不同劑量血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈斑塊負(fù)荷及CXCL16和MMP-1表達(dá)水平的影響

陳靜文 裴菱花 竇麗萍 王審 楊明 黃抒偉

[摘要] 目的 探討血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈斑塊負(fù)荷及炎癥因子CXCL16、MMP-1表達(dá)的影響。方法 APOE基因敲除小鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周后，油紅O染色證實(shí)造模成功。將30只小鼠隨機(jī)分為血府逐瘀湯高劑量組、低劑量組、對(duì)照組。4周后對(duì)每組主動(dòng)脈根部切片的斑塊面積進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)主動(dòng)脈組織中CXCL16、MMP-1蛋白及mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 三組小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊平均面積為（0.047±0.019）、（0.073±0.018）、（0.079±0.011）mm2，高劑量組斑塊面積小于低劑量組（P<0.05），低劑量組斑塊面積小于對(duì)照組（P>0.05）。三組CXCL16蛋白的相對(duì)水平分別為（0.422±0.065）、（0.640±0.070）、（0.849±0.054），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。MMP-1蛋白的相對(duì)水平分別為（0.260±0.031）、（0.535±0.050）、（0.736±0.039），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。CXCL16 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為（0.407±0.023）、（0.725±0.044）、（0.823±0.038），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。MMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為（0.392±0.034）、（0.513±0.033）、（0.668±0.046），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)論 血府逐瘀湯抑制AS小鼠主動(dòng)脈斑塊CXCL16、MMP-1的表達(dá)，高劑量干預(yù)下可降低斑塊負(fù)荷。

[關(guān)鍵詞] 動(dòng)脈粥樣硬化;血府逐瘀湯;CXCL16;MMP-1;小鼠

[中圖分類號(hào)] R543.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）06-0024-04

[Abstract] Objective To explore the effects of Xuefu Zhuyu Decoction on aortic plaque burden and expression levels of inflammatory factors CXCL16 and MMP-1 in atherosclerotic mice. Methods Successful modeling was confirmed by oil-red O staining after 8 weeks of high-fat chow feeding in APOE-knockout mice. Thirty mice were randomly divided into the Xuefu Zhuyu Decoction high-dose intervention group， the low-dose intervention group and the control group. The plaque area of aortic root sections in each group was measured 4 weeks later， and the expression levels of CXCL16 and MMP-1 protein and mRNA in aortic tissues were detected. Results The mean areas of atherosclerosis （AS） plaque in aortic root? of mice in the three groups were （0.047±0.019）， （0.073±0.018）， and （0.079±0.011）mm2， and the plaque area in the high-dose group was smaller than that in the low-dose group （P<0.05）， and the plaque area in the low-dose group was smaller than that in the control group （P>0.05）. The relative levels of CXCL16 protein in the three groups were （0.422±0.065）， （0.640±0.070）， and （0.849± 0.054）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative levels of MMP-1 protein were（0.260±0.031）， （0.535±0.050）， and （0.736±0.039）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative expression levels of CXCL16 mRNA were （0.407±0.023）， （0.725±0.044），（0.823±0.038）， respectively， with statistically significant difference （P<0.001）. The relative expression levels of MMP-1 mRNA were （0.392±0.034）， （0.513±0.033）， （0.668±0.046）， with statistically significant difference （P<0.001）. Conclusion Xuefu Zhuyu Decoction can inhibit the expressions of CXCL16 and MMP-1 in aortic plaques of AS mice， and reduce plaque burden with high-dose intervention.

[Key words] Atherosclerosis; Xuefu Zhuyu Decoction; CXCL16; MMP-1; Mice

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種進(jìn)展緩慢的心血管系統(tǒng)疾病。CXC型趨化因子配體16（CXC-chemokine ligand 16，CXCL16）作為清道夫受體吞噬ox-LDL，促進(jìn)內(nèi)皮泡沫細(xì)胞形成[1]，高表達(dá)于粥樣斑塊中[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族成員MMP-1能降解粥樣硬化斑塊纖維帽中的Ⅰ、Ⅲ型膠原，使纖維帽變薄易破裂[3]。Macarie等[4]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-1的過(guò)度表達(dá)及活化與AS斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)。MMP-1水平有助于評(píng)價(jià)斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)[5]。血府逐瘀湯由清代醫(yī)家王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中提出[6]，本方主活血化瘀、宣痹通絡(luò)，是中醫(yī)治療“胸痹”的經(jīng)典方[7]，其與他汀類藥物合用，可進(jìn)一步減少頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度、減小斑塊面積[8]，但血府逐瘀湯對(duì)CXCL16、MMP-1的影響尚不明確。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

①8周齡SPF級(jí)雄性APOE-/-小鼠40只，體重（20±2）g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0006。血府逐瘀湯制備藥材購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院。②主要試劑：Western-blot試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）;③CXCL16、MMP-1引物及內(nèi)參由上海生工公司設(shè)計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 AS小鼠造模及分組? 參照文獻(xiàn)[9]選擇APOE-/-小鼠，經(jīng)高脂飼養(yǎng)8周后，取主動(dòng)脈根部組織脫水、包埋、切片，油紅O染色12～15 h后，如光鏡下見(jiàn)脂質(zhì)斑塊，表示AS建模成功。將30只小鼠隨機(jī)分為血府逐瘀湯高劑量組、低劑量組、對(duì)照組，每組各10只。

1.2.2 血府逐瘀湯制備及給藥? 桃仁12 g，紅花9 g，當(dāng)歸9 g，生地9 g，川芎4.5 g，赤芍6 g，牛膝9 g，桔梗4.5 g，柴胡3 g，枳殼6 g，甘草3 g，加水750 ml，浸泡30 min，煮沸后文火慢煎40 min，濃縮至150 ml，即含藥濃度0.5 g/mL。根據(jù)小鼠給藥劑量公式計(jì)算給藥量[10]，每日1次，共4周。高劑量組每天給予2 ml/100 g體重灌胃，低劑量組每天給予1 ml/100 g體重灌胃，對(duì)照組不給藥。

1.2.3 采集主動(dòng)脈標(biāo)本及組織病理觀察? 12周末采集主動(dòng)脈標(biāo)本。將心臟-主動(dòng)脈整條分離，從主動(dòng)脈根部以上2 mm處斷開(kāi)，標(biāo)本均保存固定。主動(dòng)脈根部組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋，切片時(shí)參考Suzuki[11]確立的方法，顯微鏡下見(jiàn)到主動(dòng)脈瓣三瓣中任何一瓣的根部出現(xiàn)后連續(xù)切片，厚度為5 μm。油紅O染色后光鏡下可見(jiàn)紅色深染脂質(zhì)斑塊（圖1），Image J軟件定量測(cè)定斑塊面積。

1.2.4 CXCL16、MMP-1蛋白水平測(cè)定（Western-blot）? ?將主動(dòng)脈組織研磨混合，每組提取1 mg， 加入裂解液處理30 min， 收集后提取上清并煮沸。上樣后電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入CXCL16和MMP-1的一抗，4℃冰箱避光孵育（>12 h） 。次日孵育二抗后顯影成像。Image J軟件分析條帶測(cè)定灰度值。

1.2.5 CXCL16、MMP-1mRNA水平測(cè)定（RT-PCR）? 提取主動(dòng)脈組織總RNA。CXCL16上游引物5-ACTC- AGCCAGGCAATGGCAAC-3′;下游引物5′-GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC-3′;長(zhǎng)度693 bp。MMP-1上游引物5′-CCTGAAGAATGATGGGAGGCAAG-3′;下游引物5′-GCTCTTGGCAAATCTGGCGTG-3′，長(zhǎng)度255 bp。GAPDH上游引物：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′;下游引物：5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′，長(zhǎng)度350 bp。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 3 0 s，72℃ 45 s，擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，電泳30 min。Image J軟件測(cè)量條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅染色及斑塊面積情況

三組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅染色照片見(jiàn)圖1，箭頭所指暗紅色區(qū)域?yàn)锳S斑塊。Image J軟件定量測(cè)定結(jié)果顯示，高劑量組斑塊平均面積小于低劑量組及對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;低劑量組斑塊平均面積與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1、圖2。

2.2 三組小鼠主動(dòng)脈組織CXCL16、MMP-1、β-Actin蛋白水平情況比較

三組小鼠主動(dòng)脈組織CXCL16、MMP-1、β-Actin蛋白Western-blot條帶照片見(jiàn)封三圖1。高劑量組CXCL16、MMP-1蛋白相對(duì)水平低于低劑量組及對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;低劑量組相對(duì)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖3。

2.3 三組小鼠主動(dòng)脈組織CXCL16、MMP-1、內(nèi)參GAPDH基因表達(dá)情況

三組小鼠主動(dòng)脈組織CXCL16、MMP-1、GAPDH基因RT-PCR電泳照片見(jiàn)封三圖2。高劑量組CXCL16、MMP-1基因相對(duì)表達(dá)水平低于低劑量組及對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;低劑量組相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖4。

3 討論

炎癥反應(yīng)在AS發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，貫穿于粥樣硬化斑塊的形成、演變以及破裂的整個(gè)病理過(guò)程。Kapoor等[12]研究發(fā)現(xiàn)，一些穩(wěn)定性冠心病患者盡管接受了嚴(yán)格生活方式指導(dǎo)及最優(yōu)化的藥物治療，內(nèi)環(huán)境中的炎癥及免疫反應(yīng)仍然持續(xù)存在，導(dǎo)致疾病反復(fù)甚至進(jìn)展?？笰S治療不僅僅是降膽固醇，抗炎治療的重要作用也越來(lái)越被重視。COLCOT研究[13]、CANTOS研究[14]均分別觀察秋水仙堿、Canakinumab在急性心肌梗死中的治療作用，均闡明了抗炎治療可降低心肌梗死患者遠(yuǎn)期心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，證實(shí)了抗炎治療的有效性。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，Lin等[15]體外細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)。程茂維[16]觀察82例急性腦梗死患者發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)他汀治療基礎(chǔ)上加用血府逐瘀湯可進(jìn)一步降低患者膽固醇、三酰甘油水平。楊華等[17]將血府逐瘀湯加減應(yīng)用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者的治療，觀察發(fā)現(xiàn)治療后1年內(nèi)心絞痛及心肌梗死再發(fā)率、住院率均明顯下降。C反應(yīng)蛋白是冠心病獨(dú)立的生物標(biāo)志物[18]，可呈劑量依賴性上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)及分泌CXCL16[19]。陳東等[20]報(bào)道，C反應(yīng)蛋白可上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)及分泌MMP-1。同時(shí)CXCL16、MMP-1高表達(dá)于粥樣斑塊中，因而本研究選擇CXCL16、MMP-1作為研究靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，APOE基因敲除小鼠經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)8周后成功造模為AS小鼠，予不同濃度血府逐瘀湯干預(yù)喂養(yǎng)4周后，小鼠主動(dòng)脈組織CXCL16及MMP-1蛋白相對(duì)水平降低，CXCL16及MMP-1mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低。該作用在低劑量血府逐瘀湯干預(yù)后即可顯現(xiàn)，且干預(yù)濃度越高，降低作用越明顯，提示血府逐瘀湯具有抑制CXCL16、MMP-1這兩種炎癥因子的表達(dá)作用，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抑制泡沫細(xì)胞形成，降低已形成斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)對(duì)三組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅染色AS斑塊面積定量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，高劑量組血府逐瘀湯干預(yù)后小鼠AS斑塊面積較低劑量組、對(duì)照組顯著減小，但低劑量組與對(duì)照組之間并無(wú)顯著差異，表明高劑量血府逐瘀湯干預(yù)AS模型后，在一定程度上減少了主動(dòng)脈斑塊負(fù)荷，抑制了AS的進(jìn)展。

本研究存在一些不足之處，如樣本量較小、研究周期短，且并未涉及具體機(jī)制、作用通道的研究。在本研究基礎(chǔ)上可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)觀察時(shí)間進(jìn)一步評(píng)估中遠(yuǎn)期療效，同時(shí)可探討血府逐瘀湯抑制CXCL16及MMP-1表達(dá)的具體作用途徑，旨在深入闡明血府逐瘀湯抑制AS進(jìn)展的作用機(jī)制。

綜上所述，血府逐瘀湯具有抑制AS小鼠主動(dòng)脈組織CXCL16及MMP-1的表達(dá)作用，在高劑量干預(yù)下可降低粥樣硬化血管的斑塊負(fù)荷，在一定程度上延緩AS進(jìn)展，為臨床動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的中醫(yī)藥治療提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? ?Xing J，Liu Y，Chen T. Correlations of chemokine CXCL16 and TNF-αwith coronary atherosclerotic heart disease[J].EXP Ther Med，2018，15（1）：773-776.

[2]? ?陳艷，胡澤波，高民，等.炎癥反應(yīng)激活CXCL16/CXCR6通路促進(jìn)終末期腎病動(dòng)脈粥樣硬化[J].中華腎臟病雜志，2016，32（4）：271-277.

[3]? ?Fernandes TD，Santos ALG，Santos MC， et al. Matrix metalloproteinase-1（MMP-1） and （MMP-8） gene polymor- phisms promote increase and remodeling of the collagen Ⅲ and V in posterior tibial tendinopathy[J].Histol Histop- athol，2018，33（9）：929-936.

[4]? ?Macarie RD，Vadana M，Ciortan L，et al. The expression of MMP-1 and MMP-9 is up-regulated by smooth muscle cells after their cross-talk with macrophages in high glucose conditions[J].J Cell Mol Med，2018，22（9）：4366-4376.

[5]? ?Vacek T，Rehman S，Neamtu D，et al. Matrix metalloprot- einases in atherosclerosis： Role of nitric oxide， hydrogen sulfide， homocysteine， and polymorphisms[J].Vascular Health and Risk Management，2015，11：173-183.

[6]? ?楊會(huì)林，王強(qiáng).中醫(yī)藥治療冠心病心絞痛研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥，2013，44（9）：73-76.

[7]? ?鄭國(guó)華，諶海英，褚劍鋒，等.血府逐瘀膠囊治療冠心病心絞痛隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中醫(yī)雜志，2012， 53（2）：117-121.

[8]? ?俞文駿，王劍波，黃娟，等.阿托伐他汀鈣、阿司匹林聯(lián)合中藥血府逐瘀湯治療頸動(dòng)脈斑塊60例療效觀察[J].上海醫(yī)藥，2017，38（18）：20-24.

[9]? ?Zhang SH，Reddick RL，Piedrahita JA，et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E[J].Science，1992，258（5081）：468-471.

[10]? 徐淑云，卞如蓮，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：202-204.

[11]? Suzuki H，Kurihara Y，Takeya M，et al. A role for macrophage scavengerreceptors in atherosclerosis and susceptibility to infection[J].Nature，1997，386（6622）：292-296.

[12]? Kapoor D，Trikha D，Vijayvergiya R， et al. Conventional therapies fail to target inflammation and immune imbalance in subjects with stable coronary artery disease：A system-based approach[J].Atherosclerosis，2014，237（2）：4623-4631.

[13]? Tardif JC，Kouz S，Waters DD，et al. Efficacy and safety of low-dose colchicine after myocardial infarction[J].N Engl J Med，2019，381（26）：2497-2505.

[14]? Ridker PM，Everett BM，Thuren T，et al. Anti-inflammatory therapy with canakinumab for atherosclerotic disease[J].N Engl J Med，2017， 377（12）：1119-1131.

[15]? Lin F，Chen BL，Wang YZ，et al. In vitro angiogenesis effect of Xuefu Zhuyu Decoction and vascular endothelial growth faction： A comparison study[J].Chin J Integr Med， 2018，24（8）：606-612.

[16]? 程茂維.血府逐瘀湯治療急性腦梗死療效觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15（10）：1274-1276.

[17]? 楊華，許臣洪，李欣.血府逐瘀湯加減對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后心血管事件的影響[J].中醫(yī)雜志，2016，57（7）：592-595.

[18]? Peikert A，Kaier K，Merz J，et al. Residual inflammatory risk in coronary heart disease：Incidence of elevated high-sensitive crp in a real-world cohort[J].Clin Res Cardiol， 2019，109（3）：315-323.

[19]? 陳靜文，王審，林冬銘，等.C反應(yīng)蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞分泌趨化因子CXCL16影響的研究[J].心電與循環(huán)，2019， 38（3）：178-181.

[20]? 陳東，嚴(yán)激，潘文博，等.丹紅、C反應(yīng)蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶1表達(dá)的關(guān)系[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2012，20（8）：714-718.

（收稿日期：2021-01-18）