不同成熟度玉米種子生理特性與種子活力的關(guān)系分析

王偉杰， 陳保國， 張遠航， 馬 平， 馮萬軍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

種子活力是種子具有的潛在萌發(fā)及耐貯藏的能力。高活力種子發(fā)芽迅速、出苗整齊、成苗率高，即使在高溫、干旱等逆境條件下也可以保證苗全、苗壯和作物的田間密度[1]。目前，玉米單粒播種技術(shù)已經(jīng)普及，高活力的種子是保證出苗率的基礎(chǔ)，有助于發(fā)揮玉米的生長態(tài)勢與產(chǎn)量潛力[2]。因此，種子活力是玉米生產(chǎn)過程中重要指標之一。迄今，已有多種有關(guān)種子活力檢測的方法，歸納起來可大致分為直接法和間接法兩類[3]。

種子成熟度是影響種子活力的重要因素[4]。研究發(fā)現(xiàn)，不同玉米品種授粉后35～49 d間收獲的玉米種子干物質(zhì)不再增加，基本達到生理成熟，發(fā)芽率均在90%以上。另有報道指出，玉米種子活力形成于種子生長發(fā)育的早期，如對授粉后15 d的玉米種子胚進行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，60%以上的種胚已具備發(fā)芽能力[5]，但種子活力形成的關(guān)鍵時期應(yīng)在種子的脫水階段[6]。種子活力的形成與糖類、蛋白質(zhì)和脂肪等化學(xué)組分的代謝密切相關(guān)。在種子萌發(fā)過程中，這些貯藏物質(zhì)被降解為小分子物質(zhì)以滿足種子萌發(fā)過程中對物質(zhì)和能量的需求，同時起到維持滲透平衡的作用[7-8]。

植物內(nèi)源激素是調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的重要因子。脫落酸(ABA)是種子休眠的主要誘導(dǎo)物和保護物[9]，過度積累會導(dǎo)致種子高度休眠[10]；而赤霉素(GA3)能夠打破種子因ABA 含量過高引起的休眠[11]；細胞分裂素(CTK)在種子萌發(fā)中與脫落酸具有拮抗作用，CTK 可以逆轉(zhuǎn)ABA 對種子萌發(fā)的抑制作用[12]，也可以與GA3互作誘導(dǎo)α-淀粉酶表達從而促進種子萌發(fā)[13]；生長素(IAA)正向調(diào)控ABA和負向調(diào)控GA3的生物合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14-15]，從而抑制種子萌發(fā)。

目前，有關(guān)糖類、蛋白質(zhì)、氮素在不同成熟度的玉米種子中如何積累，以及各種激素含量在不同成熟度種子的萌發(fā)過程中發(fā)揮何種作用尚不清楚。因此，本研究在測定玉米自交系JNY 6 F不同成熟度種子中的可溶性糖、總氮含量的基礎(chǔ)上，進一步利用標準發(fā)芽試驗分析不同成熟度玉米種子活力差異以及萌動種子胚中的激素含量等生理特性變化，以期明確玉米種子生理特性與活力之間的關(guān)系，旨在為種子活力形成的生理機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以自主選育玉米自交系JNY 6 F為試驗材料，于2020年4月底在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站種植，種植行距0.5 m，密度4 500株/667 m2。在玉米吐絲前，選長勢一致的植株將雌穗套袋，隨后所有雌穗在同一天完成授粉。自授粉后20 d開始，每5 d 選取授粉充分的果穗。為了排除營養(yǎng)分配差異，手動剝離各果穗中部籽粒100粒。以3個果穗的籽?；旌献鳛?次重復(fù)，共3次重復(fù)用于生物量測定；另外5個果穗的籽?；旌献鳛?次重復(fù)，共3次重復(fù)，經(jīng)自然晾曬干燥后用于后續(xù)種子活力分析。

1.2 生物量測定

收獲的新鮮種子稱重后，置于烘箱在120 ℃下滅活30 min，80 ℃下烘干至重量恒定，根據(jù)公式計算種子水分含量和含水率。

含水量(mg)=(鮮重-干重)/種子數(shù)目;

含水率(%)=[(鮮重-干重)/鮮重]×100%。

1.3 生理特性測定

從自然干燥的不同成熟度種子中，每重復(fù)取50粒，共3次重復(fù)，洗凈后加入去離子水250 mL，浸泡24 h后用DDSJ-308 A型電導(dǎo)儀測定材料浸泡液電導(dǎo)率[16]。將自然干燥后的干種子磨碎，每重復(fù)取0.5 g，共3次重復(fù)，用80%乙醇對可溶性糖進行提取，采用經(jīng)典蒽酮比色法對可溶性總糖測定[17]，采用3,5-二硝基水楊酸法進行可溶性還原糖測定[17]；采用H2SO4-H2O2靛酚藍比色法測定N素含量[18]。計算蛋白質(zhì)含量。

蛋白質(zhì)含量=全N含量×F，式中，F(xiàn)為蛋白系數(shù)。

1.4 標準發(fā)芽試驗

參照國家種子檢驗規(guī)程，從自然干燥的種子中取出100粒，用卷紙法置于光照培養(yǎng)箱，每日光照12 h/黑暗12 h處理，恒溫 25 ℃條件下發(fā)芽，3次重復(fù)，每天統(tǒng)計發(fā)芽情況，第3天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第7天統(tǒng)計發(fā)芽率，第7天統(tǒng)計發(fā)芽率后在各重復(fù)中選取具有代表性的10株正常幼苗，分別測其幼苗鮮重和干重，并計算各萌發(fā)指標及活力指數(shù)。

發(fā)芽勢(%)=(第3天發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽試驗樣品粒數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽試驗樣品粒數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)，Gt為發(fā)芽試驗終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)；

活力指數(shù)(VI)=GI×S，S為正常幼苗的單株干重。

1.5 內(nèi)源激素含量測定

使用上海酶聯(lián)公司生產(chǎn)的試劑盒(ml 147100、ml 020295、ml 062451和ml 064270)，參照說明，對不同成熟度玉米種子吸脹12 h后的種子胚中的IAA、CTK、GA3和ABA等4種激素分別進行檢測，3次重復(fù)。

注：圖A為不同成熟度玉米種子的外觀形態(tài)；圖B為不同成熟度玉米種子的干重、鮮重變化；圖C為不同成熟度玉米種子的含水量及含水率變化；圖上不同小寫字母表示差異顯著p<0.05。圖1 不同成熟度玉米種子性狀變化Fig.1 Traits changes of maize seeds with different maturity degree

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)；用DPS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，LSD(Least-Significant Difference)最小顯著性差異法在0.05和0.01概率水平確定各平均值間的差異顯著性，分析結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示；用R語言中的cor、cor.mtest和corrplot函數(shù)分別對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析、顯著性檢驗和繪圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同成熟度玉米種子生物量及水分含量變化

在授粉后35 d，JNY 6 F種子基部出現(xiàn)黑色層(圖1 A)，此時種子達到生理成熟，種子鮮重也達到最大值，為351.29 mg，但是此后干物質(zhì)仍在積累，在最后一次收獲時干重為230.20 mg(圖1 B)。另外，在授粉后20～35 d，是干物質(zhì)積累的快速時期，單個種子的干重從82.07 mg增加至202.96 mg，共提高了147%，平均每天增加8.06 mg(圖1 B)。待種子生理成熟后，生物量雖仍在積累，但增長速率較緩慢，45 d相比于35 d僅增加了27.24 mg，平均每天增加2.72 mg(圖1 B)。與之對應(yīng)，在授粉后20～35 d，單個種子絕對含水量緩慢降低，從162.91 mg降至148.33 mg，降幅在9%，而授粉后35～45 d，單個種子絕對含水量急劇減少，最終含水量降低了64%，種子含水率從70%左右降至20%左右(圖1 C)。

2.2 不同成熟度干燥玉米種子的生理特性變化

在玉米自交系JNY 6 F不同成熟度收獲后經(jīng)自然干燥的種子中，可溶性總糖含量呈先快速增長后緩慢降低的變化趨勢，而可溶性還原糖和總蛋白質(zhì)含量則呈先快速生長后趨于穩(wěn)定的變化(表1)。由表1可見，授粉后20～35 d的種子收獲后經(jīng)自然干燥處理，其體內(nèi)的可溶性總糖和可溶性還原糖的含量分別從4.24 mg和1.65 mg增至9.13 mg和4.60 mg，分別提高了150%和179%，平均每天積累量為0.33 mg和0.20 mg，但在授粉后45 d的種子收獲后經(jīng)自然干燥處理，其體內(nèi)的可溶性總糖和可溶性還原糖的含量則分別降低了9%和提高了7%，平均每天積累量分別為-0.08 mg和0.03 mg。與之不同，單粒種子的總蛋白含量是在授粉后20～30 d的干種子中快速增長變化，從8.40 mg增加至20.33 mg，增加了142%，平均每天增加1.19 mg，而在授粉后30～45 d的干種子中，單粒種子中的總蛋白含量僅增加了19%，平均每天積累量僅為0.26 mg。

表1 不同成熟度干燥種子中生理指標測定結(jié)果Table 1 Measurement results of physiological indexes in dried seeds of different maturity degree

2.3 不同成熟度干燥玉米種子的活力差異比較

發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是反映種子活力的重要指標。發(fā)芽率可以反映種子的萌發(fā)能力，發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)可以反映出種子的發(fā)芽快慢，活力指數(shù)不僅可以反映發(fā)芽快慢而且還可以反映幼苗長勢。通過發(fā)芽試驗研究發(fā)現(xiàn)，玉米自交系JNY 6 F授粉后20 d的種子已具備發(fā)芽能力，發(fā)芽率在44%左右，但是其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均最低，分別在36%、37和0.6左右，而授粉后25 d的種子發(fā)芽率已在90%以上，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)也提高了2倍或2倍以上(表2)，說明授粉后20～25 d可能是種子活力形成的關(guān)鍵時期。此后，不同成熟度干燥種子的發(fā)芽率基本維持在98%～100%之間，但發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)以授粉后35 d的干燥種子為最大，分別在93.33%和107.73，而活力指數(shù)則以授粉后45 d的干燥種子為最大，為4.01(表2)。

表2 不同成熟度干燥玉米種子活力指標及電導(dǎo)率統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Statistical results of seed vigor index and electrical conductivity of dried maize with different maturity degree

種子浸泡液的電導(dǎo)率是檢測種子活力的有效指標，電導(dǎo)率可以反映種子萌發(fā)初期細胞膜重建和損傷修復(fù)能力，因此電導(dǎo)率與活力指數(shù)呈負相關(guān)關(guān)系[19]。通過對不同成熟度干燥玉米種子的電導(dǎo)率測定發(fā)現(xiàn)，隨著收獲時間的推移，電導(dǎo)率呈逐漸下降的變化趨勢，在授粉后20～45 d間電導(dǎo)率從88 μS/(cm·g)降低至27 μS/(cm·g)，降低了69.3%(表2)，這與前人研究結(jié)果吻合，說明越晚收獲的種子經(jīng)干燥后，其細胞完整性越高，破損率越低。

2.4 不同成熟度干燥玉米種子胚內(nèi)源激素含量

植物的內(nèi)源激素對種子萌發(fā)具有重要影響。測定結(jié)果顯示，在吸脹12 h 的單個種子胚中，GA3、ABA、CTK和IAA等4 種內(nèi)源激素含量基本呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律，均在授粉后35 d 達到最大值，分別達8.93、18.3、15.72 ng和1.14 ng，相比于授粉后20 d的種子胚，分別提高了206%、174%、232%和141%。但此后收獲的單個玉米種子的萌動胚中，在授粉后35～45 d間，除GA3含量小幅降低外(6%)，而ABA、CTK和IAA的含量均有大幅度降低，分別降低了48%、39%和46%。

2.5 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，不同成熟度干燥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等4個種子活力指標均與電導(dǎo)率呈極顯著的負相關(guān)關(guān)系，再次印證電導(dǎo)率可以作為檢測種子活力的有效指標。另外，發(fā)芽勢與種子干重和單個胚的GA3、單個胚的CTK、可溶性總糖含量、可溶性還原糖和總蛋白質(zhì)含量均顯著或極顯著相關(guān)，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與除總蛋白質(zhì)含量外的其余5個性狀呈顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，而活力指數(shù)則與除單個胚的CTK含量外的其余5個性狀顯著或極顯著相關(guān)(圖2)。據(jù)此推測，種子中積累的干物質(zhì)、GA3、可溶性糖、可溶性還原糖等物質(zhì)均具有促進種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成的作用，而積累的蛋白質(zhì)僅在種子萌發(fā)后幼苗建成的過程中發(fā)揮促進作用，而CTK僅在種子萌發(fā)過程中起正向作用。

表3 不同成熟度干燥種子吸脹12 h后單個種子胚內(nèi)源激素含量測定結(jié)果Table 3 Determination of endogenous hormone content in single embryo after 12 h of imbibition of dried seeds with different maturity degree

注：“*”和“**”分別表示p<0.05和p<0.01。圖2 不同成熟度干燥玉米種子活力指標與各個生理性狀的相關(guān)性Fig.2 Correlation between seed vigor index and physiological characteristics of dried maize with different maturity degree

3 討論與結(jié)論

霜凍會造成玉米種子活力大大降低，因此在確保種子活力的前提下提前采收，有助于減少霜凍對種子活力造成的影響。顧日良等[2]采用不同發(fā)芽方法對授粉后35～62 d的京科968雜交種種子活力分析發(fā)現(xiàn)，隨著收獲期的推遲，種子活力不斷上升，在授粉后59 d收獲的種子活力最高。邢妍妍等[5]研究表明，玉米種子活力形成于脫水階段，授粉后15 d的種子經(jīng)過干燥即具有萌發(fā)能力，發(fā)芽率在5%左右。但不同基因型玉米種子活力的最大值與種子生理狀態(tài)的關(guān)系并無明確關(guān)系，一般是雜交玉米種子的活力在生理成熟之前最高，而玉米自交系種子活力多在生理成熟之后達到最大值[20]。在本研究中，玉米自交系JNY 6 F授粉后20 d的種子，經(jīng)自然干燥后，44%已具備發(fā)芽能力，這與前人關(guān)于種子活力形成于種子生長發(fā)育早期的結(jié)論相吻合。另外，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)以授粉后35 d的種子為最大，此時種子基部出現(xiàn)黑色層，干物質(zhì)積累也基本停滯，因此基本生理成熟，而活力指數(shù)以授粉后45 d的種子為最高，這些研究結(jié)果基本與前人研究結(jié)果相符。

種子萌發(fā)和幼苗生長需要大量的能量和營養(yǎng)。在種子萌發(fā)過程中，種子體內(nèi)貯藏的干物質(zhì)被降解為小分子物質(zhì)以維持體內(nèi)滲透平衡以及提供幼苗形態(tài)建成所需的物質(zhì)和能量[21]。可溶性糖具有保護膜透性的作用[22]，其中單糖(Monosaccharides)和棉子糖(Raffinose)與種子活力密切相關(guān)，在加速老化處理后，兩種可溶性糖含量顯著降低，而種子活力也隨之下降[23]。可溶性糖是優(yōu)先被代謝的糖類，可為種子萌動初期提供能力和代謝產(chǎn)物。因此，可溶性糖含量高的種子會受到更為良好的保護，而且在萌動初期有更為充足的能量來源。本研究發(fā)現(xiàn)，JNY 6 F不同成熟度種子經(jīng)自然干燥后，其體內(nèi)的可溶性總糖含量以授粉后35 d的種子為最高，而可溶性還原糖積累量在此后仍在緩慢增加，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩類糖的含量均與發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等4個種子活力指標顯著或極顯著相關(guān)，這與前人研究結(jié)果相吻合。蛋白質(zhì)是有機體的重要組成物質(zhì)。蛋白質(zhì)的損傷與修復(fù)過程對種子活力和壽命有重要影響[24]。研究發(fā)現(xiàn)，籽粒中的蛋白質(zhì)含量與植株干重極顯著正相關(guān)，可以作為檢測種子活力的有效指標[25]。在本研究中，不同成熟度干燥種子的發(fā)芽勢和活力指數(shù)與體內(nèi)總蛋白含量顯著或極顯著相關(guān)，而發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)則與之無明顯相關(guān)性，說明蛋白質(zhì)對種子萌發(fā)后幼苗的生長起促進作用，即促進幼苗生物量的積累，而與萌發(fā)快慢無關(guān)，這與前人提出的玉米籽粒中的蛋白質(zhì)含量與植株干重極顯著正相關(guān)的結(jié)論相印證。

研究表明，ABA的積累會造成種子休眠[10]，而GA3可以打破ABA積累造成的種子休眠[11]。另外，IAA可以通過調(diào)控ABA與GA3的合成通路來抑制種子萌發(fā)[14-15]，而CTK與GA3相似，與ABA具有拮抗作用，并且可以促進GA3誘導(dǎo)水解酶的產(chǎn)生[12]，從而促進種子萌發(fā)。然而，也有報道指出，一些激素在種子萌發(fā)過程中存在劑量效應(yīng)，如低濃度IAA對種子萌發(fā)具有促進作用，高濃度IAA具有抑制作用[26-28]；低濃度CTK對種子萌發(fā)具有促進作用，高濃度CTK具有抑制作用[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然授粉后35 d收獲的種子吸脹12 h后的單個種胚內(nèi)的ABA、GA3、CTK和IAA含量均達到最大值，但相關(guān)性分析結(jié)果顯示，僅GA3含量與發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等4項種子活力指標極顯著正相關(guān)，CTK含量除活力指數(shù)外的3個種子活力指標顯著正相關(guān)，而ABA含量和IAA含量與4個種子活力指標存在正相關(guān)關(guān)系但未達到顯著水平。據(jù)此推測，GA3與種子萌發(fā)和幼苗生長均有關(guān)系，CTK則主要在種子萌發(fā)過程中發(fā)揮作用，而ABA和IAA在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中也有一定作用，但這些作用的發(fā)揮可能是各種激素間相互作用的結(jié)果，并且還可能存在劑量效應(yīng)，有待進一步研究。