系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路與臨床特征的相關(guān)性研究

余楷 何詩(shī)雅 陳麗瑩 韓婷芬 楊科朋 王新昌

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是自身免疫介導(dǎo)的以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，血清中多種自身抗體的產(chǎn)生和多系統(tǒng)受累是SLE 的兩個(gè)主要特征[1]。臨床上，尿液標(biāo)志物的評(píng)估常常被忽略。犬尿氨酸（kynurenine，KYN）是吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenas，IDO）作用下的色氨酸（tryptophan，TRP）代謝產(chǎn)物。干擾素α（interferon α，IFN-α）等炎癥因子可影響IDO 活性，造成TRP-KYN 通路失衡。研究表明，SLE 等自身性免疫疾病中伴有抑郁、焦慮和認(rèn)知缺陷患者的KYN/TRP 比值存在異常[2]。SLE患者血清色氨酸濃度較正常人降低，KYN 水平和IDO 活性較正常人顯著增高[3]。TRP-KYN 通路是免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)之間相互影響的關(guān)鍵界面。IFN-α在SLE 的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用[4]，SLE 患者出現(xiàn)精神異常的分子機(jī)制很可能與IFN-α 等炎癥因子誘導(dǎo)的TRP-KYN 通路異常有關(guān)。因此，為了尋求尿液中評(píng)價(jià)SLE 患者的生物標(biāo)志物。本研究應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）分析SLE 患者尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路與臨床特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2020 年6 月至2021 年5 月就診于浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院及浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診為SLE 的患者75 例。本研究通過(guò)浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院及浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[審批號(hào)：2020-KL-002-IH01，（2020）倫審研第（751）號(hào)]，所有患者在受試前已經(jīng)簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2012 年SLICC 制訂的SLE 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[5]；（2）年齡14～65 歲；（3）患者知情并同意參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）終末期腎病、Ⅳ級(jí)心力衰竭、肝衰竭、惡性腫瘤患者；（2）合并其他自身免疫病患者；（3）哺乳期女性。

1.3 方法

1.3.1 臨床特征 記錄患者的一般情況，包括性別、年齡、病程、治療藥物等。

1.3.2 尿液IFN-α、TRP、KYN 水平檢測(cè) 采集患者尿液5mL，將尿液凍存于－80℃?zhèn)溆?。采用南京草本源生物科技有限公司ELISA 試劑盒（人IFN-α ELISA 試劑盒，批號(hào)20 210503；人TRP ELISA 試劑盒，批號(hào)20210503-1；人KYN ELISA 試劑盒，批號(hào)20210503-02）進(jìn)行尿液中IFN-α、TRP、KYN 水平檢測(cè)。具體步驟：用無(wú)菌管收集尿液，離心20min（2000～3000r/min），仔細(xì)收集上清。分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋40μL，然后再加待測(cè)樣品10μL（樣品最終稀釋度為5 倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。每孔加入酶標(biāo)試劑100μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育60min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中尿液IFN-α 含量。尿液TRP、KYN 水平檢測(cè)方法同上。

1.3.3 疾病活動(dòng)度評(píng)分 系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)性評(píng)分[1]（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLE-DAI）對(duì)SLE 病情進(jìn)行判斷：0～4 分為基本無(wú)活動(dòng)；5～9 分為輕度活動(dòng)；10～14 分為中度活動(dòng)；≥15 分為重度活動(dòng)。以上計(jì)分為近10d 之內(nèi)的癥狀和檢查。

1.3.4 生存質(zhì)量評(píng)估 通過(guò)官網(wǎng)（http://www.corptransinc.com），獲取中文版狼瘡生活質(zhì)量量表（LupusQoL-China）及使用權(quán)。該量表包括34 條目，分為8 個(gè)維度，分別為：軀體健康、疼痛、計(jì)劃性、性生活、對(duì)他人的負(fù)擔(dān)、情緒健康、自我形體評(píng)價(jià)和疲勞。量表為L(zhǎng)ikert 5 級(jí)選擇量表，1～5 級(jí)分別代表“一直如此”“大多數(shù)時(shí)間”“很多時(shí)間”“偶爾”“從不”，計(jì)分分別為0～4 分。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)處理和分析數(shù)據(jù)。對(duì)患者一般情況和疾病活動(dòng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。組間比較采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。以P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE 患者臨床特征 75 例SLE 患者女73 例，男2 例；年齡20～64（40.2±11.46）歲，＞60 歲的患者較少；病程＜5 年27 例，5～10 年24 例，＞10 年24 例；治療方案多以激素+免疫抑制劑或激素+免疫抑制劑+中藥治療為主；大多數(shù)患者病情控制良好，基本無(wú)活動(dòng)者41 例，輕度活動(dòng)26 例，中度活動(dòng)6 例，中度活動(dòng)2 例；生存質(zhì)量評(píng)分（109.8±15.4），＜100 分者有18例，100～109 分15 例，110～119 分19 例，≥120 分23例。見(jiàn)表1。

表1 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者臨床特征（n=75）

2.2 SLE 尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路與臨床特征的相關(guān)性分析 SLE 患者尿液IFN-α 水平與病程、年齡、生存質(zhì)量評(píng)分、KYN/TRP 比值、治療藥物無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SLE 患者尿液TRP、KYN、KYN/TRP 比值顯示與病程、年齡、生存質(zhì)量評(píng)分、治療藥物無(wú)相關(guān)性。但尿液IFN-α 水平與疾病活動(dòng)度呈顯著正相關(guān)（r=0.254，P＜0.05），見(jiàn)表2，圖1。

表2 SLE 尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路與臨床特征相關(guān)性分析

圖1 尿液IFN-α 水平與SLE-DAI 評(píng)分相關(guān)性（P＜0.05）注：SLE-DAI 為系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)性評(píng)分；IFN-α 為干擾素α

3 討論

本研究結(jié)果顯示，SLE 好發(fā)于40 歲左右的育齡期女性，病程可超過(guò)10 年。患者長(zhǎng)期激素、免疫抑制劑和中藥等維持治療基本能控制病情于穩(wěn)定。大多數(shù)SLE 患者生活質(zhì)量下降。約91%SLE 患者會(huì)出現(xiàn)疲勞、頭痛、情緒改變和認(rèn)知障礙等非特異性的表現(xiàn)[6]。這些“輕微”神經(jīng)精神癥狀對(duì)患者的生活質(zhì)量有著顯著的影響。然而這些表現(xiàn)相對(duì)隱匿，沒(méi)有明顯的腦部影像學(xué)改變，臨床上常常忽視對(duì)這方面的關(guān)注。

TRP-KYN 通路與抑郁和精神分裂癥等多種精神和心理健康疾病有著密切的關(guān)系，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[7-9]。IDO 主要存在于肝臟以外的組織細(xì)胞中，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，是肝臟以外催化TRP 沿KYN 通路代謝的唯一限速酶。IDO 受IFN-α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，也可受其他一些細(xì)胞因子的誘導(dǎo)增多，反之，又可通過(guò)CD19+DC 中B7 信號(hào)的反應(yīng)參與IFN-α 水平的調(diào)控。這種雙向反饋回路可能是預(yù)防過(guò)度炎癥和自身免疫反應(yīng)的一部分[10]。IDO 的增多促進(jìn)TRP 朝著TRP-KYN 通路分解代謝，造成下游代謝的失衡，從而引發(fā)了如神經(jīng)系統(tǒng)改變的臨床表現(xiàn)（見(jiàn)圖2）。

圖2 IFN-α 誘導(dǎo)的TRP-KYN 通路失衡示意圖

SLE 小鼠的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，SLE 存在TRP代謝失常[11]。Pertovaara等[12]研究發(fā)現(xiàn)，IDO 機(jī)制與SLE 發(fā)展進(jìn)程相關(guān)，在相同條件下，SLE 患者與健康對(duì)照者相比，血清TRP 濃度降低、代謝產(chǎn)物KYN 增高，IDO 活性也明顯增高。Akesson等[13]研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者與對(duì)照組相比，TRP-KYN 通路中的下游代謝物喹啉酸和犬尿喹啉酸發(fā)生了改變。因此，TRP-KYN通路上的相關(guān)代謝指標(biāo)極有可能成為反映SLE 患者“輕微”神經(jīng)精神癥狀的生物標(biāo)志物。但是本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)尿液中TRP、KYN 及其比值與疾病活動(dòng)度、生存質(zhì)量評(píng)分等臨床特征的相關(guān)性，與IFN-α 也無(wú)相關(guān)性。造成SLE 患者精神改變和生活質(zhì)量影響的因素是多方面的，可能無(wú)法單單用一條通路、幾個(gè)指標(biāo)去衡量，后續(xù)可進(jìn)行多通路，多組學(xué)的探索。此外，尿液作為代謝產(chǎn)物的去路之一，能一定程度反映人體的某些代謝情況，但是亦有諸多不穩(wěn)定的影響因素，包括代謝產(chǎn)物在尿液中的進(jìn)一步反應(yīng)降解等。對(duì)血漿、腦脊液的檢測(cè)可能會(huì)更穩(wěn)定、更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)代謝水平的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，SLE 患者尿液IFN-α 水平與SLE疾病活動(dòng)度呈顯著正相關(guān)。既往研究表明，IFN-α 是SLE 發(fā)病的重要免疫細(xì)胞因子，在對(duì)抗病毒感染、抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)控細(xì)胞分裂、參與免疫系統(tǒng)活化中起著重要的作用[4]。Niewold等[14]發(fā)現(xiàn)，SLE 患者及其健康親屬的IFN-α 活性高于正常人，具有明顯的家族聚集性。對(duì)SLE 患者滑膜組織的直接分析顯示，IFN誘導(dǎo)基因上調(diào)[15]。SLE 患者外周血淋巴細(xì)胞IFN-α基因的表達(dá)水平比健康志愿者外周血淋巴細(xì)胞高3倍。并隨著臨床癥狀改善而降低[16]。有報(bào)道，NZB/NZW F1 模型小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α，在發(fā)生明顯的病理學(xué)改變之前，這些小鼠在遺傳上易患自發(fā)性狼瘡樣疾病，加速了狼瘡自身抗體的產(chǎn)生和組織損傷[17]。IFN-α 在SLE 中有多種致病機(jī)制。異常增多的IFNα 通過(guò)調(diào)控免疫系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞的生存、活化及功能，促進(jìn)SLE 的發(fā)生發(fā)展。SLE 目前臨床診斷和治療干預(yù)措施的選擇主要依賴臨床表現(xiàn)和血清學(xué)檢查的復(fù)合評(píng)估。尿液生物標(biāo)志物作為無(wú)侵入性評(píng)估工具以準(zhǔn)確判斷SLE 的疾病活動(dòng)及預(yù)后很有吸引力。本研究結(jié)果顯示，尿液IFN-α 作為SLE 患者臨床疾病活動(dòng)度生物標(biāo)志物潛力，但仍需大樣本的臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其可靠性。

綜上所述，本研究未發(fā)現(xiàn)TRP-KYN 通路與SLE臨床特征存在相關(guān)性，SLE 患者尿液IFN-α 水平與SLE-DAI 呈正相關(guān)，可能可以作為評(píng)估SLE 疾病活動(dòng)的客觀指標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。