新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)的過(guò)濾效果和殺菌性能

孫萬(wàn)啟（通信作者），李劍，李楓，趙巖峰，張春華，王芳，馬挺軍

1 山東中昊控股集團(tuán)有限公司 （山東德州 253000）； 2 北京農(nóng)學(xué)院 （北京 102206）

近年來(lái)，SARS 病毒、A/H1N1病毒、埃博拉病毒及新型冠狀病毒等病毒的傳播已奪取了成百上千萬(wàn)人的生命，引起了世界范圍內(nèi)的恐慌，急需對(duì)該類微生物進(jìn)行有效防護(hù)。負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)是控制傳染病源以及負(fù)壓隔離所必需的核心設(shè)備，其主要作用原理是通過(guò)使封閉空間內(nèi)的壓力保持負(fù)壓來(lái)阻止受污染空氣的外泄。傳統(tǒng)的負(fù)壓設(shè)備只能對(duì)細(xì)菌、病毒起到攔截作用，不進(jìn)行消殺，導(dǎo)致攔截在過(guò)濾介質(zhì)中的微生物可能會(huì)快速繁殖，從而對(duì)隔離的空間產(chǎn)生嚴(yán)重的二次污染[1-4]。因此，十分必要在負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)中引入殺菌裝置，實(shí)現(xiàn)對(duì)攔截微生物的原位消殺。

傳統(tǒng)的殺菌方法包括高溫加熱法、強(qiáng)射線照射法及化學(xué)氧化法等，但具有操作溫度高、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)或有腐蝕性等缺點(diǎn)[5]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，低溫等離子體殺菌技術(shù)開(kāi)始被應(yīng)用于殺菌操作中[6-7]，其具有操作溫度低、耗時(shí)極短、無(wú)需通風(fēng)及不會(huì)傷害操作人員等優(yōu)點(diǎn)[8-11]，是一種理想的殺菌技術(shù)。目前，市售的很多空氣消毒器已經(jīng)采用了此項(xiàng)技術(shù)，但其在負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究對(duì)一種采用低溫等離子體技術(shù)實(shí)現(xiàn)原位殺菌的新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)（自研）的過(guò)濾效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并考察了其殺菌效果，進(jìn)一步分析了殺菌機(jī)理，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)（自研）：新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)主要由殼體、濾芯、風(fēng)機(jī)、低溫等離子體發(fā)生器等組成，見(jiàn)圖1。殼體一端（進(jìn)氣口）連接醫(yī)療艙室排風(fēng)管道的出風(fēng)口，另一端連接軸流風(fēng)機(jī)，殼體內(nèi)部設(shè)有濾芯（濾芯采用改性混合纖維材質(zhì)），濾芯頂端與進(jìn)風(fēng)口之間安裝有低溫等離子體發(fā)生器。其工作過(guò)程為：氣流由進(jìn)氣口進(jìn)入，首先與低溫等離子體發(fā)生器產(chǎn)生的活性物質(zhì)（高能電子、氧自由基、正離子等）混合，混合后的氣流依次通過(guò)濾芯和風(fēng)機(jī)后排放至大氣中。在此過(guò)程中，流經(jīng)低溫等離子體發(fā)生器的微生物會(huì)被活性物質(zhì)消殺，截留在濾芯上的細(xì)菌和病毒也會(huì)被消殺。

圖1 新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

儀器：風(fēng)量罩（沈陽(yáng)加野科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)GTI610型）、激光散射法氣溶膠數(shù)濃度譜和質(zhì)量濃度監(jiān)測(cè)儀（德國(guó)GRIMM 氣溶膠科技公司，型號(hào)Grimm180型）、U 型壓力計(jì)（常州盛之源儀器儀表有限公司，型號(hào)BYYUU 型）、氣溶膠發(fā)生器（自制）、細(xì)菌培養(yǎng)基（自制）、掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社，型號(hào)JSM-6700f 型）、便攜式pH/ORP/電導(dǎo)率計(jì)（上海尚闊儀器技術(shù)有限公司，型號(hào)HQ30d 型）。

試驗(yàn)菌株：大腸桿菌（ATCC 25922）、枯草芽孢桿菌（ATCC 9372）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538），均購(gòu)自中科院微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 過(guò)濾效率和阻力值的測(cè)量

采用國(guó)標(biāo)方法對(duì)過(guò)濾效率和阻力值進(jìn)行檢測(cè)，具體方法見(jiàn)GB/T 6165-2008《高效空氣過(guò)濾器性能試驗(yàn)方法效率和阻力》。

1.2.2 菌懸液的制備

在無(wú)菌操作條件下打開(kāi)凍干菌種管（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌），使用無(wú)菌吸管吸取0.4 ml的液體培養(yǎng)基，滴入菌種管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解成懸浮狀液體；使用高壓滅菌后的移液槍頭吸取液體，接種于液體培養(yǎng)基中，接種量為2%～5%；混勻后在37 ℃、180 r/min恒溫恒濕搖床中活化12 h得到一代菌懸液；使用無(wú)菌接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基中劃線，封口，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后挑選3～4個(gè)大腸桿菌單菌落接種于6 ml液體培養(yǎng)基，封口，在37 ℃、180 r/min恒溫恒濕搖床中活化12 h得到二代菌懸液，此時(shí)菌活性較強(qiáng)，滿足試驗(yàn)需求。其中，一代菌懸液劃線培養(yǎng)出單菌落的固體培養(yǎng)基可用封口膜密封后放置在4 ℃冰箱中保存使用2周。

1.2.3 殺菌試驗(yàn)

將菌種放入新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)內(nèi)腔，對(duì)菌液進(jìn)行不同時(shí)間的處理；在溫度為20～25 ℃、相對(duì)濕度為50%～70%的條件下，開(kāi)啟該系統(tǒng)，運(yùn)行不同時(shí)間分別進(jìn)行處理，作為試驗(yàn)組，不進(jìn)行消毒的一組作為空白對(duì)照組；處理完成后，將采樣平板置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果并計(jì)算存活率，用以反映殺菌效果；每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1 過(guò)濾效率

過(guò)濾效率以η過(guò)慮計(jì)，數(shù)值以百分?jǐn)?shù)（%）表示，按公式（1）計(jì)算：

式中，η過(guò)慮為過(guò)濾效率的數(shù)值，單位為%；C前為設(shè)備前氣溶膠濃度值，單位為個(gè)；C后為設(shè)備后氣溶膠濃度值，單位為個(gè)。

1.3.2 存活率

存活效率以η存活計(jì)，數(shù)值以百分?jǐn)?shù)（%）表示，按公式（2）計(jì)算：

2 結(jié)果

2.1 過(guò)濾效率的測(cè)試結(jié)果

本研究對(duì)新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)的流量、阻力損失與去除效率的關(guān)系進(jìn)行了考察，利用氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生定量濃度的氣溶膠氣流，氣流通過(guò)新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)，采用激光散射法氣溶膠數(shù)濃度譜和質(zhì)量濃度監(jiān)測(cè)儀測(cè)量其前、后氣流中的氣溶膠濃度，以U 型壓力計(jì)測(cè)試氣流通過(guò)時(shí)的壓力損失，以風(fēng)量罩測(cè)量氣流的流量，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，隨流量的增加，阻力損失逐步增大；當(dāng)流量在200～500 m3/h 范圍內(nèi)變化時(shí)，設(shè)備去除效率基本穩(wěn)定在99.9985%，當(dāng)流量從500 m3/h增至900 m3/h時(shí)，設(shè)備去除效率從99.9985%降至99.9965%。

圖2 流量、阻力損失與去除效率的關(guān)系

2.2 不同放電功率的滅菌效果

在溫度為20～22 ℃、相對(duì)濕度為50%～55%的條件下，新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)中低溫等離子體發(fā)生器放電時(shí)間5 min時(shí)，細(xì)菌存活率（采用自制細(xì)菌培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌）與放電功率的關(guān)系見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，分別采用低、中、高3種放電功率處理時(shí)，大腸桿菌的存活率依次為90%、10%和0%，金黃色葡萄球菌的存活率依次為95%、30%和0%，枯草芽孢桿菌的存活率則依次為98%、55%和15%，表明在作用時(shí)間相同的條件下，隨放電功率的升高，細(xì)菌存活率逐漸降低。

圖3 不同放電功率作用后的細(xì)菌存活率

2.3 不同種類細(xì)菌隨處理時(shí)間的滅菌效果

在溫度為20～22 ℃、相對(duì)濕度為50%～55%的條件下，開(kāi)啟新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)，使用低放電功率處理大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，其存活率見(jiàn)表1。由表可知，隨處理時(shí)間的增加，細(xì)菌存活率明顯降低，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌分別在20、30和60 min時(shí)被完全殺滅；新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)在相同條件下殺滅3種菌種的難易程度為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。

表1 不同處理時(shí)間的細(xì)菌存活率

2.4 處理不同時(shí)間大腸桿菌蛋白泄漏量及電導(dǎo)率的變化

不同處理時(shí)間（低放電功率條件下）大腸桿菌蛋白泄漏量和電導(dǎo)率（使用便攜式pH/ORP/電導(dǎo)率計(jì)測(cè)量）的變化曲線見(jiàn)圖4。大腸桿菌的蛋白泄漏量隨放電時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，30 min 內(nèi)從0增加到111.9 μl/ml；大腸桿菌菌液的電導(dǎo)率也隨放電時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，30 min 內(nèi)由450 μS/cm 增加到702 μS/cm，增加了56%。

圖4 處理不同時(shí)間大腸桿菌蛋白泄漏量及電導(dǎo)率的變化

2.5 表面形貌

掃描電子顯微鏡是一種介于透射電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡之間的顯微設(shè)備，其利用聚焦、很窄的高能電子束來(lái)掃描樣品，通過(guò)光束與物質(zhì)間的相互作用，激發(fā)各種物理信息，并通過(guò)信息收集、放大、再成像以達(dá)到表征物質(zhì)微觀形貌的目的。

新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)放電處理前、后大腸桿菌的掃描電鏡照片見(jiàn)圖5。由圖可知，處理前，大腸桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，電子密度高，而處理后細(xì)胞壁變得粗糙，電子密度降低，且部分菌體發(fā)生核心溶解，菌體近乎空殼。

圖5 新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)處理前、后大腸桿菌的掃描電鏡照片

新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)放電處理前、后枯草芽孢桿菌的掃描電鏡照片見(jiàn)圖6。由圖可知，未放電處理芽孢的胞壁完整，胞質(zhì)均勻；放電處理后，芽孢外壁已破損，流出膠狀物質(zhì)，體積縮小且外層結(jié)構(gòu)有凹陷，表明該殺菌技術(shù)可有效殺死芽孢。

圖6 新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)處理前、后枯草芽孢桿菌的掃描電鏡照片

3 討論

3.1 過(guò)濾效果評(píng)價(jià)

過(guò)濾效率是評(píng)價(jià)負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)工作效能的基本指標(biāo)，其與設(shè)備本身過(guò)濾材料的孔隙率、氣體流量、氣溶膠粒徑的大小及含量等相關(guān)。從圖2的試驗(yàn)結(jié)果看，當(dāng)流量在200～500 m3/h 范圍內(nèi)變化時(shí)，設(shè)備去除效率基本穩(wěn)定在99.9985%，此性能達(dá)到了超高效空氣過(guò)濾器的指標(biāo)要求[12]，當(dāng)流量從500 m3/h 增至900 m3/h 時(shí)，設(shè)備去除效率從99.9985%降至99.9965%，但其性能仍高于WS/T 292-2008《救護(hù)車》[13]對(duì)氣溶膠過(guò)濾效率（達(dá)到99.7%）的要求。

3.2 殺菌效果評(píng)價(jià)與殺菌機(jī)理探討

細(xì)菌存活率在此用于評(píng)價(jià)該新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)生物氣溶膠的殺滅性能（細(xì)菌存活率越低，表明設(shè)備的殺菌效果越好）。該設(shè)備使用低溫等離子體殺菌技術(shù)，其殺菌性能與低溫等離子體發(fā)生器自身的放電功率、微生物種類、作用時(shí)長(zhǎng)等有關(guān)。圖3結(jié)果顯示，當(dāng)處理時(shí)間相同時(shí)，放電功率越高，殺菌效果越好。其原因在于，高放電功率有助于氣體放電產(chǎn)生更多的高能電子、氧自由基和正離子等活性粒子，氧自由基越多，越容易與細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸分子發(fā)生反應(yīng)，從而致其死亡；同時(shí)，足夠多的正離子會(huì)穿透細(xì)菌的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致其死亡[14]。表1結(jié)果顯示，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，3種細(xì)菌均逐漸被殺滅，但不同種類細(xì)菌被殺滅所需要的時(shí)間不同。革蘭陰性菌細(xì)胞壁的厚度約為2 nm，革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的厚度為15～18 nm，所以，屬于革蘭陰性菌的大腸桿菌因細(xì)胞壁薄而比屬于革蘭陽(yáng)性菌的金黃色葡萄球菌更容易被殺滅[15]，枯草芽孢桿菌最難被殺死的原因在于其抗性較強(qiáng)，芽孢對(duì)高溫、紫外線、干燥、電離輻射和多種有毒的化學(xué)物質(zhì)均有很強(qiáng)的抗性[16]。

考察菌體蛋白泄漏量、電導(dǎo)率隨放電處理時(shí)間的變化可以間接反映菌體受破壞的程度變化，對(duì)放電前、后的菌體進(jìn)行掃描電鏡照相可以直接觀察菌體被破壞的樣貌變化，以上結(jié)果可為放電處理過(guò)程中殺菌機(jī)理的探索提供參考。由圖4可知，大腸桿菌的蛋白泄漏量隨放電時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，由此反映出負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)的放電處理與細(xì)胞膜之間的作用效果隨放電時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，原細(xì)胞的完整性在一定程度上遭到破壞，致使胞內(nèi)蛋白類物質(zhì)持續(xù)外泄[17]。同樣原理，經(jīng)放電處理后，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的其他內(nèi)容物也會(huì)不斷析出，導(dǎo)致胞外菌液的電導(dǎo)率隨之不斷增大[18]。圖5和圖6顯示的是大腸桿菌和枯草芽孢桿菌放電前、后的掃描電鏡結(jié)果。放電處理后，大腸桿菌的細(xì)胞壁變得粗糙，電子密度降低，分析其原因，一方面，可能是細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被氧自由基等活性粒子破壞，細(xì)胞內(nèi)容物漏出，另一方面，可能是由活性粒子進(jìn)入菌體細(xì)胞與其內(nèi)部的大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸等）反應(yīng)所致[19]。放電處理后，枯草芽孢桿菌發(fā)生了破損，其發(fā)生機(jī)理與細(xì)胞壁變粗糙的機(jī)理類似，一方面，可能是放電產(chǎn)生的高能粒子穿透了細(xì)胞壁并釋放能量破壞了芽孢結(jié)構(gòu)，從而造成細(xì)胞內(nèi)容物溢出所導(dǎo)致[20]，另一方面，可能是產(chǎn)生的氧自由基等同芽孢內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致其變性凝固，進(jìn)而使芽孢體積縮小，最終死亡所導(dǎo)致[21-22]。

綜上所述，該新型負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)過(guò)濾性能良好，具有較高的原位殺菌效率，在傳染病防治領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景，亦可用于冷庫(kù)、空調(diào)風(fēng)道、人防設(shè)施、生物安全實(shí)驗(yàn)室等空間內(nèi)微生物的過(guò)濾和消殺。