不同貯藏條件下7種青岡屬種子含水量及生活力變化研究

史喜兵， 焦雪輝， 申瀟瀟， 梁 冠， 周小娟， 劉 杰

(鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所， 河南 鄭州 450005)

種子是植物的原始體和遺傳信息的儲(chǔ)存體，了解植物種子的貯藏特性對(duì)植物種質(zhì)資源引種及保存至關(guān)重要[1-2]。影響種子貯藏特性的因素很多，內(nèi)因主要為種子的物理性狀(種子大小、種皮結(jié)構(gòu)、硬度等)和化學(xué)組分(糖類、蛋白質(zhì)和脂肪三大貯藏物質(zhì)及含水量等)；外因包括采種母株的發(fā)育情況、采收、貯藏環(huán)境等[3]。多年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)種子的貯藏特性研究得非常廣泛深入。大量的研究已經(jīng)證明, 種子采集后的貯藏環(huán)境對(duì)種子性能的維持或改變有著極大的影響[4]。王培蒂和秦國(guó)峰[5]將馬尾松種子在2～4 ℃下貯藏11年，證明低溫有利于種子的長(zhǎng)期貯藏；Ellis等[6]將芝麻種子的水分從5%降至2%，其貯藏壽命增長(zhǎng)40倍，證實(shí)超干貯藏能有效提高種子耐貯藏性。張俊杰等[7]對(duì)金絲李種子的貯藏特性和脫水耐性進(jìn)行了研究，認(rèn)為4 ℃濕沙藏(含水量7.5%) 是短期貯藏其種子的較好方法。楊洪濤等[8]研究了貯藏方式和時(shí)間對(duì)云南越桔種子萌發(fā)的影響，得出低溫干燥貯藏為最適合的貯藏方式。

根據(jù)種子特征和貯藏目的，貯藏方法一般可分為干藏和濕藏。大多數(shù)針、闊葉樹種的種子均采用干藏法進(jìn)行短期(如秋采冬貯春播)貯藏。長(zhǎng)期貯藏大量種子一般采用低溫冷藏或者超干燥貯藏。此外，種子低溫庫多采用液氮保存，以最大程度地延長(zhǎng)種子壽命而不產(chǎn)生遺傳變異。濕藏一般適用于含水量高的種子，如殼斗科、七葉樹、核桃、油茶等樹種。而且一般情況下濕藏還可以逐漸解除種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)[9]。這種現(xiàn)象在一些凍土地帶植物[10-11]和許多溫帶植物[12]中都被觀察到，但也有研究表明，低溫濕藏會(huì)降低種子萌發(fā)能力[13]。

青岡屬植物為常綠闊葉珍貴用材樹種，目前研究較多的為青岡櫟和赤皮青岡，其主要繁殖方式仍為播種繁殖。青岡屬種子一般在每年11月份成熟，需要貯藏4～5個(gè)月才能播種。種子不經(jīng)歷成熟脫水，脫落時(shí)含水量相對(duì)較高，不耐干燥。種子貯藏過程中，因貯藏條件如溫度、水分的變化，將會(huì)引起種子內(nèi)部物質(zhì)變化，從而影響種子質(zhì)量和生活力。前人對(duì)青岡櫟的貯藏方法進(jìn)行了一些研究，陳彥君等[14]采用濕藏與干藏兩種方法進(jìn)行貯藏，通過對(duì)比發(fā)芽率及各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，認(rèn)為濕藏有利于提高青岡櫟種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。彭穎姝等[15]認(rèn)為低溫沙藏后青岡櫟種子透氣性增加，種子發(fā)芽率高于常溫沙藏。目前尚未有對(duì)青岡屬多個(gè)樹種貯藏特性的對(duì)比，也未見對(duì)不同貯藏方式下種子生活力變化的報(bào)道。為了解青岡屬種子在不同方式貯藏過程中含水量及生活力變化，以及含水量和生活力之間的關(guān)系，本試驗(yàn)采用4種貯藏方法，測(cè)定120 d內(nèi)不同樹種含水量和生活力變化，探討其貯藏特性，為青岡屬種子采后貯藏提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

當(dāng)年采集青岡屬植物種子，包括青岡櫟(Cyclobalanopsisglauca)、小葉青岡(Cyclobalanopsismyrsinaefolia)、細(xì)葉青岡(Cyclobalanopsisgracilis)、赤皮青岡(Cyclobalanopsisgilva)、曼青岡(Cyclobalanopsisoxyodon)、多脈青岡(Cyclobalanopsismultinervis)和云山青岡(Cyclobalanopsissessilifolia)，挑選飽滿、無病蟲害、大小一致的種子，洗凈晾干。

1.2 種子形態(tài)測(cè)定

1.2.1種子百粒重

先將種子混合均勻，用四分法隨機(jī)取樣，取100粒種子，用電子天平稱重，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2種子外部形態(tài)

隨機(jī)抽取10粒種子(一級(jí)種子)，用游標(biāo)卡尺測(cè)種子橫徑、種子縱徑、種臍寬度種殼厚度等形態(tài)指標(biāo)，并計(jì)算種子的長(zhǎng)寬比(縱徑/橫徑)。

1.3 含水量及生活力測(cè)定

種子用以下4種方法貯藏：室內(nèi)常溫貯藏(干藏)，室內(nèi)常溫濕沙貯藏，5 ℃冷藏(干藏)，5 ℃濕沙貯藏，沙濕度20%。分別在貯藏0 d，10 d，20 d，30 d，45 d，60 d，90 d，120 d后測(cè)定種子含水率和生活力。

1.3.1種子含水量測(cè)定

參照GB 2772-1999 林木種子檢驗(yàn)規(guī)程[16]中測(cè)定種子含水量的方法。大粒種子(每千克少于5 000粒)以及種皮堅(jiān)硬的種子，先將種粒切成小片。粒徑≥15 mm的種子切成4片或5片，切片動(dòng)作要快。用直徑≥8 cm的樣品盒，提前烘干并稱重(M1)。將切好的種子(10 g左右)放入樣品盒中，稱量樣品盒和鮮重(M2)。放入烘箱中，先用70 ℃烘4 h后，然后再(103±1)℃烘4～5 h，烘至恒重，稱量樣品盒和干重(M3)。

種子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%。

每個(gè)樹種重復(fù)3次，求平均值。

路面的經(jīng)過一段時(shí)間的反復(fù)使用之后，檢測(cè)該路面是否出現(xiàn)裂痕是判斷該路面是否需要進(jìn)行路面養(yǎng)護(hù)的一大前提。而同步碎石封層技術(shù)經(jīng)過了長(zhǎng)期的實(shí)踐檢測(cè)，顯現(xiàn)出路面抗裂性能高的特點(diǎn)，大大迎合了社會(huì)發(fā)展的需求。在以往的路面封層技術(shù)中，路面往往經(jīng)歷約3～5年左右就開始出現(xiàn)裂紋，而使用同步碎石封層技術(shù)養(yǎng)護(hù)過的路面是一般道路養(yǎng)護(hù)壽命的2～5倍，極大的增強(qiáng)了道路的使用壽命[2]。

1.3.2種子生活力測(cè)定

以曼青岡種子為試驗(yàn)材料，選用TTC和MTT兩種染色劑，染色溫度設(shè)置2個(gè)梯度(25 ℃和30 ℃)，染色時(shí)間設(shè)置3個(gè)梯度(6 h，12 h和24 h)。篩選出生活力測(cè)定最佳方法。

浸種、切取胚方：將青岡種子溫水浸種24 h后，剝?nèi)スず头N皮，切取0.5～1 cm2包括胚根、胚軸及部分子葉的方塊，切好的方塊先放入盛有清水或墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，待全部剝完后一起放入TTC溶液中。

顯色：將處理好的20個(gè)胚方置于燒杯中，根據(jù)篩選出的最佳染色劑、染色時(shí)間和染色溫度加入染色劑，以剛好浸沒胚方為宜，于恒溫光照培養(yǎng)箱中黑暗染色。另取經(jīng)相同方式處理得到的胚方，于沸水中煮10 min，再加入染色劑中置于相同的恒溫條件下染色4 h。

統(tǒng)計(jì)：染色結(jié)束后立即進(jìn)行鑒定，因放置太久會(huì)褪色。倒出TTC溶液，用清水將胚方?jīng)_洗2次，擺放在鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，保持濕潤(rùn)。觀察胚方被染色情況，按GB 2772-1999《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》測(cè)定方法分別測(cè)定不同種源種子的生活力。每個(gè)處理15粒種子，重復(fù)3次，取平均值。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design

2 結(jié)果與分析

2.1 種子外部形態(tài)分析

表2 不同樹種種子形態(tài)指標(biāo)Table 2 Comparison of seed morphological indexes among different tree species

2.2 不同貯藏方式對(duì)種子含水量的影響

貯藏方式和貯藏時(shí)間會(huì)對(duì)種子的含水量造成影響。圖1顯示，7個(gè)樹種種子的初始含水量都比較高，均在39%以上，其中曼青岡和細(xì)葉青岡含水量最高，分別為47.80%和46.25%，云山青岡和赤皮青岡含水量最低，分別為39.37%和40%。種子的初始含水量從高到低依次為曼青岡、細(xì)葉青岡、多脈青岡、青岡櫟、小葉青岡、赤皮青岡、云山青岡。7個(gè)樹種的種子在不同貯藏方式下含水量變化趨勢(shì)類似。在5 ℃沙藏條件下，所有樹種的種子含水量下降平緩，且下降幅度很小，貯藏120 d后含水量均保持在34%以上,曼青岡仍然最高，為42.58%。青岡櫟、細(xì)葉青岡、曼青岡、云山青岡種子在常溫沙藏和5 ℃冷藏條件下含水量變化趨勢(shì)相似，貯藏120 d后，4種植物種子含水量均在20%以上。小葉青岡、赤皮青岡和多脈青岡3個(gè)樹種在5 ℃干藏條件下含水量下降比較平緩，但是在常溫沙藏條件下，貯藏60～90 d含水量驟降，90 d以后含水量又趨于平緩。7個(gè)樹種在常溫貯藏條件下，種子失水最快且最明顯。青岡櫟、細(xì)葉青岡、曼青岡和多脈青岡常溫貯藏10 d內(nèi)含水量下降最明顯，尤其是曼青岡和多脈青岡，10 d后種子含水量下降了50%左右，30 d后種子含水量下降到15%以下。30 d以后含水量變化趨于平緩，120 d時(shí)含水量降至5%左右。小葉青岡、赤皮青岡和云山青岡常溫貯藏30 d后含水量下降最明顯，尤其是小葉青岡，貯藏30 d時(shí)含水量降至8.89%，30 d后含水量變化趨于平緩，120 d時(shí)含水量降至5%左右。

由此看出，在5 ℃沙藏條件下貯藏120 d，種子含水量保持得最穩(wěn)定，大部分樹種的種子幾乎沒有失水現(xiàn)象。在5 ℃干藏條件下貯藏120 d，種子含水量曲線下降平緩，最終含水量可以保持在27%以上。在常溫沙藏條件下貯藏120 d，種子在貯藏60 d后含水量下降比較明顯，最終含水量除多脈青岡外均保持在20%以上。在常溫條件下貯藏120 d，種子失水最快最嚴(yán)重，在貯藏60 d后所有樹種種子含水量降至10%以下，小葉青岡和云山青岡在貯藏30 d后含水量已降至8%左右，貯藏120 d后所有樹種種子含水量?jī)H為5%左右。因此，青岡屬植物種子采種后可采用5 ℃沙藏方式進(jìn)行貯藏，以保證種子的含水量。

2.3 不同貯藏方式對(duì)種子生活力的影響

2.3.1生活力測(cè)定方法的篩選

TTC染色法是林木種子生活力檢測(cè)常用的方法，除此之外，MTT染色法應(yīng)用也比較廣泛。通過對(duì)比不同染色劑濃度、染色溫度和染色時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在將胚方全部滅活后(T0、M0)，M0處理的種子仍有個(gè)別被染色，說明被滅活的種子仍然有被MTT染色的可能，因此MTT染色對(duì)于檢測(cè)青岡屬種子生活力存在一定的不準(zhǔn)確性。盡管在M1和M2處理下種子染色效果很好，但是仍然不適合作為檢測(cè)青岡屬種子生活力的最佳方法。T0處理的種子全部未染色，說明滅活的種子不能被TTC染色，TTC對(duì)青岡屬種子生活力檢測(cè)準(zhǔn)確性較高，因此可以作為檢測(cè)青岡屬種子生活力的方法。

對(duì)比T1和T2處理，可以看出在30 ℃條件下進(jìn)行染色，顏色比25 ℃條件下深，染色效果更好。對(duì)比T2、T3和T4處理，發(fā)現(xiàn)染色24 h效果最好，種子全部被染色且顏色明顯；染色12 h后，有部分種子染色，部分種子顏色不明顯，顏色較淺；染色6 h后紅色最淺，不容易分辨。對(duì)比T2和T5，發(fā)現(xiàn)0.5%和1.0%的TCC染色24 h后均能使所有種子顏色變紅，但是高濃度的TTC染色效果更好。因此選用T2處理對(duì)種子生活力進(jìn)行測(cè)定。

2.3.2不同貯藏方式下種子生活力變化

由圖2看出，不同貯藏方式對(duì)青岡屬種子生活力影響差異顯著。7種青岡屬植物在5 ℃沙藏條件下，種子生活力持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，在貯藏120 d后生活力均在80%以上，其中青岡櫟、小葉青岡、細(xì)葉青岡的生活力一直穩(wěn)定在100%。7種青岡屬植物在常溫貯藏條件下，種子生活力持續(xù)時(shí)間最短，在貯藏20 d后所有種子均無活力。

圖2 不同貯藏方式下7種青岡屬種子生活力的變化Fig.2 Changes of vitality in 7 species of Cyclobalanopsis seeds under different storage methods

表3 不同處理下種子染色情況Table 3 Comparison of seed dyeing under different treatments

不同樹種在5 ℃冷藏和常溫沙藏條件下種子生活力變化不盡相同。前20 d內(nèi)青岡櫟在常溫沙藏和5 ℃冷藏條件下種子生活力均為100%，30～90 d常溫沙藏種子生活力驟降，最終降至0；5 ℃冷藏條件下貯藏45 d時(shí)種子生活力降至66.67%，45～120 d緩慢下降，最終為50%。小葉青岡在5 ℃冷藏和常溫沙藏條件下生活力變化趨勢(shì)相似，最終生活力分別為50%和33.33%。細(xì)葉青岡和云山青岡情況相似，在5 ℃冷藏和常溫沙藏條件下生活力均是緩慢下降，最終生活力都在20%以上。赤皮青岡在常溫沙藏條件下，貯藏60 d生活力仍能達(dá)到100%，但后期生活力迅速下降，120 d時(shí)生活力僅為16.67%。曼青岡和多脈青岡生活力變化曲線相似，在常溫沙藏條件下，貯藏45～60 d后生活力仍能達(dá)到100%，但后期生活力迅速下降，最終降為0；5 ℃干藏條件下，生活力逐步下降，最終分別降為16.67%和0。

3 討論與結(jié)論

以種子的脫水耐性評(píng)價(jià)種子的貯藏生理行為已被廣大種子生物學(xué)家認(rèn)可[17]。其中頑拗性種子因不耐脫水而被稱為脫水敏感性種子[18]。Hong和Ellis[19]認(rèn)為，千粒重超過1 300 g的種子極有可能是頑拗性種子。就種子大小而言, 頑拗性種子的二維尺度多數(shù)介于6 mm×5 mm和43 mm×42 mm之間[20]。本研究中青岡屬種子的千粒重均在1 300 g以上，種子大小均在16 mm×11 mm以上，從種子形態(tài)來看，青岡屬種子應(yīng)屬于頑拗性種子。

研究發(fā)現(xiàn)，正常性種子可大量失水，甚至可脫水至5%而不發(fā)生明顯的傷害，中間性種子可脫水至7%～12%，而頑拗性種子不能經(jīng)受嚴(yán)重的脫水[21]。本研究中幾種青岡屬植物的初始含水量均在40%左右，在干藏條件下，伴隨著種子含水量的降低，種子活力也在下降。在常溫干藏條件下種子含水量下降速度較快，貯藏20 d時(shí)，盡管大部分種子含水量仍保持在14%以上，有的甚至在25%以上，但是種子已經(jīng)完全喪失活力。在低溫干藏條件下，盡管種子含水量的下降速度很緩慢，但種子貯藏30 d后仍然出現(xiàn)了活力快速下降的現(xiàn)象。說明干燥脫水直接導(dǎo)致青岡屬種子劣變而降低了活力。因此，本研究中的幾種青岡屬種子屬于脫水敏感性種子，不適合進(jìn)行干藏。從中還可以看出，低溫條件下，種子生活力的變化是一個(gè)逐漸下降的過程，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，種子生活力逐步降低，且在貯藏120 d內(nèi)，沒有出現(xiàn)所有種子均喪失活力的現(xiàn)象，即使是低溫干藏，仍然會(huì)有部分種子能保持活性。而在常溫條件下，種子生活力是一個(gè)急劇變化的過程，常溫貯藏時(shí)隨著種子含水量的下降，種子活力迅速下降；常溫沙藏時(shí)，盡管貯藏前期種子仍能保持較高的活力，但是后期活力迅速下降。因此常溫貯藏不適合青岡屬種子的長(zhǎng)期保存。

除了對(duì)脫水敏感外, 頑拗性種子通常易受低溫傷害。大多數(shù)頑拗性種子對(duì)零上低溫比較敏感。蘇鐵種子在4 ℃中層積6個(gè)月或24周后依然能保持很高的活力，表明蘇鐵種子有較強(qiáng)的耐受零上低溫的能力[22]。也有研究表明，櫟屬等溫帶性植物所產(chǎn)生的頑拗性種子在2 ℃下冷藏8個(gè)月后仍能萌發(fā)[20]。張俊炎[23]認(rèn)為赤皮青岡屬于頑拗性種子，在整個(gè)生長(zhǎng)過程以及脫落母體后，始終保持對(duì)脫水的敏感性。成熟脫落時(shí)代謝相對(duì)活躍，脫離母體后的生長(zhǎng)狀態(tài)不斷變化，因此種子采收后需要通過嚴(yán)格的保存機(jī)制來維持其活力。這與本研究的結(jié)果一致。本研究中青岡屬種子在低溫沙藏條件下貯藏120 d后，種子含水量能保持在36%以上，生活力仍然能保持在80%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他貯藏方式。 而且低溫沙藏對(duì)打破青岡屬種子休眠也有一定的促進(jìn)作用。因此，對(duì)于本研究中的青岡屬種子來說，低溫沙藏相較于其他方法，最適合種子播種前的保存。