂解法和濾膜法，此外還有免疫磁珠法[2,3]、細(xì)胞分選法[4,5]等技術(shù)。其中，差異裂解法主要根據(jù)精子細(xì)胞膜及細(xì)胞核表面含硫醇蛋白的特殊性，使用不同成分的裂解液進(jìn)行兩步裂解，去除女性成分后進(jìn)行精子細(xì)胞的回收及提取[6]；而濾膜法則是根據(jù)精子細(xì)胞與其他細(xì)胞尺寸上的差異，使用特定孔徑的消化纖維素或尼龍濾膜將精子細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。前者耗時長，常需要過夜處理樣本，且回收率低。濾膜法成本低、耗時短，對單細(xì)胞狀態(tài)的樣本效果優(yōu)異，但對于精子細(xì)胞出現(xiàn)聚集的樣本則效果不佳。為了縮短混合斑樣品的處理時間，并使其更加符合法醫(yī)物證領(lǐng)域自動化趨勢，結(jié)合差異裂解法及濾膜法，開發(fā)出全自動多重裂解濾膜法。該方法首先在濾膜柱中進(jìn)行兩次裂解，充分去除女性成分，精子細(xì)胞則被截留在經(jīng)優(yōu)化篩選的專用濾膜上，經(jīng)深度裂解后釋放DNA，然后通過磁珠法進(jìn)行提取純化。此外，該方法在微量DNA自動提取工作站上實現(xiàn)了全自動化工藝并得到了實際應(yīng)用驗證，可在180min內(nèi)同時完成24個混合斑樣本的分離提純。

一、材料與方法

（一）材料

收集12例來自實驗室日常受理的性侵類案件檢材，類型包括安全套、陰道拭子以及其它相關(guān)檢材等，進(jìn)行方法的開發(fā)及優(yōu)化測試。統(tǒng)計實際應(yīng)用案件檢材223例，樣本進(jìn)行PSA檢測，選取陽性檢材進(jìn)行檢出率統(tǒng)計；樣本類型包括安全套、陰道拭子、紙巾、內(nèi)褲、床單及其他紡織品等。

（二）樣品分離提純

1. 手工分離提純方法

（1）取適量檢材，用PSA膠體金試劑條對樣本進(jìn)行預(yù)實驗檢測；

（2）將適量檢材放置于上層管內(nèi)，先用裂解液A于56℃震蕩孵育15min，離心后收集液體，可用于女性成分STR分析；上層管中加入清洗液清洗1次，離心后加入裂解液B于56℃震蕩孵育15min，離心后再清洗一次，此時精子細(xì)胞仍保留在上層管內(nèi)（如圖1A所示）；

（3）上層管中加入裂解液C，56℃震蕩孵育30min，離心得含精細(xì)胞DNA的裂解產(chǎn)物；

（4）裂解產(chǎn)物依據(jù)TraceMag微量DNA磁珠純化試劑盒（型號：TM-MU-K50）使用說明書進(jìn)行提取純化。

2. 自動化分離提純方法

多重裂解濾膜法的自動化工藝在U-PURE 48微量DNA自動提取工作站基礎(chǔ)上進(jìn)行改造優(yōu)化，最終整合升級為全自動精斑分離系統(tǒng)，該系統(tǒng)可兼容混合斑樣本的分離提?。?4通量）及普通案件檢材的提取純化（48通量）。進(jìn)行混合斑分離提純時，將檢材放置于專用裂解板內(nèi)，按指示（如圖1B所示）擺放好配套試劑耗材（型號：TM-SPK24）后，選擇相應(yīng)程序，即可自動完成混合斑的分離提純操作。

（三）STR擴(kuò)增及電泳分析

STR擴(kuò)增試劑盒為PowerPlex 21 System試劑盒，使用ProflexTMPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，DNA模板為luL，擴(kuò)增體系與擴(kuò)增參數(shù)參照PowerPlex 21 System試劑盒操作手冊。擴(kuò)增產(chǎn)物使用3500XL測序儀進(jìn)行電泳分析，最終使用GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行統(tǒng)計，獲得樣品STR圖譜。

二、結(jié)果

（一）方法開發(fā)

通過顯微鏡觀察陰道上皮細(xì)胞消化程度，本研究發(fā)現(xiàn)在56℃條件下，采用裂解并清洗2次，每次15min的裂解方式可最大程度消化陰道上皮細(xì)胞或僅殘留少量無核的完全角化的陰道上皮細(xì)胞。同時裂解液中還加入了DNA消化酶，可以進(jìn)一步去除女性成分，提高分離效率。而截留精細(xì)胞的濾膜孔徑大小，則影響混合斑提取的靈敏度。本研究采用模擬混合精斑樣本（正常人一次射精的精子濃度約1500萬/mL，稀釋至100個/μl，取約500個精子細(xì)胞與500μl TNS混合后56℃處理30min，加入到離心濾管4500rpm離心5min，再加入500μl TNE清洗 3次后正常裂解），進(jìn)行熒光定量PCR 后獲得孔徑分別為10μm、5μm、2μm以及1μm的濾膜對精子的截留率。經(jīng)測試，當(dāng)選取孔徑為2μm濾膜的離心套管時，可獲得對精細(xì)胞的最大截留效果，平均可達(dá)93.26%（見表1）。當(dāng)濾膜孔徑為1μm時，雖然對精細(xì)胞的截留率與2μm濾膜接近（見表1），但因孔徑過小容易導(dǎo)致堵塞，影響分離提純。因此綜合考慮，最終選取孔徑為2μ m的濾膜，滿足有效截留精細(xì)胞要求的同時還可兼容各種不同類型的案件檢材，防止雜質(zhì)堵塞或漏入下層管。

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（二）方法驗證

選取保存良好的12例PSA檢測呈陽性且已知STR檢測結(jié)果的性侵類案件檢材，類型包括安全套、陰道拭子、紙巾等，分別用常規(guī)差異裂解法及多重裂解濾膜法進(jìn)行手工提取，通過比對測試結(jié)果對新方法進(jìn)行驗證。如表2及圖2所示，對于不同類型案件檢材，多重裂解濾膜法普遍可以得到更多的位點以及更高的峰值，各位點最高峰值平均高于常規(guī)裂解法30%~50%左右。如圖3所示，得益于多重裂解濾膜法兼顧靈敏度及提純效果的特殊體系，各STR位點峰值之間的均衡性更優(yōu)于常規(guī)差異裂解法。尤其對于含精子量較少或陳舊的樣本，多重裂解濾膜法效果更佳（圖2 樣本2/8/9；圖3a/c/e）。

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（三）應(yīng)用統(tǒng)計

全自動多重裂解濾膜法工藝建立后，在若干公安單位建立了應(yīng)用示范點。截至2021年4月，總計檢測了223份性侵案件檢材，全部進(jìn)行PSA膠體金檢測，并選擇陽性樣本進(jìn)行統(tǒng)計，總共得到98份陽性檢材（詳見表3）。其中，83份樣本檢出STR位點數(shù)（丟失位點數(shù)≤3），平均檢出率高達(dá)84.7%。對樣本進(jìn)行分類后，統(tǒng)計出該方法對陰道拭子樣本檢出率高達(dá)92.6%，斑跡擦拭物樣本檢出率為72.7%，避孕套樣本的檢出率為85%，內(nèi)褲樣本檢出率為100%，包括紙巾、床單、衣物等在內(nèi)的其它樣本檢出率平均可達(dá)83.1%。結(jié)果表明，全自動多重裂解濾膜法工藝適用于多種類型的性侵類案件檢材，包括常見的陰道拭子、避孕套、內(nèi)褲及其它織物等，普遍具有較高的檢出率。

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三、討論

混合斑的處理方法不斷得到改進(jìn)和完善[7,8]，但相比其他技術(shù)，差異裂解法仍是目前最常用的混合斑處理方法。該方法耗時極長效率低下，雖經(jīng)韓海軍[9]、 張子陽[10]等的改良優(yōu)化后，第一步裂解時間仍超過2小時。對于微量或陳舊的樣本，長時間的裂解可能造成精子細(xì)胞DNA的損失或降解。相比之下，濾膜法耗時少且回收率較高，有利于快速辦案。但在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，混合斑檢材中的細(xì)胞常因死亡或外界環(huán)境的影響而發(fā)生聚團(tuán)，導(dǎo)致濾膜法無法有效對精細(xì)胞進(jìn)行分離，降低了檢出率。在此基礎(chǔ)上，多重裂解濾膜法同時兼具了兩者的優(yōu)點。經(jīng)驗證，在56℃條件下，在專用上層管中對混合斑樣本進(jìn)行多次（2次）短時（15min）裂解及清洗操作，即可有效去除女性陰道上皮細(xì)胞。同時，精子細(xì)胞則被孔徑2μm的消化纖維素膜截留在上層管內(nèi)，等待最終的深度裂解及DNA提純。此外，相比其它具有自動化潛質(zhì)的混合斑分離技術(shù)[11,12,13]，多重裂解濾膜法更易于實現(xiàn)自動化操作。

目前，自動化多重裂解濾膜法已在多個公安單位得到應(yīng)用。結(jié)果顯示，該方法對于常見性侵類案件檢材的平均檢出率高達(dá)84.7%，對于常見的檢材，如陰道拭子、內(nèi)褲、避孕套等具有優(yōu)異的效果。對結(jié)果進(jìn)行整理時，優(yōu)先選取了PSA膠體金測試呈陽性的樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析。對于PSA陽性但不能檢出男性分型的樣品，推測有如下原因：（1）采集樣本時帶入了前列腺抗原但未剪取或擦拭到精子細(xì)胞；（2）樣本中精子數(shù)量稀少，有免疫反應(yīng)但無法有效提取精子DNA，例如先天性少精或無精的男性；（3）PSA呈弱陽性結(jié)果可能為假陽性[14]。

另外，對部分PSA陰性樣本進(jìn)行分離提純時，也會有一定比例出現(xiàn)完整男性分型。經(jīng)分析，推測有如下可能性：（1）樣本暴露時間較長，前列腺抗原受條件影響降解，但精子細(xì)胞仍有留存；（2）檢測時未剪取或擦拭到前列腺抗原，但分離提純時有精細(xì)胞存在；（3）因樣本中抗原量少導(dǎo)致的PSA檢測假陰性[15]。當(dāng)樣本中存在大量女性上皮細(xì)胞甚至微小組織塊，或者細(xì)胞因死亡等因素形成大量聚團(tuán)時，仍有可能出現(xiàn)因消化不充分導(dǎo)致的混合分型結(jié)果，對于此種情況，可先根據(jù)鏡檢結(jié)果進(jìn)行評估，對提取純化流程進(jìn)行微調(diào)，比如增加裂解次數(shù)或時間等，以達(dá)到最優(yōu)檢測結(jié)果。